全 文 ：结果相似。王如峰等采用的是水蒸汽蒸馏法 ,挥发
油得率仅为 0.026%,且没有检测到石榴酸的存在 。
本实验所采用的超临界 CO2萃取方法是公认的油
脂类物质提取较为完全的方法 ,出油率为 9.26%,
也未检测到石榴酸的存在 。赵云荣等 〔6〕使用的方
法虽然与陈业高等采用的方法相同 ,但石榴酸相对
含量分别为 1.56%和 81.62%,差别之大出乎意料 。
实验材料的品种 、产地 、成熟度 、贮存时间等的不同
很可能是造成这种差别的主要原因。国外 Melgare-
jo〔13〕和 Fadavi〔14〕对石榴种子油的研究文章以及 E-
phraim等〔15〕对石榴应用的综述性文章也表明 ,石榴
籽的化学成分随不同的品种 、产地等有较大的变化 。
因此 ,在石榴籽作为药材使用时 ,应该充分考虑其质
量控制的条件和标准 。
参 考 文 献
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(2007-05-22收稿)
基金项目:贵州省科委基金(E2001-4)作者简介:吴宁(1974-),女 ,硕士 ,研究方向:中草药对细胞色素 P450的影响;Tel:0851-6908068, E-mail:wuninggy@126.com。
·药理 ·
漏芦对大鼠肝细胞 CYP3A1酶活性
及其 mRNA表达的影响
吴　宁 1 ,雷霆雯 1 ,李红梅1 ,吴青青 1 ,唐良华 2
(1.贵阳医学院生物化学与分子生物学教研室 ,贵州贵阳 550004;2.贵阳中医学院 ,贵州贵阳 550002)
　　摘要　目的:研究漏芦对大鼠肝细胞细胞色素 P4503A1(CYP3A1)酶活性及其 mRNA表达水平的影响。方法:
以大鼠原代肝细胞为研究对象 ,漏芦实验组分别加入不同浓度(15.6, 31.2, 62.4 mg/ml)药物处理 48 h,用红霉素
N-脱甲基酶(erythromycinN-demethylase, ERD)活性反映 CYP3A1酶活性;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测
定药物作用前后酶基因 mRNA表达的相对水平变化。结果:漏芦作用后 , CYP3A1酶活性及相应 mRNA的表达呈
浓度依赖性抑制。药物在 15.6, 31.2, 62.4 mg/ml浓度下对 CYP3A1酶活性的抑制率分别为 26.4%, 44.2%,
65.4%;对 CYP3A1mRNA表达水平的抑制率分别为 29.4%, 49.8%, 56.0%。结论:漏芦浓度依赖性抑制 CYP3A1
酶活性 , 在转录水平下调大鼠肝细胞 CYP3A1的表达。
关键词　细胞色素 P4503A1;酶活性;RT-PCR;漏芦
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)11-1403-04
1403中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.11.024
EffectsofRhaponticumuniflorumonActivityandmRNAExpression
ofCYP3A1 inRatsHepatocytes
WUNing1 , LEITing-wen1 , LIHong-mei, WUQing-qing1 , TANGLiang-hua2
(1.Bio-chemistry＆MolecularBiologyTeachingandResearchSection, GuiyangMedicalColege, Guiyang550004, China;2.Guiy-
angColegeofTraditionalChineseMedicine, Guiyang550002, China)
Abstract　Objective:TostudyeffectsofRhaponticumuniflorumontheactivitiesandmRNAexpressionofcytochromeP4503A1
inratshepatocytes.Methods:RathepatocytessandwichculturesweretreatedbyRhaponticumuniflorumindiferentconcentrations
(15.6, 31.2, 62.4 mg/ml)for48hours.TheenzymicactivitiesofCYP3A1werereflectedbytheactivitiesoflivermicrosomalerythro-
mycineN-demethylase(ERD).ThelevelchangeinthemRNAexpressionweretestedbyRT-PCR.Results:Aftertreatmentwiththe
medicine, therewasconcentration-dependentinhibitioninbothenzymicactivityandmRNAlevelofCYP3A1 comparedwiththecon-
trol.TheratesoftheinhibitoryeffecttoCYP3A1 activitywere26.4%, 44.2% and65.4% respectively, whilethoseoftheinhibitory
effecttomRNAlevelwere29.4%, 49.8% and56.0%.Conclusion:RhaponticumunifloruminhibitstheenzymicactivityofCYP3A1
andlowersCYP3A1 expressionatthetranscriptivelevels.
