全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第4期
收稿日期:2006-03-29
作者简介:厉重先(1957-),女,北京联合大学师范学院应用生物技术系,高级实验师;电话:010-8404371813522577832
纤维素酶促进剂在饲料中的应用初探
厉重先 李鸿玉 刘雪峥
(北京联合大学师范学院应用生物技术系,北京 100011)
摘 要: 采用3.5-二硝基水杨酸(DNS)比色法和重量法,分别研究纤维酶促进剂在鸡饲料中使酶活力提高的作用,取
得良好效果。对不同来源的纤维素酶的扩大实验,进一步证明了促进剂的有效性和普遍性,确定了纤维素酶促进剂应用于饲
料的最佳配比,证明了不同促进剂之间存在明显的协同促进作用。动物体外模拟实验使促进剂更加实用化,结果表明:纤维
素酶促进剂可提高纤维素酶的酶解率,降低饲料成本,提高饲料利用率。
关键词: 纤维素酶 促进剂 饲料
PreliminaryExplorationoftheApplicationofCelulose-
PromoterinFeed
LiChongxian LiHongyu LiuXuezheng
(DepartmentofAppliedBiotechnologyBeijingUnionUniversity,Beijing100011)
Abstract:Byadopting3,5-Dinitrosalicylicacid(DNS)colorimetricmethodandweightmethod(examinationofcrude
fibercontentinfeed),thepaperhasstudiestheroleofincreasingenzymaticactivityoffeedbycelulosepromoterand
hasgainedfineefect.Theexpandedexperimentofceluloseofdiferentsourcehasfurtherprovedtheeficiencyand
popularityofthepromoter,determinedtheoptimalratioofcelulosepromoterappliedinfeed,andprovedthesignificant
synergistpromotingefectbetweendiferentpromoters.Animalinvitrosimulationexperimenthasmadethepromoters
morepractical.Theresultshowsthatcelulosepromotercanincreasetheenzymolysisrateofcelulose,reducefeedcost
andincreasefeedconversionrate.
Keywords:Celulose Promoter Feed
在饲料工业中纤维素酶可作为饲料添加剂水解植物细胞壁,释放营养物质,提高饲料利用率,使动物
胃活力上升,提高粗蛋白的消化率。目前国内外对纤维素酶的研究虽已取得可喜进展,但纤维素酶的酶解
率低,导致纤维素酶糖化过程中酶的消耗量过大,纤维素酶的成本偏高,使得纤维素酶在实际应用中存在
着一定的问题。近年来通过对纤维素酶促进剂的研究初步确定了酶促反应的最适条件,确定了复方促进剂
H、离子促进剂一号、离子促进剂二号,确定了复方促进剂的协同作用,在鸡饲料中酶活力提高实验也取得
良好效果。
1 试验方法
1.1 DNS比色法
1.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制 分别将配制好的浓度为 1mg/ml的标准葡萄糖溶液 2.0ml, 4.0ml,
6.0ml, 8.0ml, 10.0ml,置于 5只 50ml容量瓶中,定容、混匀后,再各取上述溶液 10ml于干燥管中,分别加
入 5mlDNS煮沸 5分钟,以 10ml蒸馏水加入同等体积的 DNS作为参比,分别测定 5种溶液的吸光度。
以葡萄糖的质量为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标,确定葡萄糖曲线及回归方程,计算相关系数 R确
定线性(表 1)。
2006年第4期
表 1 葡萄糖标准曲线测定实验结果
1.1.2 酶活力测定 原理:纤维素经纤维素酶作用后可生成还原糖,还原糖与 3,5-二硝基水杨酸(DNS)混
合生成红色络合物,通过分光光度计比色,在 530nm处进行测定,由葡萄糖标准曲线求出还原糖的浓度,再
确定酶活力。
计算方法:
C=(B×A)/(V×T)
C:酶活力(mg/ml·h) A:酶液稀释倍数
B:葡萄糖含量(mg) V:酶液体积(ml)
T:反应时间(h)
1.2 饲料中粗纤维含量的测定
称取 20000g饲料底物,用乙醚脱脂,放入消煮器内,加入 200ml配制好的硫酸溶液并同时加热,调整
