全 文 ：分子标记及其在植物空间诱变育种研究中的应用
尹淑霞 韩烈保
(北京林业大学草坪研究所北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,北京 100083)
摘 要: 简述了分子标记 RFLP、RAPD、SSR和 AFLP 的原理和特点以及空间飞行对植物材料变异的影响
因素,并就分子标记技术在植物空间诱变育种研究中的应用进展及前景进行了阐述。
关键词: 分子标记 植物育种 空间诱变
The Molecular Markers and Their Applications
in Study of Plants Space Mutation
Yin Shux ia Han Liebao
( Inst i tut e of T urf S ci ence , Bei j ing Forest ry Unive rsi ty , K ey L abor atory f or Si l v icu ltur e
and Conser vation of M ini st ry of E ducation, B eij ing 100083)
Abstract: The pr inciples and characterist ics o f RFLP, RAPD, SSR and AFLP techniques fo r DNA finger-
pr int ing were descr ibed in this paper. A lso , the key fact ors that affected the plants mutation in space flight w ere dis-
cussed. The advances o f applicat ion and pro spect of mo lecular markers in study o f plants space mutation were also
detailed.
Key words: Molecular marker s Plant breeding Space mutation
1分子标记技术
20世纪 80 年代中后期, 随着分子生物学的发
展以及分子克隆、DNA 重组技术的完善, 以 DNA
多态性为基础的遗传标记技术开始大量应用于植物
学研究中。尤其是最近几年来, 许多 DNA 分子标
记技术相继涌现并迅速用于植物研究中, 目前常用
的分子标记技术主要有以下 4种。
1. 1 RFLP标记
RFLP ( Rest rict ion Fragments Leng th Po ly-
morphism)即限制性片段长度多态性, 是指用限制
性内切酶处理不同生物个体的 DNA 所产生的大分
子片断的大小差异,是近年来发展起来的以生物基
因组 DNA 序列变异为基础研究不同基因组差异的
一项新技术。其原理是植物由于长期进化的结果,
在种属间甚至品种间同源 DNA 序列上限制性内切
酶识别位点不同, 或者由于点突变、重组等原因, 引
起限制性内切酶的识别位点发生变化。这样,植物
DNA 经适当的限制性内切酶切割成不同长度的限
制性片断,因为不同大小的片断在凝胶上运动速率
不同,在凝胶上形成了连续涂片,用 DNA 探针进行
Southern杂交, 放射显影后就能得到 DNA 的限制
性片断多态性。
利用 RFLP 技术进行多态性分析具有很多优
点,主要表现在:第一, 不受显隐性关系、环境条件和
发育阶段的影响, 具有稳定遗传和特异性, 检测方
便,可靠性高; 第二, 通过酶切反应来反映 DNA 水
平上所有差异,在数量上无任何限制;第三,能够区
别杂合体与纯合体; 第四, 克隆探针可随意选择, 多
态性高。
RFLP 技术的缺点主要是存在种属特异性, 在
实际应用中受到限制; 要制备放射性探针和进行滤
膜转移及 Southern杂交、放射自显影,因而费时、费
收稿日期: 2005-08-22
基金项目:国家高技术研究发展计划( 863计划) ( 2002AA2Z4281)
作者简介:尹淑霞( 1973- ) ,女,讲师,硕士,主要从事草坪建植与管理、草坪草遗传育种研究,发表论文 6篇,主编及参编教材、专著 9部
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGYBULLETIN 2006年第 1期
力、周期长、污染大, 对环境和人体造成不良影响; 此
外,对 DNA含量与纯度要求高, 多态性水平低, 技