Keywords　CYP3A1;Enzymicactivity;Reversetranscriptase-polymerasechainreaction;Rhaponticumuniflorum(L.)DC.
　　祁州漏芦为菊科植物 Rhaponticumuniflorum
(L.)DC.的根 ,始载于 《神农本草经》 ,列为上品 。
其主要成分为挥发油 ,具有清热解毒 、消肿排脓等功
效 。在临床上漏芦是一味常见中药 ,常与其它药物
合用治疗疾病。目前漏芦对肝脏药物代谢酶有无影
响未见报道 ,为了深入探讨可能产生的药物相互作
用 ,本文研究了漏芦对与药物代谢有关的细胞色素
P450酶系(cytochromeP450, CYP450)中 CYP3A1活
性的改变 ,并通过 RT-PCR了解酶活性改变的机理。
1 　材料与方法
1.1 　材料
1.1.1　实验动物:Wistar大鼠(贵阳医学院实验动
物管理中心),雌雄不限 , 180 ～ 200g。
1.1.2　药品与试剂:祁州漏芦(购于贵阳市药材公
司 ,采自吉林省长白山 ,经贵阳医学院药学院鉴定为
真品);标准胎牛血清 , DMEM培养基(美国 Gibco公
司);Percol, Trypsin1∶250(华美生物工程公司);鼠
尾胶 , Ⅰ 、Ⅱ型胶原酶 , 红霉素 , Trizol试剂 , Oligo
(dT)16 ,焦炭酸二乙脂(DEPC), RNA酶抑制剂 , M-
MLV逆转录酶 , PCR扩增试剂(上海生工生物工程
技术服务有限公司 );烟胺腺嘌呤磷酸二核酸
(NADP,美国 AMRESCO公司), 6-磷酸葡萄糖二钠
(美国 Sigma公司 ), 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 (美国
Worthington公司);其他化学试剂均为分析纯 。
1.1.3　RT-PCR引物:由上海生工生物工程技术服
务有限公司合成。 CYP3A1引物:上游 5 -ATC-
CGATATGGAGATCAC-3 下游 5 -GAAGAAGTCCT-
TGTCTGC-3 , PCR产物片段长度 579 bp;内对照
(β-actin)引物:上游 5 -GCCCAGAGCAAGACAGG-
TAT-3 下游 5 -GGCCATCTCCTGCTCGAAGT-3 ,
PCR产物片段长度 513bp。
1.2　方法
1.2.1 　肝细胞分离和培养:采用两步胶原酶灌注
法〔1〕和 “胶原蛋白凝胶三明治”培养 〔2〕 ,稍加改动。
取禁食过夜 Wistar大鼠在无菌状态下打开腹腔 ,经
门静脉插管 ,先以流速为 30 ml/minD-Hanks液(含
0.5 mmol/LEDTA)开放灌注 ,待肝脏变为土黄色
后 ,改用 37℃、0.05%的胶原酶溶液 (30 ml),以 15
ml/min速度进行循环灌流 ,约 10min后可见包膜下
的肝组织龟背状裂开 ,逐渐放慢灌流速度 ,继续灌注
5 ～ 10min后停止灌注 ,收集肝细胞悬液 。过滤肝细
胞悬液 ,低速离心(800 r/min, 5 min),清洗肝细胞 3
次以去除胶原酶。加入 90%Percol及等量的培养
液以 1000r/min离心 3 min去除死细胞 ,再以 800
r/min离心 3次以清洗肝细胞 ,用台盼蓝染色法计
算细胞活率 ,鉴定细胞活率 80%以上。将肝细胞接
种在预先包被有Ⅰ型胶原的培养瓶上 ,细胞贴壁后
弃去培养基 ,在其表面添加一层胶原蛋白 , 37℃温孵
约 2 h,待第二层胶原蛋白凝胶形成后再加培养基继
