全 文 ：致病杆菌属和光杆状菌属细菌杀虫毒素蛋白
刘峥 杨怀文
(中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所,北京 100081)
摘 要: 致病杆菌属和光杆状菌属细菌是一类分别与斯氏线虫属和异小杆属线虫共生的昆虫病原细菌, 属
肠杆菌科,此类细菌产生的杀虫毒素蛋白是近年来发现的一类高效、杀虫谱广的新型杀虫蛋白。此类毒素蛋白对
多种昆虫具有注射和口服毒性,在同一菌株中有多个杀虫基因,各杀虫蛋白基因之间具有协同毒力效应, 杀虫蛋白
基因在大肠杆菌和植物中表达的毒素蛋白对多种害虫具有口服毒性。
关键词: 致病杆菌 光杆状菌 杀虫毒素蛋白
The Insecticide Toxin Protein from Xenorhabdus and Photohabdus
Liu Zheng Yang Huaiwen
( Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture,
Chinese Academy of Agricul tural Science , Beijing 100081)
Abstract : The bacteria belong to the genera Photorhabdus and Xenorhabdus , which are symbiotically associated with ento-
mopathogenic nematodes of the families Heterorhabditidae and Steinernematidae respectively. The insecticide toxin proteins has
been screened from Xenorhabdus and Photohabdus bacteria and involved in the killing of a wide variety of insects and interfering
with insects development. Those toxin proteins are with high injection and oral toxicity for insects. Mult-i toxin gene were predict-
ed, the toxin proteins were expressed in E . coli and plants and exhibited substantial oral toxicity toward insects.
Key words: Xenorhabdus Photohabdus Insecticide tox in protein
致病杆菌属 ( Xenorhabdus)和光杆状菌属( Pho-
torhabdus )细菌是一类与昆虫病原线虫互惠共生的昆
虫病原细菌,属肠杆菌科( Enterobacteriaceae) , 其分别
与斯氏线虫属( Steinernema)和异小杆属(Heterorhab-
ditis )线虫共生,此类细菌存在于昆虫病原线虫三龄
侵染期线虫的肠道内,随着线虫对昆虫的侵染,共生
细菌被携带到昆虫体内并释放到寄主血腔中, 在此
侵染过程中,共生菌不仅具有杀死昆虫的作用,而且
能够分解昆虫组织,为线虫和共生菌的生长繁殖提
供营养。
近年来,随着对此类细菌的研究不断深入,致病
杆菌属和光杆状菌属细菌的多种生物学功能被各国
科学家不断发现。1998 年, Bowen首次报道在发光
光杆状菌( P . luminescens W14)中存在 4个编码昆虫
毒素蛋白复合体的基因簇[ 1] , 使昆虫病原线虫共生
细菌杀虫毒素蛋白基因成为微生物杀虫蛋白基因家
族中的一员。2003年 P. luminescens TT01菌株基因
组全序列测序完成, 序列分析表明发光光杆状菌为
已知基因组序列的细菌中含有杀虫毒素基因最多的
一种细菌,这些毒素基因对多种害虫具有毒杀和抑
制生长活性[ 2]。
1 致病杆菌属和光杆状菌属细菌杀虫蛋白
的产生与分泌
在离体培养条件下,致病杆菌属和光杆状菌属
细菌胞内和胞外均可产生杀虫活性蛋白[ 1, 3, 4] ,不同
种或同种不同菌株共生细菌产生的胞内或胞外物质
的杀虫活性不同[ 5] , 同一菌株在不同的发酵条件下
的杀虫活性亦不同,培养基碳源、氮源、矿物元素、维
他命含量、pH 值, 菌液的培养温度、时间、菌株的型
收稿日期: 2004-10-11
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 1期
态变异等因素对杀虫活性物质的产生均有影响[ 1, 6]。
Khandelwal等( 2003)研究发现嗜线虫致病杆菌 ( X .
