全 文 :第26卷 第2期
2014年2月
Vol. 26, No. 2
Feb., 2014
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号:1004-0374(2014)02-0181-07
G蛋白偶联受体与G蛋白相互作用的最新研究进展
姜云璐1,2,龚 磊2,白 波2*,陈 京2,3*
(1 曲阜师范大学生命科学学院,曲阜 273165;2 济宁医学院神经生物学研究所,
济宁 272000;3 英国华威大学华威医学院,考文垂 999020,英国)
摘 要:传统观念认为,在激动剂作用下,G蛋白偶联受体 (GPCRs)能够激活 G蛋白的 α亚基,从而使
Gα亚基与 Gβγ亚基分离,被激活的 Gα亚基通过信号转导进一步参与细胞的生理过程。但是,最新研究发
现 GPCRs和 G蛋白存在多种偶联关系,GPCRs不仅能够激活 Gα亚基,还可以与 Gβγ亚基相互靠近,甚
至会使 G蛋白亚基构象发生重排而不分离,这对于疾病发病机制的研究及新的药物靶点的发现具有重要意
义。就 GPCRs与 G蛋白之间的相互作用以及最新研究技术作一简要综述。
关键词:G蛋白偶联受体;G蛋白;荧光共振能量转移;生物发光共振能量转移;全内反射荧光显微镜
中图分类号:Q516 文献标志码:A
Advances in the research of interaction between
G protein-coupled receptors and G proteins
JIANG Yun-Lu1,2, GONG Lei2, BAI Bo2*, CHEN Jing2,3*
(1 Department of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273165, China; 2 Department of Neurobiology, Jining
Medical University, Jining 272000, China; 3 Warwick Medical School, University of Warwick, Coventry 999020, UK)
Abstract: The interaction of G protein-coupled receptors (GPCRs) and G protein is an important part of signal
transduction. Traditionally, GPCRs are able to activate Gα subunit following agonist stimulation, resulting in the
dissociation of Gα subunit and Gβγ subunit. Activated Gα then participates in the physiological processes of cells.
However, recent researches reveal there are multiple coupling relationships between GPCRs and G protein. GPCRs
can interact with different subtypes of Gα and get close to Gβγ subunit. Even more, it was reported that activation
of some heterotrimeric G proteins may trigger subunit rearrangement instead of dissociation of subunits, which is of
great significance for researching the pathogenesis of disease and discovering new drug targets. In this paper, we
review the interaction between GPCRs and G protein and the last research techniques.