续培养。
1.2.2　药物制备:取 100g粉状的漏芦加入 800ml
双蒸水 ,浸泡 15min,煎煮 40min,过滤 ,滤渣再加入
500 ml双蒸水继续煎煮 40 min,过滤 ,合并 2次滤
液 ,浓缩至 100 ml, 3000 r/min离心 15 min,取上清
液(相当于 1 g生药 /ml),用微孔滤器过滤除菌 ,分
装后 4℃冰箱保存备用 。
1.2.3 　实验分组及药物作用:分为低 、中 、高药物
浓度组(按生药总量计算),药物分别按 1∶64, 1∶32,
1∶16倍稀释(用含 3%胎牛血清的 DMEM稀释),使
其终浓度分别为 15.6, 31.2, 62.4 mg/ml,每组设 6
个复孔;另设对照组 1个 , 加入含 3%胎牛血清的
DMEM培养液。将新鲜分离出的肝细胞以 2×105
1404 中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月
个 /cm2接种于 6孔培养板上 ,细胞培养 24 h后 ,实
验组分别加入不同稀释浓度漏芦 ,对照组加入等容
积含 3%胎牛血清的 DMEM于细胞孵育体系中继续
培养 48 h,收集肝细胞进行酶学分析和 RT-PCR。
1.2.4　CYP3A1活性测定:超声细胞粉碎仪破碎
细胞制备匀浆 ,钙沉淀法制备微粒体 〔3〕 ,通过测定
红霉素 N-脱甲基酶(ERD)活性反映 CYP3A1酶活
性的大小〔4〕。
1.2.5　大鼠肝细胞总 RNA提取及完整性的鉴定:
按上海生工公司 Trizol试剂说明书提供的方法提取
肝细胞总 RNA,紫外分光光度法测定 RNA纯度 ,电
泳鉴定总 RNA的完整性。
1.2.6　逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR):按 M-
MLVReverseTranscriptase说明书逆转录合成第一
链互补脱氧核糖核酸(cDNA),然后通过特异性引
物 PCR扩增大鼠肝细胞中的 CYP3A1和内对照 β-
actin基因。引物的设计和 PCR扩增反应参照文
献 〔5〕 ,稍加改动。总体系 25μl,预变性 94℃ 5 min,
变性 94℃ 30s,退火 56℃ 1min,延伸 72℃ 1 min,终
末延伸 72℃ 7 min, 30个循环 。 PCR产物经 2%琼
脂糖凝胶分离并与 DNAMarker(标准分子量)比较
鉴定 ,在凝胶成像分析系统照相观察结果并记录 。
计算 CYP3A1基因与 β -actin基因扩增条带表达量
像素灰度的比值 ,并以此比值作为 P450酶基因 mR-
NA表达的相对水平指标。
1.3 　统计学分析　所有数据用( x±s)表示 ,采用
SPSS10.0专业统计软件进行数据分析处理。用方
差分析进行多组数据间的比较 , 用最小显著差法
(LSD)进行不同药物浓度组与空白组间比较。
2 　结果
2.1　肝细胞形态学观察　原代培养的肝细胞在 12
h可见 80%以上的细胞牢固粘附于胶原基质上且细
胞形态完整分散度好 , 24 h可见大量的细胞生长 ,
细胞呈三角形 、方形或类圆形 ,排列整齐 ,细胞界限
清晰 ,细胞浆为颗粒状 ,丰富透亮 。细胞核有单核 、
双核。部分细胞呈多边形展开 ,有些细胞开始呈岛
状连接 。见图 1。
2.2 　漏芦对大鼠肝细胞 CYP3A1酶活性的影响　
与对照组相比 ,低 、中 、高浓度药物组 CYP3A1酶活
性差异有统计学意义(P<0.05),均明显受到抑制 ,
且呈浓度依赖性 ,抑制率分别为 26.4%, 44.2%,