nematophila)杀虫活性物质的分泌与细菌外膜囊泡
(outer membrane vesicles)有关[ 7] , 在透射电子显微镜
下观察到 X . nematophila 菌体细胞表面分布有小囊
泡,其中含有直径为 20~ 100nm 的大分子复合物,
SDS-PAGE分析表明其含有外膜蛋白和一些其它多
肽物质。菌体活细胞和囊泡内蛋白对棉铃虫 ( He-
licorer armigare )初孵幼虫均有杀虫活性, 外膜囊泡的
非溶解性蛋白对棉铃虫初孵幼虫仍有低水平的杀虫
活性, 同时观察到外膜囊泡蛋白还具有几丁质酶活
性, 此研究说明杀虫毒素通过外膜囊泡分泌到培养
基中。这也许是致病杆菌属和光杆状菌属细菌胞内
和胞外均具有杀虫活性物质产生的原因。
2 致病杆菌属和光杆状菌属细菌杀虫蛋白
及其目标害虫
2. 1 注射活性杀虫蛋白
Ensign 等, ( 1990) 在发光光杆状菌 ( P . lumi-
nescens)代谢物中发现了具有昆虫毒性的胞外蛋
白[ 8] ,这种蛋白由许多蛋白亚基组成,既不具有蛋白
水解酶和磷酸酯酶活性, 也不具有胃毒活性, 注射毫
微克便可在 12~ 24h内杀死烟草天蛾( Manduca sex-
ta) 5龄幼虫。Smigielski等, ( 1999)报道[ 9] , 从 X . ne-
matophila A24 发酵液中分离到一种 30kDa 的杀虫蛋
白,注射数微升该发酵液即可使大蜡螟死亡。
2. 2 口服活性杀虫蛋白
致病杆菌属( Xenorhabdus )和光杆状菌属 ( Pho-
torhabdus ) 细菌既能产生对昆虫具有血腔毒性的杀
虫蛋白,还可产生胃毒蛋白。P . luminescens W14菌
株分泌的杀虫蛋白为高分子量蛋白复合体,既有注
射活性,又有胃毒活性, 而且杀虫谱宽, 对鳞翅目和
鞘翅目均表现出较高毒性[ 1] , 该蛋白由 4个蛋白复
合体构成,分别由 tca、tcb、tcc、tcd 编码,其中 tca 和
tcd 编码的蛋白复合体对烟草天蛾幼虫有很高毒性,
该菌株能产生两种分子量为 660kD 的杀虫蛋白, 即
毒蛋白 A和毒蛋白 B;两种毒蛋白均由多个亚基组
成,且仅含分子量为 208kD和 63kD两种多肽; N 末
端氨基酸序列分析和Western分析结果表明, 这两种
蛋白的相似性高达 82%; 这两种蛋白均没有酶活性
和溶血活性,但口服毒性却很高, 对南部玉米叶甲初
孵幼虫的 LD50分别为 5ng/ cm2和 87ng/ cm2; 毒蛋白 A
对烟草天蛾幼虫同样具有很高的杀虫活性,但毒蛋
白 B 仅对其生长有抑制作用。Morgan 等( 5) 从 X .
bovienii H31和 I 73菌株中分离到高活性杀虫蛋白,
对欧洲粉蝶( Pieris brassicae)、小菜蛾( Plutella xylostel-
la)、叶甲( Phaedon cochleariae)的半致死量分别为 78.
9ng/cm2、4. 9ng/ cm2、57. 6ng/ cm2和 232. 2ng/ cm2、3.
5ng/ cm
2、19. 4ng/ cm2, 并发现这些杀虫蛋白和 Bt 杀
虫蛋白具有交互增效作用, 杀虫活性可提高 6倍以
上。
2. 3 致病杆菌属和光杆状菌属细菌杀虫谱
部分研究论文和专利资料显示[ 1, 2, 5, 6, 8~ 16] , 几
乎所有已知致病杆菌属和光杆状菌属的细菌种类均
可产生具有口服或注射活性的杀虫蛋白, 测试有效
的目标昆虫主要为鳞翅目害虫,包括烟草天蛾(Man-
duca sexta )、欧洲粉蝶 ( Pieris brassicae )、小菜蛾
( Plutella xylostella )、菜粉蝶 ( Pieris rapae )甘蓝夜蛾
(Mamestra brassicae)、棉铃虫(Helicorer armigare)、甜菜
夜蛾 ( Spodoptera exigua )、棉贪夜蛾 ( Spodoptera lit-
toralis)、小地老虎( Agrotis ipsilon)、小卷蛾( Lobesia bo-
trana)等,还有鞘翅目的叶甲( Phaedon cochleariae )、同
翅目的桃蚜 ( Myzus persicae ) 和膜翅 目的火蚁
( Solenopsis invicta )双翅目的斑蚊(Aedes aegypti)、尖音
库蚊( Culex pipiens)、冈比亚按蚊( Anopheles gambiae)
等。说明致病杆菌属和光杆状菌属细菌已成为一类
