全 文 ：第27卷 第2期
2015年2月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 27, No. 2
Feb., 2015
文章编号：1004-0374(2015)02-0228-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2015032
∙ 技术与应用 ∙
收稿日期：2014-08-25； 修回日期：2014-09-26
基金项目：国家自然科学基金项目(31172304)
*通信作者：E-mail: gfsh0626@126.com；Tel: 0411-
87402337
MHC I类分子四聚体技术的应用研究进展
董宋鹏1，李子彬2，杨　杰1，高凤山1*
(1 大连大学生命科学与技术学院，大连 116622；2 吉林农业大学生命科学学院，长春 130118)
摘　要：主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC)I 类分子四聚体 (tetramer) 技术可
直接对抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocytes, CTL) 进行标记，以检测能够识别特定抗
原肽 -MHC I 的 CTL，用于临床检测、疾病诊断及相关科学研究。综述了 MHC I 四聚体技术应用的最新研
究进展，为开展四聚体的相关研究提供新的参考。
关键词：MHC I ；四聚体；抗原肽；细胞毒性 T 淋巴细胞
中图分类号：R392.11 文献标志码：A
Progress on the application of the MHC I tetramer technology
DONG Song-Peng1, LI Zi-Bin2, YANG Jie1, GAO Feng-Shan1*
(1 College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China;
2 School of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130118, China)
Abstract: The tetramer technology in major histocompatibility complex class I (MHC I) can be used to label the
antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) directly so as to detect the CTLs, which can recognize the specific
antigenic peptide-MHC I. The MHC I tetramer technology can be applied in clinical test, disease diagnosis and
scientific research. In this article, the novel progress on the application of the MHC I tetramer technology is
reviewed fully to provide a new reference to research in tetramer.
Key words: MHC I; tetramer; antigenic peptide; cytotoxic T lymphocytes
抗原特异性的 CD8+ T 淋巴细胞，亦即特异性
CTLs 在免疫应答中发挥着重要作用，对其进行定
量分析可为阐明抗病毒感染、肿瘤及自身免疫提供
帮助。在细胞免疫应答中，抗原特异性 CTLs 并不
直接与抗原分子或抗原肽结合，而是一分子的抗原
特异性 T 细胞受体 (T cell receptor, TCR)、一分子
的 MHC I 分子及对应的特异性抗原肽形成三元复
合物，之后才可形成有效的免疫应答。因此，通过
TCR 与 MHC I- 抗原肽特异性结合来定量分析检测