Key words: G protein-coupled receptors; G protein; fluorescence resonance energy transfer; bioluminescence
resonance energy transfer; total internal reflection fluorescence microscope
收稿日期:2013-06-29; 修回日期:2013-08-31
基金项目:国家自然科学基金项目(3097108,3127-
1243,81070961,81241052);山东省自然科学基金项
目(ZR2011CM027,2012GSF11806);泰山学者建设专
项资金
*通信作者:E-mail: bbai@mail.jnmc.edu.cn;Tel: 0537-
3616002(白波);E-mail: chenjnmc@163.com(陈京)
G蛋白偶联受体 (G protein coupled receptors,
GPCRs)是迄今发现的最大的膜蛋白受体超家族之
一,能够对胞外的信号产生应答,并将其转化为胞
内信号,广泛参与人体内多种生理功能,如心血管
系统、神经系统、免疫系统与内分泌系统等,是重
要的药物靶点 [1-3]。传统模式认为,在激动剂的作
用下,GPCRs构象改变 (图 1 A-B),暴露 G蛋白的
结合位点,在鸟苷酸转换因子的协助下,将 Gα亚
基上 GDP替换为 GTP,并促使 Gα亚基与 Gβγ亚
基分离 [1]。Gα-GTP可致第二信使分子 (如 cAMP、
IP3、DAG、Ca
2+等 )大量生成,进而激活蛋白激酶
A (protein kinase A, PKA)、蛋白激酶 C (protein kinase
DOI: 10.13376/j.cbls/2014027
∙ 评述与综述 ∙
生命科学 第26卷182
C, PKC)等多种下游信号分子 [4-5]。当 Gα亚基再次
与 GDP结合时,即处于失活状态,随之会与 Gβγ
亚基结合,抑制信号转导。活化的GPCRs通过脱敏、
内化到细胞内,被降解或再循环到细胞表面继续介
导新的信号级联反应 [6]。因此,明确 GPCRs依赖
G蛋白的信号转导途径至关重要。在过去的研究中,
人们将大量的精力集中于对 GPCRs和 Gα相互作用
的研究,而忽略了 Gβγ;随着对 GPCRs活化机制
研究的不断深入和一些新型技术的出现,如荧光共
振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer,
FRET)、生物发光共振能量转移 (bioluminescence
resonance energy transfer, BRET)及全内反射荧光显
微镜 (total internal reflection fluorescence microscope,
TIRF)技术等,GPCRs和 G蛋白各个亚基的相互
作用得到了进一步详细的研究。本实验室也利用这
些技术证实了除传统模式外,GPCRs活化后与
Gβγ亚基相互靠近,甚至会使 G蛋白各亚基间更
加紧密,发生构象重排而不发生分离,这有利于揭
示相关疾病发生的分子机理,探寻相关疾病治疗的
新突破点,以及为新药开发提供理论依据。因此,
本文基于 G蛋白介导的 GPCRs的信号转导途径,
就 GPCRs与 G蛋白偶联的作用机制以及研究技术
作一简要综述。
早在 20世纪 60至 70年代,随着放射性配体
结合实验的运用,使得 G蛋白偶联受体的概念逐渐
成熟 [7]。经过人们不断的努力, Lefkowitz等 [8]于
1980年提出配体 -受体 -G蛋白三元复合体模型,
这一模型的提出为 GPCRs领域开辟了新的研究视
野。而几乎与此同时,Orly和 Schramm[9]提出了受
体与 G蛋白“碰撞偶联”的学说。这一学说认为,
受体与 G蛋白在细胞膜上自由分布,当受体活化以
后作用于相对应的 G蛋白。随后发现,GPCRs种
类繁多,并且 G蛋白也有众多亚型,那么活化的受
体是怎样迅速、准确、直接地作用于相关联的 G蛋
白,人们对此提出了质疑。随后的几年里,Neubig
等 [10]提出了“预偶联”学说,这在一定程度上合