新型的杀虫蛋白基因资源微生物。
3 致病杆菌属和光杆状菌属细菌杀虫蛋白
基因
3. 1 昆虫病原线虫共生细菌杀虫蛋白基因的分离
及其结构
在GenBank中登记的致病杆菌属和光杆状菌属
细菌的杀虫蛋白基因, 主要来源于嗜线虫致病杆菌
(X . nematophila)和发光光杆状菌( P . luminescens )。
P . luminescens W14菌株杀虫蛋白基因由 4个编码毒
素蛋白的基因簇 tca、tcb、tcc 和 tcd 组成 ( Bowen,
1998) ; Waterfield 等[ 16]从 P. luminescens W14菌株中
发现了一个127816bp 的致病岛, 包含 9个独立的 tc
毒素基因 ( GenBank 登录号为 AF346500) ; 2002 年
Daborn等[ 17]又从 P . luminescens W14和 K122菌株中
分离到了一个独立的杀虫蛋白基因 mcf 基因;Morgan
212005年第 1期 刘峥等:致病杆菌属和光杆状菌属细菌杀虫毒素蛋白
等( 2001) [ 10]分离到的 X . nematophila 杀虫蛋白基因
簇由xptA 1、xptB1、xptC 1和 xptA2组成。我国中山大
学国家生物防治重点实验室 Cui等[ 18]构建了嗜线虫
致病杆菌( X . nematophila)BP 菌株的粘粒文库, 从中
筛选出 7个杀虫蛋白基因片段 toxin A~ toxinG( Gen-
Bank登录号为AF513479~ AF513485) , 2003年6月登
记了杀虫蛋白基因 toxin A2 和一个杀虫基因片段
toxin C1( GenBank登录号为 AY282763)。Genbank 中
此类杀虫蛋白基因大多数登记时间在 2000年以后,
说明近年来昆虫病原线虫细菌杀虫蛋白基因的研究
日益被各国科学家所重视。
目前对 P . luminescens 和X . nematophila 的杀虫
蛋白基因结构研究较详细[ 1, 10] , P. luminescens 杀虫
蛋白基因由 tca、tcb、tcc 和 tcd 4个基因簇构成, 这 4
个基因簇具有两种不同类型的基因构成, tca 和 tcc
具有 3个同方向转录的开放阅读框架( ORFs) tcaA、
B、C 和 tccA、B、C, 及一个反方向的短的终止开放阅
读框架 tcaZ, tccZ 构成, tcbA 和 tcdA 均为 6kb的开放
阅读框架[ 19]。X . nematophila 杀虫蛋白基因簇由 3
个向同方向转录的开放阅读框架 ( ORFs ) xptA2、
xptB 1、xptC1和一个反方向终止开放阅读框架 xptA 1
构成[ 10]。已知的嗜线虫致病杆菌和发光光杆状菌
杀虫毒素蛋白的氨基酸序列分析表明, 来自不同属、
不同种和不同菌株的杀虫蛋白的氨基酸序列具有一
定的相似性[ 1, 2]。
3. 2 昆虫病原线虫共生细菌杀虫蛋白基因的表达
和对昆虫的毒性
昆虫病原线虫共生细菌杀虫蛋白基因在大肠杆
菌中表达的毒素蛋白对多种害虫具有口服毒性。
3. 2. 1 P. luminescens W14 tc 基因的表达与功能
1998年Bowen [ 1]从 P . luminescens W14菌株中分离到
杀虫蛋白基因 tc 基因簇, 将 tc 基因转入大肠杆菌,
诱导表达获得了目的蛋白, 但无杀虫活性。Water-
field等( 2001)构建了 tca、tcb、tcc 和 tcd 基因大肠杆
菌表达系统,对 tc 基因表达蛋白功能分析结果认为
tcdA、tcdB、tccC 是对烟草天蛾( Manduca Sexta )幼虫
具有杀虫活性的主效基因[ 16]。
3. 2. 2 X . nematophila xpt 基因的表达与功能 Mor-
gan 等[ 10]通过对 X . nematophila杀虫蛋白基因 xptA1、
xptA2、xptB1、xptC1和 xptD1基因插入突变子的昆虫
口服毒性分析, 发现 xptA1是表达杀虫活性的主效基
因。xptA1与 xptB1和 xptC1基因联合表达蛋白具有
较高的杀虫活性。xptA 1基因在大肠杆菌中表达的
重组蛋白对欧洲粉蝶( Pieris brassicae)具有杀死和抑
制生长活性, LC50 = 112g 细胞总蛋白/ g 饲料。
Sergeant等[ 20]构建了 xptA 1、xptA2、xptB1和 xptC1基
因联合的和独立的大肠杆菌表达系统, 对各个基因