特异性 CTLs 成为新的趋势。为了更充分了解细胞
免疫应答产生的机制，需要一种高通量的识别 T 细
胞表位的方法。结合高通量的细胞计数法，大量使
用肽 -MHC I- 四聚体染色技术能够更方便地研究免
疫应答中被激活的 CTLs 的识别作用 [1]。
1　MHC I四聚体技术的产生
分析抗原特异性 T 细胞的方法有多种。一般
而言，传统的方法主要包括有限稀释法 (limiting
dilution assays, LDA)、51Cr 释放法、酶联免疫斑点
法 (ELISPOT) 等等。有限稀释法，简而言之通过
延长细胞培养的时间以增加抗原特异性 T 细胞群体
的数量，之后，利用细胞毒试验检测其抗原特异性。
该方法缺陷在于过于依赖体外的增殖，只能检测到
一部分 CTL 前体 (CTLp)，甚至出现假阳性结果。
51Cr 释放分析法和 LDA 法相似，是通过间接检测
抗原特异性 CTLs 的方法，并且都要求有大量的特
异性 CTLs 作为效应细胞，因此，需要首先在体外
进行细胞培养、扩增。这两种方法周期长、敏感性低、
费时费力，难以广泛应用 [2]。相比之下，ELISPOT
董宋鹏，等：MHC I类分子四聚体技术的应用研究进展第2期 229
则不需要依赖体外增殖，直接检测细胞因子产物来
评价 T 细胞，并且敏感度远高于 LDA 法，但该方
法依赖一定时间的肽诱导，在检测的过程中还容易
杀死被测细胞 [3]。另外，细胞因子在各种细胞中的
产生并不均一，甚至有的细胞不产生，因此，往往
会低估了抗原特异性 CTL 的总量。
因此，有研究者设想能否通过 TCR 与 MHC I-
肽的相互作用来检测抗原特异性的 CTLs[4]。自 20
世纪 80 年代起，陆续有学者使用可溶性 MHC I 类
分子来研究 T 淋巴细胞反应，但结果并不理想。究
其原因，单价的 MHC- 肽分子与 TCR 的亲和力极
低 (~10-5 μmol/L)，且解离快，形成的复合物半衰
期不足 1 min[5]。因此，1996 年，Altman 等 [6] 基于
这些特点提出了可溶性 MHC I- 肽四聚体 (MHC
I-peptide tetramer) 技术，由于该技术的特异性和高
效性，目前已被广泛应用于抗原特异性 CTL 的定
性和定量分析，成为研究细胞免疫的强有力工具。
Altman 等 [6] 首先在体外将 15 个氨基酸残基
的生物素酶底物肽 (Bio A substrate peptide, BSP)
加在 HLA-A2(MHC I 类分子 ) 重链的 C 端形成融
合蛋白，在体外按一定比例与 β2 微球蛋白 (β2m)
及特异的抗原肽共孵育，使其折叠成正确的构象，
成为 pMHC 复合物。将生物素标记在底物肽的赖
氨酸残基上，使用荧光色素标记链亲和素，而一
个标记荧光素的链亲和素可结合四个生物素标记
的 pMHC 复合物，因此结合形成四聚体，如图 1
所示。MHC I- 抗原肽四聚体与抗原特异性 CTLs
上的 TCR 结合后，即可以通过流式细胞仪定量检
出体内抗原特异性 CTLs，并能将其分选出以供体
外培养扩增和功能分析之用。MHC I 四聚体的出
现大大提高了 MHC I 与 TCR 之间的亲和力，并提
高检测效率。MHC I 四聚体技术逐渐在各种领域
实现了应用。
2　MHC I四聚体技术的应用
2.1　MHC I四聚体技术在肿瘤免疫与治疗中的应用
MHC I- 肽 - 四聚体技术广泛应用于抗原特异
性 CTLs 在癌症及其他免疫疗法方面的研究，尤其
在黑色素瘤及慢性髓性白血病方面 [8-13]。这使得研
究者在诱导 T 细胞及临床应用之间找到了联系。分
析 T 细胞的特异性及表型将有助于人们在治疗中识
别免疫的相关性。
受 MHC I 四聚体技术的启发，研究者发现一
种新的抗肿瘤方法：将抗肿瘤特异性单克隆抗体生
物素化，与生物素化 MHC I- 肽单体及亲和素混合，
形成亲和素 - 生物素复合物，一个位点连接抗体，
另外三个位点连接生物素化 MHC I- 肽单体 [14]。还
有直接用化学法连接亲和素及单克隆抗体，然后与
生物素化的 MHC I- 肽单体混合，形成抗体 -MHC I-
肽四聚体复合物。这两种复合物都能连结到肿瘤细
胞表面，通过四聚体特异 CTL 而使其溶解 [15]。
