全 文 ：小菜蛾 CYP6基因序列分析及其进化地位探讨
李洪山1, 2 王娟1 戴华国1
( 1南京农业大学植物保护学院,南京 210095; 2江苏省盐城市农业科学院,盐城 224002)
摘 要: 利用简并引物和特异性引物, 通过 RT-PCR 和 RACE 技术, 克隆出了一个小菜蛾细胞色素 P450
CYP6 基因。该基因全长 1661bp, 编码区在 26~ 1 570 位, 翻译 514 个氨基酸, GenBank 登录号为 AY971374。分析
该基因在昆虫 CYP6 基因家族系谱树中的位置和 5c-UTR 的序列,可以认为, 小菜蛾 CYP6基因与同为鳞翅目的其
他昆虫进化地位相当,而明显与相对低等的蜚蠊目昆虫的同家族基因亲缘关系远。
关键词: 小菜蛾 细胞色素 P450 CYP6 基因 进化地位
Sequence Analysis of Cytochrome p450 Gene from the Diamondback
Moth, Plutella Xylostel la( Lepidoptera: YponomEutidae)
and its Evolution Status
Li Hongshan
1, 2 Wang Juan1 Dai Huaguo1
( 1 Col l ege of Plant p rote ction, N anj ing A g ri cul tur al Unive rsi ty , N anj in g 210095;
2 Yancheng Academy of A g ri cul tu ral S ci ence s, Yanch eng 224002)
Abstract: A novel cDNA clong encoding a cy tochrome P450 w as screened fr om the insecticides susceptible
st rain of P lutella x y lostella( L . ) . by using the RT-PCR and RACE technical. The cDNA is 1661bp in length and
conta ins an open reading f rame f rom 26 t o 1570bp, encoding a protein of 517 amino acid r esidues. The GenBank Ac-
cession number is AY971374. Compareing the dndrogr am o f cy tochrome P450s fr om insect CYP6 family and t he nu-
cleo tides o f 5c-UTR, it is concluded that the evo lutionar y lev el o f the CYP6 is similar to those fr om moth and butter-
flies. And is far to that fr om Blattella g ermanica.
Key words: Plutel la x y lostel la( L . ) Cyto chr ome p450 CYP6 Evo lutionaey
细胞色素 P450基因是一个古老的基因超家族, 它们起源于一共同祖先,存在于 35亿年以前,时间尚早
于药物、动植物相互作用、有机物燃烧的出现 [ 1]。
至今已报道 P450 基因序列有 1 000多个, 至少分属于281个家族,在已知的昆虫细胞色素 P450基因家
族中以 CYP6家族与杀虫剂抗性和对植物次生物质代谢的关系较为密切。CYP6家族是昆虫特异性的家
族,拥有众多的亚家族及其成员和等位基因变异体,这种不同层次上的多样性是其进化的证据之一, 研究昆
虫 CYP6家族成员分子进化机制对理解其多样性形成的原因以及其参与杀虫剂抗性的分子机理具有极其重
要的意义,同时也为生物进化理论提供依据。
根据昆虫的细胞色素 p450基因的简并引物 [ 2] ,通过 RT-PCR 技术从小菜蛾敏感品系中克隆出 CYP6
家族成员 cDNA 片段, 再根据此片段,运用 cDNA 末端快速扩增方法( RACE) , 获得 CYP6基因的全长 cD-
NA 序列,并运用 PC/ GENE 软件分析其在 5-非翻译区( U TR) DNA 序列及编码区氨基酸残基相似性, 建立
系谱树,以探讨小菜蛾 CYP6基因的进化地位和 CYP6家族的分子进化机制。
收稿日期: 2005-04-26
基金项目:福建省自然科学基金重点项目(编号: B0320003 )