理解释了信号转导的特异性,但依然存在着不足。
新型技术的发展 (如前所述 ),使得实时监测活细
胞内大分子物质的动态变化成为现实。目前,这些
技术已经成熟地运用于活细胞内蛋白质之间的相互
作用、受体活化及活化的 G蛋白的构象变化等领域,
同时也大大促进了 GPCRs与 G蛋白偶联的相互作
用机制的研究。
1 GPCRs激活G蛋白的信号转导模式
1.1 GPCRs选择性地激活不同亚型Gα亚基
除了上述传统模式以外,GPCRs 也可以通
过其他模式激活 G蛋白。近几年,研究发现部分
A-B:配体激活GPCRs后,使其空间构象发生改变,尤其是
第3、6个跨膜螺旋区域;C-D:不同的配体结合GPCRs,激
活不同亚型的G蛋白;E-F:配体与受体结合以后,GPCRs
激活Gα亚基,与Gβγ亚基相互靠近;G-H:活化的G蛋白伴
随着α亚基上GDP被GTP的替代,Gα-GTP与Gβγ亚基分离,
部分活化的G蛋白可呈现各亚基构象重排而不是彼此分离。
图1 GPCRs与G蛋白相互作用模式图
姜云璐,等:G蛋白偶联受体与G蛋白相互作用的最新研究进展第2期 183
GPCRs激活后能够选择性地与不同亚型的 Gα蛋
白相结合,从而激活相应的信号途径 (图 1 C-D)。
例如,利用不同激动剂刺激毒蕈碱乙酰胆碱受体
(muscarinic acetylcholine receptor, M-AChR)会激活
不同亚型的 G蛋白。当卡可林 (carbachol)作用于
M-AChR时,能同时激活 Gαq与 Gαs介导的胞内反
应,而匹罗卡品 (pilocarpine)作用于此受体时,则
只能激活由 Gαq介导的磷脂酶 C (phospholipase C,
PLC)信号途径,而不能激活Gαs介导的信号途径
[11]。
此外,在研究 δ- 阿片受体 (delta opioid receptor,
DOR)与感觉神经元特异性受体 (sensory neuron-
specific receptor, SNSR-4)时,发现 DOR与 SNSR-4
的二聚体偏向性地作用于 Gαq的级联反应,而不能
激活 Gαi下游信号途径。
1.2 GPCRs与Gβγ亚基相互靠近
GPCRs不仅能够选择性激活不同类型的 Gα亚
基,研究发现活化的 GPCRs的第三个胞内环与
Gβγ亚基彼此靠近 (图 1 E-F)。过去人们认为,只
有 G蛋白的 α亚基才能传递信息,Gβγ二聚体只发
挥稳定 Gα亚基的作用,不会引起下游级联反应。
Hein等 [12]和 Hommers 等 [13]研究发现,在共表达
标记黄色荧光蛋白的 α2A-肾上腺素受体 (α2A-AR-
YFP)、Gαi1、标记青色荧光蛋白的 Gβ1γ2 (Gβ1γ2-CFP)
的 HEK293细胞中,当给予去甲肾上腺素 (norepinep-
hrine, NE)刺激,FRET信号随着 NE浓度的升高而
增强;而在表达有 YFP空载体、Gαi1、Gβ1γ2-CFP
的 HEK293细胞中,给予相同的刺激,却检测不到
任何 FRET信号,证实 α2A-AR被激活后与 Gβ1γ2亚
基之间的距离是缩短的,即 α2A-AR与 Gβ1γ2亚基在
活化时彼此靠近。然而,当用百日咳毒素 (pertussis
toxin, PTX)预处理表达有 α2A-AR-YFP、Gαi1、Gβ1γ2-
CFP 的 HEK293的细胞时 (PTX 阻断 Gαi 亚基上
ADP与 ATP的交换,使 Gαi失活 ),给予 NE刺激后,
由 Gβγ亚基介导的 GIRK (G protein-coupled inwardly
rectifying potassium)完全失活,但仍然能检测到
FRET信号,这表明失活的 Gαi亚基不与 Gβγ亚基
分离,Gβγ因未被激活而不能介导 GIRK通道,但
α2A-AR仍可与失活的 G蛋白三聚体发生相互作用,
从而检测到 FRET信号。值得关注的是,这一实验
现象与近期研究的同一个 G蛋白的 βγ和 α亚基相
继与活化的视紫红质偶联的现象 [14]相符合。受体
活化后与 Gβγ亚基相互靠近,彼此距离缩短,这是
否意味着受体与 Gβγ亚基也存在相互作用,有待进
一步研究。
1.3 异源三聚体G蛋白构象重排
近些年,随着 GPCRs与 G蛋白的偶联机制的
不断突破,G蛋白构象变化方面的研究也有了新发