Jemon 等 [16] 在小鼠体内进行试验，将一般的
T 细胞辅助细胞表位 PADRE 与来自 HPV16 E6 的
MHC I 限制性多肽 (aa 48–57) 结合，检测了抗 TC-1
HPV16 E6 和 E7 肿瘤的免疫疗效。结果显示，小鼠
的肿瘤负担减少了 50%，并且存活时间的中值数是
对照组的两倍。
2.2　MHC I四聚体技术在自身免疫疾病治疗与预防
中的应用
糖尿病一直是困扰人类健康的一大顽疾，尤其
在老年人中发病率较高。即便在科技发达的今天，
糖尿病的发病率也只增不减。越来越多的证据表明，
自体反应抗原特异性 CTLs 是动物或人体的 1 型糖
尿病发病过程中的重要因素 [17]。因此，今后需要对
自体反应 CTLs 特异性及其反应投入更多的精力。
使用蛋白质或多肽验证 T 细胞免疫耐受作用费时费
力，该方法的一个缺陷是剩余的自体反应 T 细胞有
可能会激活或激化疾病。Zwicker 等 [18] 使用一种新
的方法——耦合毒物 MHC I 四聚体法，可用于除
去自体反应的 T 细胞，其原理是利用结合在 MHC I
四聚体上的皂草素除去体内外对 IGRP( 葡萄糖 -6-图1 MHC I四聚体结构示意图(参考[7]修改)
生命科学 第27卷230
磷酸催化亚基相关蛋白 ) 反应的 T 细胞。对 IGRP
细胞内的 TCR β 链进行序列分析发现，随着非肥胖
糖尿病 (non-obese diabetes, NOD) 小鼠年龄的增长，
胰腺内的呈四聚体阳性反应的 T 细胞明显减少，尤
其在毒性四聚体 NOD 小鼠体内发生了改变。胰腺
中持续的 MHC I 四聚体阳性 T 细胞几乎被完全消
除掉，并且胰腺中意外丢失四聚体阳性 T 细胞会持
续很久。最终，经过八周的对 IGRP+CTLs 细胞的
消除实验的观察，发现利用 MHC I 四聚体技术显
著地延迟了 NOD 小鼠糖尿病的发生。
2.3　MHC I四聚体技术在病毒免疫疫苗研究中的
应用
许多高效的疫苗依赖于中和抗体。测量血清中
抗体的含量是一种简单有效的分析抗原效率的方
法。然而，即使在流感病毒免疫刺激之后进行检测，
血清中的抗体水平依旧难以检测。此外，一种疫苗
能够引起效应 CTLs 的免疫应答同样需要被检测
到 [19]。MHC I- 肽四聚体技术提供了一种理想的表
征 T 细胞对疫苗免疫应答的方法，并且该方法已在
多种病毒疫苗的免疫应答中得到了应用，包括流
感 [20]、黄热病 [21]、肺结核 [22]、HIV/SIV[23-24] 以及
一些癌症疫苗研究的尝试之中。通过该方法检测 T
细胞对大量表位的特异性，对于了解如何控制快速
变异的病毒，如 HIV 将有重要的意义。
2.4　MHC I四聚体技术的临床应用
MHC I- 肽 - 四聚体技术同样在临床方面得到
了部分应用。Cobbold 等 [25] 结合磁珠法使用 HLA I
四聚体染色技术，从干细胞移植患者血液中纯化得
到了巨噬细胞病毒 ( CMV) 特异性 CTLs，并在组
织移植患者过继移植治疗法中得到应用。在该病例
中，T 细胞在经四聚体介导的富集后依旧保持着增
殖活性；然而，对于这些被选中的细胞，使用可逆
的四聚体染色可能会对其功能有更好的改善 [26]。
此外，一些研究人员还开发出了四聚体的变体，该
变体可携带放射性元素或偶合毒素，并对小鼠进行
注射以便调节或耗尽特异性 T 细胞 [27-28]。
Schwenk 等 [29] 通过流式细胞术分析结合疟原
虫抗原肽的 MHC I 四聚体发现，呈免疫阳性的抗
原特异性 CTLs 刺激加强了早期 CD38 及 HLA-DRhi
( 高表达量的 HLA-DR)。从 3 名四聚体染色阳性的
患者中发现，前期活化的阳性细胞表型包括了所有
四聚体染色阳性、疟疾抗原表位特异性的 CTLs，
这表明在不确定表位特异性的情况下，早期的表
型活化可以识别所有的疟疾疫苗诱导的抗原特异
性 CTLs。
肾脏移植后的病毒感染一直亟待解决，通过
病毒抗原特异性 T 细胞应答被认为可以识别感染
病毒的抗原表位，从而可以做出早期诊断。因此，
Mees 等 [30] 通过四聚体技术定量检测病毒特异性
CTLs，用于研究其在肾脏移植手术中的反应及感
染状况。研究人员通过对 36 种病毒抗原表位特异