术难度高,只适应单/低拷贝[ 1] 。
1. 2 RAPD标记
RAPD( Random Amplified Polymorphic DNA)
即随机扩增多态性 DNA 是由 Williams 和 Welsh
两个研究小组在 1990年各自独立发现的一种新型
DNA 多态检测技术遗传标记[ 2]。该技术以其快速、
准确和灵敏度高等特点, 一开始就受到生物学家的
高度重视,它在品种鉴定、分类研究、系谱分析、遗传
图谱构建、突变体检测和基因定位等遗传育种领域
得到广泛应用[ 3] 。
由于 RAPD可以是在对物种没有任何分子生
物学研究基础的情况下对其进行指纹图谱的构建和
遗传多样性的研究等, 因此, 它相对于 RFLP 来说
操作比较简便, 成本较低, DNA 数量也少,而且避免
了使用放射性同位素, 因而近年来在植物研究中得
到广泛的应用。但 RAPD标记技术主要存在两个
缺点:重复性和稳定性较差; RAPD过于灵敏, 而且
一般为显性标记,这意味着它不能鉴别杂合子和纯
合子。
1. 3 SSR标记
SSR( Simple Sequence Repeat )标记技术即短
的、串联的简单重复序列,也称为微卫星 DNA( M ic-
r osatellite DNA) ,是一类由几个核苷酸(一般为1~
5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联
重复序列。由于每个 SSR 两端的序列多是相对保
守的单拷贝序列,因而可以根据扩增产物长短的变
化来显示不同基因型的个体在每个 SSR 位点上的
多态性。SSR多态性的信息量非常丰富, 具有所有
RFLP 的遗传学特点, 又比 RAPD重复性能和可信
度高, 可产生大量的可描述的有差异的 DNA 位点,
可以帮助人们从 DNA分子水平上认识品种及个体
间的遗传差异, 因而在遗传标记研究中应用较广泛。
与 RFLP 标记相比, 微卫星 DNA 多态性较高,
并且等位基因数目多,呈等显性遗传,其指纹图谱呈
较高的多态性, 结果稳定可靠。但由于 SSR必须针
对每个染色体座位的微卫星, 发现其两端的单拷贝
序列以设计引物, 这无疑要投入大量的人力、物力,
因而给 SSR标记的利用带来了一定的困难。
1. 4AFLP 标记
AFLP( Amplified Fr agments Leng th Po lymo r-
phism)即扩增片断长度多态性, 是目前广泛使用的
DNA 指纹技术之一。由荷兰科学家 Zabeau 和 Vos
等于 1992年创立的一种新的分子标记技术[ 4, 5]。
AFLP 技术既具有 RFLP 的稳定性和可靠性,
又具有 RAPD的多态性和方便性, 灵敏度高。现已
广泛应用于生物多样性分析、品种鉴定、指纹图谱的
构建、基因克隆、基因鉴定、基因作图和基因表达等
诸多研究领域[ 6]。
AFLP基本原理是基因组 DNA 经限制性内切
酶酶切后,产生粘性末端。使用人工合成的短的双
链接头,该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末
端,互补连接后成为 DNA 模板。接头和与相邻的
酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点, 进
行扩增。最后用变性聚丙烯酰胺胶电泳分离扩增的
DNA 片段,根据扩增片断长度的不同检出多态性。
AFLP只需极少量 DNA, 不需进行 Southern
杂交,不需预先知道 DNA 的序列信息,可用于分析
检测种和种以下水平上的差异, 实验结果稳定可靠,
方便快速,重复性强。因此,在分子生物学和遗传育
种中基础理论研究和实际运用上发挥着越来越重要
的作用。
但 AFLP 标记技术也存在一些缺点, 主要在于
( 1)很难鉴别等位基因, 如对杂合子进行分析,需要
准确了解其等位基因的状况时,就不能用此方法[ 6] ;
( 2) AFLP 技术费用昂贵,操作难度较大, 对实验技
能要求较高; ( 3)对 DNA 纯度和内切酶的质量要求
较高。
综上所述,当前常用的四大分子标记技术各有
优缺点,但从总体上看, AFLP 技术还是以其方便、
迅速、可靠和信息量大的优势在植物育种中得到了
越来越广泛的应用。
2植物空间诱变育种
植物空间诱变育种是指在植物育种过程中,利
用返回式卫星和高空气球搭载植物材料, 飞行于距
离地球 20~ 400km 的高空, 利用空间的特殊环境,
对植物育种材料进行诱变处理, 返回地面种植选育,