现。传统上认为,G蛋白活化后,Gα亚基与 Gβγ
亚基发生完全分离 [1]。这一反应机制能够解释由
Gα亚基引起的下游信号,但却难以诠释由 Gβγ亚
基直接介导的信号途径 (如对 PTX敏感的受体多由
Gβγ亚基介导胞内反应 )。近年来证实,并不是所
有G蛋白活化以后Gα亚基都与Gβγ亚基相互分离。
Vilardaga等 [15]提出,Gαi1~3和 Gαz亚型的 G蛋白
活化后,其亚基之间并未相互分离,而是空间构象
发生了重排。与此同时,Bunemann 等 [16]也证实了
Gαs与 Gαi亚型的 G蛋白发生了空间构象的变化。
这些结果表明,细胞中 Gαi蛋白激活后可能引发亚
基重组而非完全解离,从而在理论上合理解释 Gα
亚基可引发某些 Gβγ-效应器介导的独特信号转导
途径 (图1 G-H)。本实验室利用BRET [17]和FRET (未
发表 )技术研究了 apelin受体 (APJ)信号转导过程,
发现 APJ能够激活 Gαi2与 Gαi3通路,但是 G蛋白
的活化机制与传统不同,G蛋白活化后 Gαi亚基与
Gβ1γ2亚基不但不分离,反而更加紧密。这一实验
现象打破了传统观念认为的活化的 G蛋白 Gα与
Gβγ相互分离的观念,提出了 APJ偶联 G蛋白机制
的新观点,也为研究由 APJ介导的某些生理学功能
(如神经保护功能等 )提供了新思路。
2 决定GPCRs偶联G蛋白类型的因素
胞内蛋白种类数不胜数,而 GPCRs能够准确
偶联并激活不同 G蛋白,从而介导下游信号级联反
应。例如,M1乙酰胆碱受体能同时偶联 Gαq和
Gα11,激活促进细胞增殖分化的有丝分裂原活化蛋
白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK)途
径,这与 GPCRs和 G蛋白的空间构象、偏向性配
体的类型等是密不可分的。如前所述,受体的空间
构象在很大程度上决定了与 G蛋白的偶联状况,而
配体的类型与受体间的相互作用却是影响受体空间
构象变化的主要因素。
2.1 配体诱导的受体构象多样性
根据配体对受体的作用功效,可将激动剂分为:
全效激动剂、部分激动剂、拮抗剂。全效激动剂与
部分激动剂可将受体从非活化状态转变为活化状
态,并偶联 G蛋白介导下游级联反应,而拮抗剂
却稳定受体的非活化状态。不同的配体能诱导受体
产生不同的空间构象,配体至少从三个方面影响受
生命科学 第26卷184
体的空间构象变化。(1)配体结合口袋的结构。
GPCRs的晶体结构显示,受体主要存在两种配体
结合口袋,其主要结合口袋是由跨膜螺旋区 III
(transmembrane helix III, TM3)、IV、V、VI、和 VII
形成的,而次要结合口袋是由跨膜螺旋 I、II、III
和 VII形成的 [18]。在研究偏向性配体时发现,TM2
上含有保守的脯氨酸,而它可能是决定配体偏向性
的因素 [18]。(2)受体中心区域的全面重排。比较 β2-
肾上腺素受体 (β2-AR)的活化构象与非活化构象的
变化,发现 TM5和 TM7重排,也可看到 TM6的
胞质端远离细胞膜 [19-20]。(3)受体胞内末端构象变化。
在研究精氨酸抗利尿激素受体 (V2 argininevaso-
pressin receptor, V2R)时发现,AVP (V2R的全效激
动剂 )不仅能改变 TM6的构象,激活 Gαs通路,且
能诱导 TM7-H8区域发生改变而募集 β-arrestin。
V2R的部分激动剂MCF14仅改变 TM6的构象,激
活 Gαs通路,而不影响 TM7-H8的空间构象
[21]。因
此,配体主要从配体结合口袋的不同、受体中心区
域的重排和受体胞内末端构象的变化来诱导受体构
象的多样性以选择性偶联 G蛋白,调节胞内的生理
信号途径。
2.2 受体间的相互作用
受体构象的变化不仅与配体的特性有关,也受
到受体间相互作用的影响。近年来通过应用原子力
显微镜 (atomic force microscopy)和共振能量转移技
术等,获得了许多有力的证据支持 GPCRs二聚或
高阶寡聚体的存在,并且二聚体或高阶寡聚体的形
成能够从构象上直接改变受体状态。受体构象的改
变一方面是由于二聚体或高阶寡聚体能够形成新的