的交互作用进行了研究。表达产物杀虫活性测试表
明, xptA 1、xptB1和 xptC 1基因表达产物对欧洲粉蝶
( P . brassicae)和菜青虫( Pieris rapae)具有杀虫活性;
而 xptA 2、xptB1 和 xptC1 对烟蚜夜蛾 ( Heliothis
virescens )具有杀虫活性;单个基因在大肠杆菌中的表
达产物对目标昆虫的杀虫活性较低; xptB 1和 xptC 1
联合表达产物与 xptA1 表达产物混合饲喂欧洲粉蝶
和菜青虫, xptB 1和 xptC1联合表达产物与 xptA2表
达产物混合饲喂烟蚜夜蛾则恢复较高的杀虫活性,
这种各个基因的交互作用关系与杀虫蛋白基因在
X . nematophila 中的基因阅读框架和转录方向有关。
Khandelwal等[ 21]构建了表达 17kDa 杀虫蛋白的大肠
杆菌表达体系, 重组蛋白对棉铃虫初孵幼虫具有杀
虫活性, 对较大龄期的棉铃虫的发育有影响。崔
龙[ 22]等报道 X . nematophilus BP 品系xptB1 xptC 1 xp-
tA2基因联合表达产物对棉铃虫初孵幼虫具有强的
杀虫效果。Joo Lee等从 X . nematophilus 中克隆的 tc-
cC1毒素基因在大肠杆菌中表达毒素蛋白饲喂大蜡
螟幼虫2天后致死率达到 80% [ 23]。
3. 2. 3 P. luminescens W14 tc 基因在植物中的表达
2001年 Petell等[ 24]将 P. luminescens tcdA 基因转入
烟草、玉米和水稻,杀虫蛋白基因在几种植物中均有
较好的表达。用烟草叶片饲喂天蛾幼虫( Manduca
sexta )后其体重下降 49%, 死亡率为37. 5%。玉米根
叶甲幼虫( Diabrotica undercimpunctata Howarde)取食转
基因玉米叶片后, 死亡率为 68% , 体重比对照下降
60. 2% ;取食转基因水稻叶片后体重比对照降低 74.
4%。
4 致病杆菌属和光杆状菌属细菌杀虫蛋白
的杀虫作用机制
目前,对于 tc基因编码的杀虫毒素蛋白复合体
的毒理作用机制还不很清楚, 仅对此复合体毒素蛋
白之一Tca进行了昆虫中肠的病理学研究。纯化的
22 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
Tca毒素饲喂烟草天蛾幼虫,在不同的取食时间对幼
虫的中肠进行切片观察, 发现 Tca 毒素对昆虫中肠
有特殊的作用, 对昆虫的其它组织没有影响, 连续取
食后,昆虫中肠上皮膜迅速分解脱落到肠腔中;当注
射Tca毒素到昆虫体内时, 发生类似的中肠反应,细
胞聚集并从上皮膜脱落, 在上皮膜的边缘可检测到
毒素蛋白[ 20]。毒蛋白对昆虫肠道的作用位点具有
一定的特异性, 首先作用于昆虫前中肠,在光学显微
镜下,烟草天蛾( M . sexta)在取食毒蛋白 3h后,前中
肠柱状细胞顶端膨大成囊泡状, 并被挤压进入肠腔,
随着取食时间的延长,囊泡与细胞基部脱离, 形成圆
形或椭圆形的泡状物进入肠腔, 最后中肠只剩一层
细胞, 胞间出现一定的距离, 形成一些空囊, 直至引
起肠壁细胞的死亡[ 1, 25]。共生细菌杀虫蛋白的杀虫
作用的分子机制有待进一步研究。
5 结语
杀虫蛋白基因的研究是转基因抗虫植物和微生
物遗传工程研究的基础。近年来, 研究和应用最多
的杀虫蛋白基因是编码苏云金芽孢杆菌 ( Bacillus
thuringiensis)杀虫晶体蛋白的基因,但由于其有限的
几种活性成分的广泛应用,使得害虫对 Bt 的抗性问
题已经出现, 因此, 寻找新的杀虫微生物、杀虫物质
及新的杀虫蛋白基因已成为国际研究热点。
光杆状菌属和致病杆菌属细菌的不同种或同种
不同菌株可产生多种杀虫毒素蛋白, 既有多样性又
具有一定的相似性, 已成为一类新的杀虫蛋白基因
家族。其编码的基因可能是能够与 Bt晶体蛋白基
因联合使用的有限候选基因之一, 对抗虫转基因植
物的更新换代, 防止害虫对某种抗虫转基因植物产
生耐受性, 成为害虫防治的新武器[ 26]。发光光杆状
菌( P. luminescens laumondii TT01)基因组全序列的测
序完成,促进了共生细菌产生的杀虫蛋白基因的研
究。共生细菌产生的杀虫蛋白基因的分离、重组蛋
白的功能鉴定, 转基因抗虫作物及杀虫蛋白作用机
制的研究将促进此类新型杀虫微生物的开发利用。
参 考 文 献
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