以获得优良新品种或特殊种质材料。空间诱变育种
是航天技术、生物技术和农业育种技术相结合的产
512006年第 1期 尹淑霞等: 分子标记及其在植物空间诱变育种研究中的应用
物,是近几十年来产生的一种崭新的育种技术。因
其具有诱变效率高,变异幅度大, 生理损伤轻, 变异
性状稳定快以及出现一些特殊的变异类型等优点而
受到国内外育种学家的重视。
据统计,我国从 1987~ 1996 年, 利用返回式卫
星、高空气球和飞船先后 8次搭载生物材料, 累计物
种约 105种,品种 1 122个, 选育出一批优异新种质
和高产新品种 [ 7]。现在, 空间诱变育种已成为我国
在空间生命科学研究方面的一大特色。
植物材料经空间飞行后之所以会出现一些新的
变异, 主要是受到空间特殊环境条件的影响。空间
飞行中对生物有影响的关键因素主要有以下几个。
2. 1空间辐射
在空间飞行中,生物系统处于一个与地球生物
圈完全不同的辐射环境中。空间辐射环境的主要成
分有各种电子、质子、粒子、低能重粒子和高能重
离子等以及 X射线、射线及其他宇宙射线。空间
辐射主要导致生物系统遗传物质的损伤,诸如突变、
肿瘤形成、染色体畸变、细胞失活和发育异常等 [ 8]。
研究认为, DNA 和生物膜是射线作用的耙子,质子、
高能重离子等能有效地导致细胞内遗传物质 DNA
分子的双链断裂和细胞膜结构的改变, 这些损伤会
引起细胞的一系列修复活动[ 9]。若损伤未被修复或
被错误修复,就会表现出遗传变异[ 10] 。
2. 2空间微重力
空间的微重力不及地球上重力的 1/ 10。这种
微重力是影响飞行生物生长发育的重要因素, 也是
引起生物出现遗传变异的重要原因之一。
Hornech G指出, 微重力是通过增加植物对辐
射的敏感性和干扰 DNA 损伤修复系统的正常运作
而加剧生物变异,提高变异率[ 11]。
Anikeeva 等报道还阳参种子经空间飞行后增
大了飞行前辐照所引起的染色体损伤, 认为这是由
于空间环境中的微重力通过抑制了植物对辐射引起
的 DNA 损伤的修复而加剧了损伤 [ 12]。但也有研究
指出, 微重力对植物的影响小于高能重离子
辐射[ 13] 。
2. 3其他因素
空间飞行期间,生物系统处理近地空间多种诱
变因素的复合影响之中, 如空间辐射和微重力的相
互作用、高真空、卫星飞船发射时强振动以及其他未
知因素。
Planel等[ 14] 在细胞水平上对空间环境因素对
生物的影响进行了研究, 认为空间飞行造成的损伤
主要是空间辐射和空间其他因子综合作用的结果,
通过改变细胞的辐射敏感性从而加剧损伤。
3分子标记在植物空间诱变育种中的应用
植物经空间飞行后所产生的变异, 有的可以稳
定遗传给后代,有的变异仅局限于当代,不能遗传。
而 DNA 是遗传信息的载体,遗传信息包含于 DNA
的碱基排列顺序之中。因此, 直接对 DNA 碱基序
列的分析和比较是提示植物是否发生遗传变异的最
理想的方法。因此分子标记技术在植物空间诱变育
种中应用越来越广泛。其中, RAPD分析是目前从
分子水平上研究植物空间诱变效应及其突变后代遗
传变异性的主要手段。
早在 1995年, 邢金鹏等[ 15] 就对卫星搭载的水
稻农垦 58大粒型突变系及对照进行了 RAPD 分
析,不仅找出与水稻大粒型突变系有关的特异片断
OPAI8-3,而且将其标记定位在水稻的第 11 对染色
体上,从而证明了突变系在 DNA 水平上发生了变
异。韩东等[ 16] 对 3 个经空间飞行后同工酶有差异
的番茄突变体的 RA PD分析显示, 其突变程度分别
为 4. 5%, 1. 3%和 3. 2%。
对空间诱变玉米突变后代的 RAPD 分析发现,
10. 9%的 RAPD 引物能产生多态[ 17] 。对太空椒的
RA PD检测显示,在得到扩增产物的 38个引物中, 4
个产物的扩增物出现差异[ 18] 。
徐建龙等[ 19]对水稻空间诱变后代矮生突变体
的 RAPD分析表明, 2个突变系的矮生性均受 1对
sd1基因控制,与原种之间的多态性分别为 6. 46%
和 4. 05%。研究还显示, 空间诱发变异是一种
DNA 多位点的突变, 而非点突变。余红兵等[ 20] 对
水稻空间诱变后代育性降低突变体的 RAPD分析
表明,引物多态率为 0. 85% , 多态性位点多态率为
0. 17%。
对卫星搭载后 3个基本稳定的绿豆长荚型突变
系进行的 RAPD检测发现, 在 100个引物中, 有 3
个引物在突变系和原始品系间扩增出稳定的多态性