性的 T 细胞及 5 种 HLA I 进行构建，结果发现有 3
位患者 CMV 感染，3/4 的患者出现过 CMV 二次感
染，大多数 CMV 四聚体阳性的患者同时显现巴尔
病毒 V(EB) 四聚体显型。
2.5　MHC I四聚体技术在其他领域的应用
2.5.1　通过MHC I四聚体技术对细胞组分分析
通过四聚体磁珠富集法，Pauken 等 [31] 直接比
较了对 I-Ab 细胞呈现出的各种各样的抗原肽特异性
的 CTLs 的频率。他们发现该频率介于 1:50 000 至
1:500 000，且取决于表位。个体之间频率的差异已
经研究清楚，并且扩展至小鼠和人的外周血的抗原
特异性 CTLs。部分学者通过四聚体磁珠富集法研
究了初始 (naive) 及成熟 (mature)T 细胞与各种抗
原之间的免疫应答，结果显示在一些疾病的特异性
抗原表位刺激的免疫应答中，初始 T 细胞起主要作
用，这些疾病包括小鼠的水泡型口腔感染、淋巴细
胞性脉络丛脑膜炎病毒感染以及人类的丙型肝炎病
毒感染等。研究发现，通过肽 -MHC 四聚体检测得
到的初始 T 细胞频率影响肿瘤特异性 T 细胞应答。
因此，通过富集得到的 MHC I 四聚体染色敏感度
促进了对初始 T 细胞功能的研究。
2.5.2　通过MHC I四聚体技术进行表位制图
通过结合大量细胞计数法与抗原肽四聚体染色
法，Newell 等 [32] 发明了一种可以快速并同步对多
种抗原特异性的 CTLs 进行识别的方法。他们在单
个血液样本中测试 109 种不同抗原特异性的 MHC I
四聚体，并对其中的 2 种进行标记以便研究其表型
及功能。在 77 种候选轮状病毒表位中，研究者发
现了 6 种受 HLA-A*0201( 人类白细胞抗原 ) 限制
的表位特异性的 CTLs。研究发现，VP3 重组蛋白
表位特异性的 T 细胞表型更加明显，并且在大肠上
皮细胞中频率较高。以上的研究结果使得对抗原表
位及特异性 T 细胞的预测成为可能。
2.5.3　MHC I四聚体技术应用的最新研究
最新研究表明，MHC I 四聚体技术可应用于基
因转座子与荧光素酶共作用的研究。经长期试验观
察后，Podetz-Pedersen 等 [33] 发现了睡美人 (sleeping
董宋鹏，等：MHC I类分子四聚体技术的应用研究进展第2期 231
beauty, SB) 基因转座子具有调节新的基因序列的整
合并导致基因长时间表达的功能。还发现将具有高
度活性的转座酶 SB100X 与荧光素酶转座子 pT2/
CaL 共同作用，会导致荧光素长时间表达。然而，
经 4 周观察试验后，发现该荧光素基因表达产物在
实验小鼠体内逐个消失，而这种现象在免疫缺陷小
鼠体内却没有发生。他们推测表达的荧光素蛋白在
体内发生了免疫反应，后通过制备 MHC I 荧光素
抗原肽四聚体以诱导淋巴细胞内细胞因子大量分
泌，证实了经转座作用产生的荧光素在小鼠体内产
生了特异性的抗原肽免疫应答。
MHC I 四聚体技术还可应用于检测发现新的功
能肽，以及肽与 MHC I 基因座之间的关系。Newell
等 [32] 和 Akram 等 [34] 通过 MHC I 四聚体检测技术
首次发现，内质网相关氨肽酶 1(ERAP1) 在调节抗
原肽分子与 MHC I 分子结合中起到了重要作用。
研究发现，在缺乏 ERAP 的情况下，在流感病毒 A
感染的 HLA-B27/ERAP−/− 小鼠体内，对 B27/NP383-
391抗原肽的CTL免疫应答水平出现了明显的下降；
通过使用四聚体染色，B27/ERAP−/− 转基因小鼠体
内分泌 TCR Vβ8.1 的初始抗原特异性 CTLs 数量明
显低于 B27/ERAP+/+ 小鼠。而同样的实验在 HLA-B7
基因座未引起类似的反应现象。由此不仅证明
ERAP 能够调节抗原肽与 HLA-B27 的结合，而且
证明 ERAP 与 HLA-B27 功能相关。
MHC I 四聚体技术还可应用于抑制移植排斥反
应。在心脏移植小鼠模型中，阻止 T 细胞与
CD40Ig 刺激将导致无数的移植组织存活，而这又
是 CD8+CD45RClo 调节 T cells (CD8+CD40Ig Tregs)
与树突状细胞共作用的结果。TCR-MHC- 肽在调