作者简介:李洪山( 1965- ) ,男,江苏盐城人,副研究员,博士生,主要从事害虫综合治理研究, E-mail: lhs158@126. com
通讯作者:戴华国, E-m ail : daihg@ njau. edu . cn
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
1 材料与方法
1. 1 昆虫
小菜蛾 Plutel la x y lostel la ( L . )敏感品系,为湖北省武汉市蔬菜研究所提供, 在南京农业大学养虫室内
未接触任何药剂的条件下饲养。饲料为油菜苗,饲养温度20 ? 1 e ,光周期: 16L8D。选取3龄末幼虫用于提
取 RNA。
1. 2 主要试剂和仪器
TRIzol Reagent试剂盒为 Inv it ro gen公司产品; DNA 纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒为北京莱博生
物实验材料研究所生产; pGEM-T Easy Vector、M-MLV 和限制性内切酶 EcoR I均为 Promega 公司产品;
BD SMART RACE cDNA Amplificat ion Kit由 Clontech 生产; PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合
成;琼脂糖、RN ase、DEPC、IPT G、X-Gall均为南京赛吉公司进口分装产品。PCR扩增仪为 Pecrkin Elmer-
PE9600(美国)。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 总 RNA提取 选取小菜蛾敏感品系 3龄幼虫 5 只, 用手动匀浆器匀浆, 利用 T RIzo l Reagent试剂
盒进行抽提、纯化(具体操作步骤见试剂盒说明书)。提取的小菜蛾总 RNA 用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳, 在
Beckman DU-7000型紫外分光光度计上检测纯度和浓度,最后置于-20 e 下备用。
1. 3. 2 引物设计 根据文献( Kasai S, 1998. )上的简并性引物[ 2] , 去掉 EcoR I 酶切位点,确定上游引物 A
5c-CGGA( A/ G) AC( A/ G/ C/ T ) ( A/ C/ T ) ( C/ T ) ( A/ G/ C/ T ) ( A/ C) G( A/ G/ C/ T ) AA ( A/ G) TA ( T / C) CC-
3c, 下游引物 B 5c- CGGG( A/ G/ C/ T ) CC( A/ G/ C/ T ) ( G/ T ) C( A/ G/ C/ T ) CC( A/ G) AA( A/ G/ C/ T ) GG-3c
根据由简并性引物 RT-PCR获得的 cDN A片段,设计其特异性引物:
5c-GAGAGAT TT ACAAAGACT ACACGCT CC-3c(上游引物 A1)
5c-CCGT CCCCAAAGGGCAAGTAGGTAT-3c(下游引物 B1)
1. 3. 3 cDNA 片段第一链合成和 PCR扩增 第一链合成是先将 5Ll 总 RNA 和 2Ll Oligo( dT ) 18 ( 500Ll /
ml)混匀, 在70 e 下水浴 5min, 0 e 冰浴 10m in。之后再在体系中分别加入 5Ll buffer ( 5 @ ) , 5Ll d NTP ( 2. 5
mM ) , 1Ll RNase ( 40U/ Ll ) , 1Ll M-MLV ( 200 U /Ll )和 6Ll 去离子水。在 PCR 仪中 42 e 60min, 95 e
5min, 4 e 冷却。
PCR扩增反应体系中含模板 c DNA 2Ll, 10 @ buffer 5Ll, 25 mM M gCl24Ll, 2. 5mM d NT P 4Ll,上游引
物 a1和下游引物 b1各 3Ll, 5U/LlT aq DNA 多聚酶 1Ll。反应条件是 95 e 2min, 94 e 40sec, 50 e 50sec,之
后每循环的退火温度降 1 e , 5个循环后再以 94 e 30s, 45 e 30s, 72 e 1min, 循环 30次, 72 e 延伸 5min, 4 e 冷
却,同时设不加模板的阴性对照体系。
1. 3. 4 cDNA 末端快速扩增方法 按照试剂盒要求进行。