加热器,保持微沸 30min,立坩埚过滤,残渣用热蒸馏水溶液洗入坩埚,抽干。用已配好的 NaOH溶液将坩埚
内的饲料颗粒转移至消煮器,同时加热,调整温度保持微沸 30min,立即用细孔坩埚过滤,残渣用 20ml硫酸
溶液洗入坩埚,并加入 15ml乙醇(95%)洗涤,抽干。坩埚放入烘箱,130℃烘烤 2h,取出称重(m1),将坩埚放
入灰化炉,550℃灰化 30min,取出称重(m2)。
纤维素含量的计算方法
w=(m1-m2)/m×100%
w:纤维素含量 m:称取的饲料质量
2 测定项目及检测
2.1 纤维素酶促进剂促进作用的测定
2.1.1 DNS比色法测定促进剂的促进作用 以鸡饲料为底物,测定促进剂对不同来源的纤维素酶的促进
作用。
2.1.1.1复方促进剂 H号对纤维素酶 1号的促进效果 选用 1号纤维素酶,在其最适反应条件下,分别验
证 1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L、1×10-7g/L的复方促进剂 H对纤维素酶 1号的促进效果,确定
最佳的促进剂浓度(表 2)。
表 2 复方促进剂 H对纤维素酶 1号的促进效果
可见复方促进剂 H在所选择的浓度范围内,对纤维素酶 1号均有促进作用,促进剂浓度依次为 1×10-3g/
L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L时促进效果逐渐增强,浓度小于 1×10-6g/L时,促进效果随浓度降低而减
弱。终体系中促进剂浓度为 1×10-6g/L时,复方促进剂 H对纤维素酶 1号酶活力的促进效果达到 39.4%,效
果最佳。
2.1.1.2 复方促进剂 H对纤维素酶 2号的促进效果 选用 2号纤维素酶,在其最适反应条件下,分别验
证 1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L、1×10-7g/L的复方促进剂 H对纤维素酶 2号的促进效果,确定
最佳促进剂浓度(表 3)。
厉重先等:纤维素酶促进剂在饲料中的应用初探 127
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第4期
表 3 复方促进剂 H对纤维素酶 2号的促进效果
复方促进剂 H在所选择的浓度范围内,对纤维素酶 2号均有促进作用,促进剂浓度依次为 1×10-3g/L、
1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L时促进效果逐渐增强,浓度小于 1×10-6g/L时,促进效果随浓度降低而减弱。
终体系中促进剂浓度为 1×10-6g/L时,复方促进剂 H对纤维素酶 2号酶活力的促进效果达到 34.2%,效果最
佳。
2.1.1.3 离子促进剂一号对纤维素酶 1号的促进效果 选用 1号纤维素酶,在其最适反应条件下,分别验
证 1×10-2g/L、1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L的离子促进剂一号对纤维素酶 1号的促进效果,确定
最佳的促进剂浓度(表 4)。
表 4 离子促进剂一号对纤维素酶 1号的促进效果
离子促进剂一号在所选择的浓度范围内,对纤维素酶 1号均有促进作用,终体系中促进剂浓度为 1×
10-3g/L时,离子促进剂一号对纤维素酶 1号酶活力的促进效果达到 29.0%,效果最佳。
2.1.1.4离子促进剂一号对纤维素酶 2号的促进效果 选用 2号纤维素酶,在其最适反应条件下,分别验证
1×10-2g/L、1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L的离子促进剂一号对纤维素酶 2号的促进效果,确定最
佳的促进剂浓度(表 5)。
表 5 离子促进剂一号对纤维素酶 2号的促进效果
离子促进剂一号在所选择的浓度范围内,对纤维素酶 2号均有促进作用,终体系中促进剂浓度为 1×
10-3g/L时,离子促进剂一号对纤维素酶 2号酶活力的促进效果达到 31.6%,效果最佳。
2.1.1.5 离子促进剂二号对纤维素酶 1号的促进效果 选用 1号纤维素酶,在其最适反应条件下,分别验
证 1×10-2g/L、1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L的离子促进剂一号对纤维素酶 1号的促进效果,确定
最佳的促进剂浓度(表 6)。
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2006年第4期
离子促进剂二号在所选择的浓度范围内,对纤维素酶 1号均有促进作用,终体系中促进剂浓度为 1×
10-4g/L时,离子促进剂二号对纤维素酶 1号酶活力的促进效果达到 23.3%,效果最佳。
2.1.1.6离子促进剂二号对纤维素酶 2号的促进效果 选用 2号纤维素酶,在其最适反应条件下,分别验