产物,但 3个突变系之间没有发现扩增产物的差异,
52 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
这表明绿豆长荚型突变品系在 DNA 分子水平上已
接近同源,而且突变趋于稳定[ 21, 22]。
采用 RAPD的方法对空间诱变的菜豆、高梁等
的变异后代分析显示, 空间诱变选系在基因组水平
上确实发生了明显的变化 [ 23, 24]。
除了 RAPD标记, SSR标记在植物空间诱变育
种研究中也有一定的应用。
杨存义等[ 25] 随机选用 121对分布于水稻 12条
染色体上的微卫星引物对卫星搭载突变后代的 7个
株系进行检测, 结果发现突变系与亲本之间存在着
不同程度的多态性, 存在多个位点突变。其结果表
明,空间诱变可使植物 DNA 分子多个区段内发生
重复或缺失等结构性变异, 其诱变机理和一般的诱
变因素导致 DNA 少数碱基发生点突变不同。
周峰等 [ 26]选用 299对微卫星引物, 对经卫星搭
载后的 5个突变后代进行的 DNA 多态性分析表
明,变异植株与原种间均存在着不同程度的微卫星
多态性,在有效扩增的 283对引物中,引物多态性频
率介于 0. 35%~ 2. 47%之间, 且多态性位点在水稻
基因组中是随机分布的。
尽管 AFLP 被认为是目前最有效的分子标记
技术,但在植物空间诱变育种研究中的应用还不多
见。贾建航等[ 27] 用 RAPD和 AFLP 技术对空间诱
变的突变菌株与地面对照菌株进行了 DNA 指纹分
析,找出了它们之间的 DNA 多态性, 从而从分子水
平上证实了香菇经空间诱变后遗传物质发生了
变化。
4问题与展望
空间诱变育种技术的特殊性和优越性, 使其作
为植物尤其是农作物遗传育种的一种新途径已受到
国内外育种学家的广泛重视, 在植物诱变育种中的
应用前景也十分广阔。
但是,目前植物空间诱变育种的研究工作多数
还停留在大田突变体的直接筛选上,对引起诱变的
分子生物学、细胞学及生物化学的机理等方面的研
究还较缺乏。
在今后的研究中,应充分利用分子标记技术, 分
析植物空间诱变后代基因型, 鉴定分离群体中含有
目标基因的个体,可以更好地提高选择的预见性及
空间诱变的利用价值。同时, 利用分子生物学的方
法克隆出特异的基因, 通过遗传工程的手段将其转
入到植物基因组中使目标性状得以表达, 可以加快
育种进程。另外, 从分子水平上对变异材料进行分
析,有助于进一步证明诱变的获得以及阐明诱变的
机理,有目的地指导植物空间诱变育种。
可以预见,随着分子生物学和空间诱变育种研
究的发展,分子标记技术在植物空间诱变育种中的
应用会越来越广泛,在推进植物空间诱变育种水平、
阐明空间诱变机理中起到重要作用。
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(下转第 57页)
532006年第 1期 尹淑霞等: 分子标记及其在植物空间诱变育种研究中的应用
( Creeping bentgrass)根际和叶面的定殖和分布情
况。Bae & Knudsen [ 8]以 -葡糖醛酸酶( GUS)和绿
色荧光蛋白( GFP)为选择标记, 用 PEG介导法进行
了 T. harzianum isolate ThzID1 的遗传转化, 并用
筛选出的带标记基因的稳定转化子检测了该生防菌
在土壤中的定殖、生长情况。Atkins等[ 11]以 MDPC
和绿色荧光蛋白作为选择标记, 转化了根结线虫生
防真菌 V. chlamydosporium,但未获得稳定的基因
标记转化子。
5展望
在生物防治过程中, 准确掌握生防微生物在植
物根际和土壤中的消长规律, 是确定生防菌株开发
应用潜力的重要依据 [ 23] ,而且由于对一些作为生防
菌的遗传工程微生物( Genet ically Engineered M-i
croo rganisms, GEM)的基因进行了修饰改造, 插入
或切除了某个基因, 使其生防作用得到了加强,但它
们会不会在环境中任意转移扩散,是否对人类和其
他非目标生物造成不良的影响, 这些都是生物防治
研究中必须解决的问题, 而要解决这些问题, 首先必
须建立一套准确灵敏的检测方法,这就极大地促进
了生防真菌分子检测技术的发展。随着真菌基因标
记技术的不断发展完善, 必将为生防真菌的田间检
测和生态学研究提供有力手段, 进一步推动真菌在
植物病虫害生物防治中应用。
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