1. 3. 5 PCR产物的克隆与测序 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离和 DNA 纯化回收试剂盒纯化后,连接
于 pGEM-T Easy 载体上, 转化到感受态大肠杆菌中。通过蓝白斑筛选,挑取白斑进行扩大培养, 提取质粒,
用限制性内切酶 EcoR I分析,排除假阳性,选取阳性克隆进行送上海博亚生物技术有限公司测序。
1. 3. 6 序列分析 用 Gene explo re等软件将所得 cDNA 核苷酸序列翻译成氨基酸序列, 在网站 ht tp: / /
www . ncbi. nlm. nih. go v/ BLAST/进行同源性分析。并与其他已知昆虫的 CYP6基因家族成员一起构建
系谱树,分析其在 5-非翻译区( UT R) DNA序列及编码区氨基酸残基相似性,分析小菜蛾 CYP6基因的进化
地位和 CYP6家族的分子进化机制。
2 结果
2. 1 小菜蛾 CYP6全长序列分析
通过简并性引物 RT-PCR, 获得一个小菜蛾 240bp cDNA 片段, 编码 79个氨基酸,通过网上 BLAST 比
472005年第 4期 李洪山等: 小菜蛾 CYP6基因序列分析及其进化地位探讨
较分析,该片段与其他昆虫的 CYP6基因家族有较高的同源性。如与鳞翅目昆虫 D ep r essar ia pastinacel la
的 CYP6AE1、H el icover pa armig era 的 CYP9A 14、Pap il io glaucus 的 CYP6B12 的同源性分别达 67%,
48%和 46%。证明是小菜蛾细胞色素 p450基因的片段。
利用特异性引物,通过 RACE技术, 克隆出 4个片段产物,其中 3c和 5c-RACE 产物各 2个,经过测序比
对,都是 p450基因片段,通过拼接,获得一个小菜蛾新的 p450基因全长 cDNA 序列, 并已经提交 GenBank,
命名为 CYP6 ( A Y971374)。该序列由 1661bp组成,编码区在 26~ 1 570位,翻译 514个氨基酸。5c-非翻译
区( U TR)碱基序列为 GCAGT TGGATAT T TCCACCGGTGCC, 编码区氨基酸序列为
MPYLDVAVALLAAFIAFTLWT NRRWNYWKKQNVKYLTPIPFLGNVADVIFQRDT FGAVT QRICQQFPDEA
VVGMFYCSNPAALVQCPDMLKT VM VKDYAYCSSKEVSVHSHKEPMTKNMFFTFGDKWKLIRQNLT PVYT S
AKMKNMFPLVQDCCRIFQKVLDDEIGKGRVVEVKSLIARYT MDCITSCAFGVDSGTMSKGEEGNPFTETG
HLLFDERPIAGVKNVLRYGYPSFFYSVGLELYSSKIYRFFRSVILDVINSRNGAKSSRNDMVDLISDWKK
NKYITGDSIDNGIDGGNKKVRIEVDDELLVSQCVLFFQAGFQPSALTSAYLLYELAKNQDIQERVLAEVD
EYWST RDEVQT DCVT ALPFLAQCMEESLRMYPPVSVLM REIYKDYTLPNGVH LKKGM MIHIPVYH LHHNP
KYFPEPEVFRPERFSEEGRKSIVPYTYLPFGDGPRMCIGYRFARLEIFSSLAVLLKKYRVELAPHM PRKL
QFLTTSRVLTSIH GIH LRLVDRVN。
图 1 P450基因系谱树
Plutella xylostella: CYP9G2、CYP6, Drosop hi la melanogaster: CYP6A8、
CYP6A9、CYP6A22、CYP6A13、CYP6D1、CYP6D2、CYP6G2、CYP6G1、CYP6U1、
CYP6V1、CYP6W1、CYP6T1, Blattel la germanica: CYP6J1、CYP6K1, Pap il io g lau-
cus: CYP6B3, H elicoverpa armigera : CYP6B2, Papi liop olyx enes: CYP6B1, Musca
domestica: CYP6A1, CYP12A1、CYP12A3, Mayetiola destructor: CYP6AZ1、
CYP6BA1, Homo sap iens : CYP3A4, : CYP4C1
2. 2 小菜蛾 CYP6基因与昆虫其他 CYP6基因
通过应用软件, 建立了 CYP6基因的系谱
树(图 1) , 和 5c-U TR 区 DNA 序列相似性比
较图(图 2)。
3 讨论
Nelson等( 1993) 认为细胞色素 p450 超