65.4%。见表 1。
2.3 　CYP3A1基因的 RT-PCR结果
2.3.1　不同浓度药物组 RT-PCR电泳图:见图 2。
2.3.2　不同浓度药物组对 CYP3A1mRNA表达的
图 1　培养 12 h的大鼠肝细胞(倒置显微镜 ×150)
　表 1　　　　　漏芦对大鼠肝细胞 CYP3A1酶
活性的影响( x±s, n=8)
组别 药物浓度(mg/ml) CYP3A1/nmol/min/mg
对照组 - 0.69±0.09　
低浓度组 15.6 0.51±0.08＊
中浓度组 31.2 0.38±0.06＊
高浓度组 62.4 0.24±0.06＊
　　注:与对照组相比 , ＊P<0.05。下表皆同
影响:各实验组 CYP3A1 mRNA表达水平和对照组
比较 ,差异有统计学意义(P<0.05),均明显受到抑
制 ,且呈浓度依赖性 ,药物在低 、中 、高药物浓度组对
CYP3A1 mRNA表达水平抑制率分别为 29.4%,
49.8%, 56.0%。见表 2。
　表 2　　　　漏芦对大鼠肝细胞 CYP3A1mRNA
表达的影响( x±s, n=8)
组别 药物浓度(mg/ml) CYP3A1/β-Actin
对照组 - 1.53±0.04　
低浓度组 15.6 1.08±0.01＊
中浓度组 31.2 0.77±0.02＊
高浓度组 62.4 0.67±0.01＊
3　讨论
中草药虽然成分复杂 ,但药效的物质基础大多
数经过 CYP450酶代谢 ,或对 CYP450酶产生诱导或
产生抑制 ,从而影响其它药物的代谢 ,产生药物相互
作用 。从 CYP450角度研究中草药有利于揭示中药
之间或中药与西药产生相互作用的关系 〔6〕。
CYP450是一类结构和功能相关的超家族基因
编码的同工酶 ,其主要位于肝微粒体中 ,在生物体内
外源性化合物的代谢中发挥重要作用。 CYP3A是
CYP450亚型中的重要成分 。哺乳动物 CYP3A家族
组 成 的 成 员 有 CYP3A1、 CYP3A3、 CYP3A4、
CYP3A5、CYP3A7, 序列有较大的同源性 , CYP3A1
亚型是大鼠肝脏 CYP3A亚族中的主要同工酶 。
1405中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月
图 2　大鼠肝细胞 CYP3A1RT-PCR电泳图
M:100bpDNAMarket, 1:β-actin, 2:CYP3A1
CYP3A家族的酶担负了最广泛的药物代谢 ,临床上
约有 60%的药物经 CYP3A代谢。是参与口服药物
首过效应的主要酶系 ,从而在药物的代谢过程中起
重要作用〔7、8〕。体内外研究表明 , CYP3A酶活性可
因某些药物影响发生改变 ,或被诱导 ,或被抑制 。研
究药物对 CYP3A的诱导与抑制是探索药物相互作
用的重要内容。本实验显示:低 、中 、高漏芦药物浓
度组 CYP3A1酶活性及相应 mRNA的表达水平和
对照组比较 ,差异均有显著的统计学意义 ,且呈浓度
依赖性抑制 。结果表明:漏芦抑制 CYP3A1酶活性
的机理可能是通过抑制 CYP3A1基因 mRNA表达
水平 ,减少酶蛋白合成 ,从而降低酶活性。漏芦对
CYP3A活性的抑制提示漏芦在与通过 CY3A代谢
的药物合用时 ,尤其长期大剂量使用可能造成药物
相互作用 ,引起这些药物在体内代谢减慢 ,药物蓄积
引起中毒 ,故在临床用药时应注意漏芦的合理运用 。
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