结合口袋 [22],这种结合口袋能准确识别特定配体的
结合。例如,6-guanidinonaltrindole (6-GNTI)可作
用于 δ-阿片受体 (DOR)与 κ-阿片受体 (KOR)的二
聚体,从而发挥镇痛功效,而对任一单个受体无效。
此外,受体间的相互作用还能形成适合二价配体的
结合位点。MDAN-18是一种含有μ-阿片受体 (MOR)
激动剂 (羟吗啡酮 )与 DOR的拮抗剂 (NTI)的化合
物,是MOR-DOR二聚体的特异性的二价配体。研
究发现,当MDAN-18作用于MOR-DOR二聚体时,
能够产生比羟吗啡酮作用于MOR受体或 NTI作用
于 DOR受体更强的抗损害性。另一方面,受体的
相互作用能够通过变构调节改变受体的构象 [22]。采
用 FRET研究发现,二聚体形成的过程中,一个受
体构象的改变将会引发邻近受体状态发生改变,如
多巴胺受体 1 (dopamine receptor 1, D1)和多巴胺受
体 2 (D2)单体分别激活 Gαs与 Gαi信号途径 , 但形
成 D1-D2二聚体后,D1受体空间构象的变化对 D2
受体产生变构调节作用,使二聚体转向激活 Gαq/11
介导的信号途径。
2.3 G蛋白不同亚型之间的竞争
GPCRs的构象变化能够改变与 G蛋白的偶联
过程,种类繁多的 G蛋白同样能影响其与受体的相
互作用。虽然 G蛋白根据编码氨基酸序列同源性可
分为 Gαs、Gαi、Gαq、Gα12等众多亚型,但它们的
基因序列具有很强的保守性 [23]。研究表明,Gαq类
的 6个内含子在基因序列上的位置与 Gαi类相同,
且 Gαq类、Gαi类均有 3个与 Gαs类的基因序列相
同 (Gαq的 1、3、4,Gαi的 1、4、5与 Gαs的 1、6、
8)的内含子;Gαt1~2、Gαo和 Gαi1~3的所有内含子在
基因序列上的位置均相同,并且其基因编码区具有
相同的外显子 -内含子序列。这表明不同亚型的 G
蛋白存在相似的空间结构,因此,它们可能存在竞
争同一受体的能力,如在 HEK293细胞中,Gαi和
Gαq都可以与缓激肽 II受体结合,共同激活 Raf及
其后的 ERK/MAPK信号途径。此外,细胞内的其
他信号分子也会竞争性地作用于 GPCRs,如 β-arrestin
与 G蛋白在 GPCRs上具有相似的结合位点 (IL2、
IL3、CIL3),从而竞争性地与受体结合 [24],而这种
竞争的机制至今尚不明确,有待进一步研究。
3 研究GPCRs与G蛋白相互作用的新技术
研究 GPCRs与 G蛋白相互作用的传统技术包
括免疫共沉淀、免疫共定位、GST融合蛋白沉降等,
这些技术自身存在一定的不足,无法满足在生理条
件下检测受体或蛋白的相互作用。而 BRET、TIRF
及 FRET等相关技术的出现解决了这一难题,它们
可以实时、动态、连续地监测生理状态下受体 -受体、
受体 -G蛋白间的动力学关系,并且不会对细胞造
成损伤,这为受体与 G蛋白相互作用的动力学研究
提供了更加便利、准确的研究手段。
FRET是近年发展起来的用于研究蛋白质与蛋
白质之间相互作用的新技术,如能量供体与能量受
体之间的距离小于 10 nm,且供体的发射光谱与受
体的激发光谱存在重叠区域,当用适当的激发光激
发供体时,供体与受体之间会通过偶极 -偶极耦合
的作用发生非辐射的能量共振转移,从而实现
FRET检测 [25-26] (图 2A)。Frank等 [26]在研究 α-肾
上腺素受体 (α2A-AR)与 G蛋白相互作用关系时,
发现由 α2A-AR激活的 Gαi1的 B-C (αB/C)区域与 Gβ1γ2
姜云璐,等:G蛋白偶联受体与G蛋白相互作用的最新研究进展第2期 185
的 N末端相互靠近,而与 Gβ1γ2的 C末端彼此分离。
随后,他们利用 FRET技术证实了 Gαi1~3与 Gαz在
被 α2A-AR激活时,Gαi1~3及 Gαz与 Gβ1γ2亚基发生
构象重排,而 Gαo与 Gβ1γ2亚基彼此分离,进一步
实验证明 Gαi蛋白的 N末端区域 (AA1-99)与 αB/C
区域是引起 Gαi亚基重排的主要因素。
BRET技术是另一种利用非辐射的共振能量转
移来检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的技术 (图