节 Treg 活性方面依旧存在争论。Picarda 等 [35] 制备
了标记四聚体的抗原肽 (MHC-I RT1.Aa/Du51) 来
定位和定量小鼠心脏及脾脏移植手术后的 Du51 肽
特异性 T 细胞的表达。该 Du51 肽能够引起 TCR 倾
向性的 CD8+CD40Ig Tregs 群识别，并激活 CD8+CD40Ig
Tregs 群，从而抑制抗宿主的移植反应。随后的
MHC I 四聚体检测实验证实，该 Du51 肽的确能够
使组织移植接受者组织存活。
3　MHC I四聚体技术的改进
由于每一种 MHC I 四聚体都需要独立地制造
与纯化，因此，一段时间来四聚体技术的进步遇到
了瓶颈。对于 MHC I 四聚体以及部分 MHC II 四聚
体，可变的多肽彻底解决了这个问题。Grotenbreg
等 [36] 引入了紫外敏感型多肽用于 MHC I- 肽 - 四聚
体的传代，即特异性多肽带一个紫外敏感标签。经
过紫外照射可诱导多肽断裂为二，从而使多肽片段
从 MHC I 分子上分离并结合到各自的区域。因此，
某种确定的 UV 光敏感的多肽 MHC I 分子可以通过
标准方法制造，刺激后分裂成若干多肽，可用于进
一步制备出不同的 MHC- 肽 - 四聚体。
通过改变 MHC I 锚定残基以优化 T 细胞抗原
是一种改善多肽疫苗的常见方法。但人们有一些疑
问，这种改变是如何影响 TCR 与肽 -MHC I 的结合
及 T 细胞识别的。Cole 等 [37] 使用表面等离子体共
振以及细胞表面肽 -MHC I 四聚体结合来表征前体
肽锚定残基，可以很大程度上不可逆转地影响 TCR
与肽 -MHC I 的结合。他们还同时发现，TCR 辨别
正常多肽和锚定位点改变的不规则多肽的能力能够
区别 T 细胞对两种抗原所显示出的偏好。因此，改
进的多肽也许会使 T 细胞对已结合的抗原呈现出较
好的识别，并对后续的临床应用提供保障。
目前，四聚体技术的应用更多地集中于人或小
鼠，而对于与人类关系密切的动物，如猪 MHC I
四聚体的研究报道很少。2012 年，张香春等 [38] 和
2014 年，刘筏等 [39] 开展了猪 MHC I 类分子，亦称
为猪白细胞抗原 (swine leukocyte antigen, SLA) I 类
分子四聚体的研究，构建了荷包猪及烟台黑猪两个
不同品系猪 SLA-2 四聚体前体链，将用于与猪源病
毒 CTL 表位多肽及 TCR 的结合研究。在多肽的设
计上，采用了体外结合实验筛选多个品系猪 SLA I
类分子共结合多肽表位 [40-41] 的新方法，今后可用于
不同品系猪病毒病的检测及诊断。
4　问题与展望
MHC I 类分子四聚体技术的高通量及多通路
分析的发展，使得研究人员能够有效地将 MHC I
类分子四聚体技术应用于各自领域的问题中。过
去由于频率过低而无法得到的生物学上重要的 T
细胞现在通过四聚体技术的富集已经可以进行研
究了。同时，多通路定量 PCR 技术的发展为体外
研究四聚体技术提供了更好的技术支持。
MHC I 类分子四聚体技术是目前检测抗原特
异性 CTLs 的金标准。MHC I- 肽 - 四聚体技术可
以同时直接对特异性 CTL 进行定量、定性分析，
该方法灵敏度高、特异性强、无需体外扩增及对
细胞无损伤，但该技术在应用上依旧存在一些困
难，如合成及稳定 MHC I 类分子的技术困难，以
生命科学 第27卷232
及 Tetramer 常规制备过程中存在复性率低、步骤
繁琐等缺点，而且，每次反应只能分析单一的抗
原表位特异性 T 细胞。
尽管 MHC I- 肽 - 四聚体技术至今只有 20 年
的研究历史，而许多重要的研究发现也仅仅是近
几年才有所发展，但其前景仍然令研究者在各自
的研究领域中充满期待，尤其是目前的研究更多
地集中于人或模式动物的 MHC I 四聚体。然而，
对其他动物 MHC 四聚体的研究还没有广泛开展起
来。大连大学生命科学与技术学院分子免疫学课
题组今后将致力于动物 MHC I 类分子四聚体的研
究，争取利用四聚体技术更好地筛选猪源病毒多
肽表位，并希望在猪源病毒病的分子检测方面取
得突破。
[参　考　文　献]
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