家族的祖先基因存在于 35亿年之前,与地球
上有细胞结构的生命存在的时期同步,在已经
构建了的细胞色素 P450的系谱发生树中显示
出了昆虫(节肢动物门,原口动物)的 CYP6家
族和 CYP9家族是从 CYP3中分支出来的,与
哺乳动物(脊椎动物门, 后口动物) CYP3 和
CYP5家族的亲缘关系较近,可能在后口动物
与原口动物分化之前就已存在的同一祖
先[ 3, 4]。
本实验结果所获得的 1 个 CYP6基因全
长 cDNA 序列来自昆虫 B laber us di scoidal is
: CYP4C1, Musca domesti ca: CYP12A1、
CYP12A3的亲缘关系要远, 但与其他昆虫
CYP6基因亲缘关系很近, 与来自H omo sap i-
ens : CYP3A4 亲缘关系是近 于 CYP4 或
CYP12家族,而远于 CYP6 家族, 这系谱树结
果佐证了上述推论, 也证明了实验结果所获得
的 1个全长 cDNA 序列是 CYP6基因家族中的一分子。
昆虫种类, 从低等到高等一般分为 33个目,昆虫体内的细胞色素P450基因进化也应该有着同步进化趋
48 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
势,在上述系谱树中可以见到,相对低等的蜚蠊目的 B lattel la germanica: CYP6J1、CYP6K1基因就与哺乳
动物 H omo sap iens : CYP3A4亲缘关系近, 其次才是鳞翅目和双翅目的 CYP6基因,本实验小菜蛾 CYP6基
因与鳞翅目的 Pap i l io glaucus : CYP6B3, H elicoverp a armiger a: CYP6B2, 和 Pap i lio p oly x enes:
CYP6B1的亲缘关系很近,符合事实。
图 2 5c- UTR区 DNA序列相似性
A nop heles minimus : CYP6P6, H e li cov erp a z ea : CYP4M6, CYP6B28, P lu tel la x ylost el la : CYP6, A ed es a lbop i ctu s :
CYP6N3V1-3
已知哺乳动物 CYP3家族是通过基因复制而变异进化的, 大约在 11亿年前, CYP3家族从其它具有药
物代谢功能的 P450家族中分化出来[ 5] , 约在 3~ 7亿年前, 昆虫 CYP6家族从 CYP3 家族中分化出来。因
此,在进化上可部分解释昆虫众多 P450家族中 CYP6家族与杀虫剂抗性具有较为密切的关系。
生物基因组进化的一种重要方式是基因重复,作为生物体信息载体, 基因序列的 5c-UT R(非翻译区)在
维持物种特性稳定方面起着重要的作用,但是也是生物体内基因发生多样性的因素之一,通过与已经报道的
CYP6N3的等位基因 5c-U TR的序列比较 [ 6, 7] 以及与其他 CYP6基因 5c-UT R的比对,可以认为, CYP6N3
等位基因是通过整个基因座复制形成的。基因重复是 p450基因遗传多样化的主要原因之一,重复的基因通
过自然选择而被固定下来,形成了多基因家族,并表现出了广泛的多样性。
参 考 文 献
1 冷欣夫, 邱星辉,编著.细胞色素P450酶系的结构功能与应用前景.北京:科学出版社, 2001: 1~ 248.
2 Kasai S , Shono T. Insect Moleu cular Biology, 1998, 7( 2) : 185~ 190.
3 Nels on DR, St robel HW . M ol Biol Evol, 1987: 4( 6) : 572
4 Nels on DR, Kamataki T , et al. DNA Cell Biology, 1993, 12: 1~ 51.
5 Nels on DR. Coparat ive Biochem hysiol, 1998, 121: 15~ 21.
6 周国理,黄炯裂,等. 寄生虫与医学昆虫学报, 2000, 7( 4) : 247~ 253.
7 周国理,黄炯烈,等. 中山医科大学学报, 2000, 21( 1) : 1~ 6.
# 国外动态#
利用 GM烟草生产了宫颈癌疫苗
AgBio tech Repo rter 2004年 21卷 4期 7页报道: [南非]开普敦大学的科学家, 目前正在利用人乳头状
瘤病毒衣壳转基因( GM )烟草,来生产可防治子宫颈癌的疫苗。认为这种疫苗可以抑制人乳头状瘤病毒。
汪开治
492005年第 4期 李洪山等: 小菜蛾 CYP6基因序列分析及其进化地位探讨