2B)。该技术利用生物发光素酶催化底物发出的光
来激发荧光受体 (如绿色荧光蛋白 ),完成供体与
受体间的能量转移 [28-29]。Ayoub等 [30]运用 BRET
技术在研究蛋白酶激活受体 1 (protease-activated
receptor 1, PAR1)与异源三聚体 G蛋白的相互作用
关系时,发现 PAR1能够激活 Gαi1亚基,对 Gα12、
Gα13、Gαo亚基却几乎没有作用。利用时间分辨
FRET (time-resolved FRET,TR-FRET)技术研究 PAR1,
他们得出了与 BRET相一致的结果。由此推测,同
一受体对 G蛋白不同亚基的亲和力是不同的,它可
能选择性作用于某一个亚基。
虽然 FRET与 BRET技术在细胞分子机制的研
究方面具有传统技术无法比拟的优越性,也取得了
一定的成果,但技术本身依然存在不足。首先,能
量供体与能量受体的发射光谱有较大的重叠,因而
增加了串色导致假阳性的可能 [31]。其次,FRET与
BRET技术要求被监测的生物大分子本身没有内源
性的荧光基团可以作为供体或受体,如色氨酸残基
(Trp)[32]、血红素等。此外,在研究受体二聚化、蛋
白质之间相互作用及受体与蛋白质之间相互作用的
领域中,这些技术基本都是应用于蛋白质的过表达
系统,而这一过表达系统往往会造成许多假阳性结
果。因此,已经发展起来的 FRET、BRET技术因
实验要求需要进一步的完善,如近期发展的小动物
活体成像技术 [33-35]、BRET3[36]、BRET6等。这种
技术不存在自体荧光光漂白和与荧光团激发相关的
组织衰减现象,有较高的光输出和高灵敏度,适合
检测活体小动物中蛋白质与蛋白质的相互作用,能
够反映在生物体内原生环境中的生理或病理刺激对
蛋白质系统产生的复杂影响,这也许能从根本上解
决上述蛋白质过表达系统导致的假阳性。
TIRF是在单分子水平上研究活细胞内信号转
导机制的新技术。它的荧光激发深度在 0~200 nm
的薄层范围内,这一独特的优势能够实现对单个荧
光分子的直接探测,从而大大促进了细胞表面科学,
如受体 -配体相互作用、膜组分动力学、细胞信号
转导和膜蛋白的相互作用的研究 [37]。运用 TIRF技
术证实了 2-毒蕈碱受体与 γ-氨基丁酸受体可以形
成异源二聚体 [38-39],但由于 TIRF技术的荧光激发
光深度只有 200 nm左右,使用范围比较局限。
4 结语
GPCRs与 G蛋白的相互作用是信号转导途径
中的关键环节,也是将胞外信号传递到胞内信号的
重要枢纽。无论是受体还是 G蛋白异常都将影响
下游信号传导途径,引起机体正常生理状态的改变,
从而导致疾病 [15,40-41]。因此,许多研究聚焦于
GPCRs对各个亚型 G蛋白的特异性作用及其机制,
并在该领域取得了一定的成果。
就目前发展形势,未来几十年内,以 GPCRs
为药物靶点的药物将日益增加,明确 GPCRs与 G
蛋白相互作用关系的细微变化将成为研发新药物的
A:能量供体(CFP)与能量受体(YFP)之间的距离小于10
nm,当用适当的荧光(433 nm)激发CFP时,能量从CFP非辐
射地共振转移到YFP上,产生有效的FRET信号;B:当供体
与受体之间的距离小于10 nm时,由生物发光素酶催化底物
发出的光来激发受体,完成供体与受体之间的能量转移,
产生有效的BRET信号。
图2 FRET和BRET的基本原理图
生命科学 第26卷186
主流。FRET、BRET等新兴技术的出现以及各种技
术的联合使用,为 GPCRs与 G蛋白的作用机制提
供了更有力的研究手段。这些技术不仅能从横向上
全方位地研究受体 -受体、G蛋白亚基 -亚基间的
相互作用,而且从纵向上更深入地解释了配体与受
体结合、受体与 G蛋白偶联以及 G蛋白介导的信
号转导途径等过程 [24]。此外,还可利用这些技术辨
别出 GPCRs与 G蛋白的结合状态在机体正常和疾
病时的不同。对 GPCRs与 G蛋白的动力学关系的
研究拓宽了研究视野,提高了 GPCRs作为药物靶
点的特异性,也为新药的研发与疾病的个性化治疗
夯实了基础。
[参 考 文 献]
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