证 1×10-2g/L、1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L的离子促进剂一号对纤维素酶 1号的促进效果,确
定最佳的促进剂浓度(表 7)。
表 7 离子促进剂二号对纤维素酶 2号的促进效果
离子促进剂二号在所选择的浓度范围内,对纤维素酶 2号均有促进作用,终体系中促进剂浓度为 1×
10-4g/L时,离子促进剂二号对纤维素酶 2号酶活力的促进效果达到 27.8%,效果最佳。
实验证明,以鸡饲料为底物时,复方促进剂 H、离子促进剂一号、二号对于所选择的两种酶均有比较明
显的促进作用,促进剂浓度为 1×10-4g/L时促进作用最佳。
2.1.2 重量法测定纤维素酶促进剂的促进作用 采用 DNS比色法测定纤维素酶促进剂的促进作用时,由
于饲料中含糖量较高要做前期处理,否则对实验有干扰,为验证促进剂可直接作用于饲料中的纤维素酶,
采用重量法(饲料中粗纤维素含量的测定),测定反应前后纤维素含量变化,从另一角度做佐证了纤维素酶
促进剂的促进作用。
在由复方促进剂 H、纤维素酶(1号、2号)、饲料所构成的酶促反应体系中,将实验分为四批进行,按
1.2所述的方法操作。
第一批:称取 20000g饲料加入 15ml蒸馏水,于 50℃恒温震荡 1h,取出后经沸水浴 5min、流水冷却 1
分钟后,按实验方法操作,测定纤维素含量。
第二批:称取 20000g饲料加入 2ml酶液、13ml蒸馏水,于 50℃恒温震荡 1h,取出后经沸水浴 5min、流水
冷却,按实验方法操作,测定纤维素含量。
第三批:称取 20000g饲料加入 2ml酶液、2ml复方促进剂 H溶液(1×10-5g/L)和 11ml蒸馏水,于 50℃
恒温震荡 1h,取出后经沸水浴 5min、流水冷却,按实验方法操作,测定纤维素含量。
第四批:以 1×10-6g/L的复方促进剂 H溶液重复第三批操作通过比较第四批实验所的结果,验证复方
促进剂 H的促进效果(表 8)。
比较四批实验结果可见:
(1)饲料中纤维素含量约 19.6%,1×10-5g/L复方促进剂 H对两种酶的促进作用分别为 19.25%、
20.03%,1×10-6g/L复方促进剂 H对两种酶的促进作用分别为 28.25%、24.08%;
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第4期
(2)复方促进剂 H对纤维素酶 1号的促进效果好于纤维素酶 2号,该结论与 DNS比色法中所得到的
结论一致。
2.1.3 促进剂对纤维素酶 1号的协同促进作用 以鸡饲料为底物,以不同促进剂的最佳浓度为基础,用正
交实验法测定复方促进剂 H、离子促进剂一号、二号对 1号、2号纤维素酶的协同促进作用。
2.1.3.1 促进剂对纤维素酶 1号的协同促进作用 选用 1号纤维素酶,在最适反应条件下,按表 9中浓度
配比加入复方促进剂 H、离子促进剂一号、二号各 2ml,测定促进剂的协同促进作用(表 10)。
从表中可见:
(1)对于纤维素酶 1号,促进剂存在显著的协同作用,最佳组方为 2、1、2,即复方促进剂 H1×10-6g/L、离
子促进剂一号 1×10-3g/L、离子促进剂二号 1×10-4g/L,均为 3中促进剂作用的最佳浓度;
(2)上述实验中,第四组的酶活提高率最大,第二、第四、第九组的酶活提高率均非常显著;
(3)从极差中分析得知,在 3中促进及共同作用时,离子促进剂二号对协同作用的结果影响最大,复方
促进剂 H次之,而离子促进剂一号对结果的影响最小;
(4)以协同作用的最佳组方进行实验,A=0.230,酶活提高率达到 104%,高于上述实验中第四组的酶活
提高率。
2.1.3.2 促进剂对纤维素酶 2号的协同促进作用 选用 2号纤维素酶,在最适反应条件下,分别按表 6、7
中浓度配比加入复方促进剂 H、离子促进剂一号、二号各 2ml, 测定促进剂的协同促进作用(表 12)。
从表中可见:
(1)对于纤维素酶 2号,促进剂存在显著的协同作用,最佳组方为 3、3、2,即复方促进剂 H1×10-6g/L、离
子促进剂一号 1×10-3g/L、离子促进剂二号 1×10-4g/L,均为 3种促进剂作用的最佳浓度;
(2)上述实验中,第九组的酶活提高率最大,第二、第四、第九组的酶活提高率均非常显著;
(3)从极差中分析得知,在 3种促进及共同作用时,离子促进剂二号对协同作用的结果影响最大,复方
促进剂 H次之,而离子促进剂一号对结果的影响最小;
表 9 正交实验
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2006年第4期
(4)以协同作用的最佳组方进行实验,A=0.214,酶活提高率达到 108%,高于上述实验中第九组的酶活
提高率。
可见促进剂之间存在显著的协同促进作用,对两种不同的纤维素酶,促进剂协同作用的最佳组方一致。
2.1.4 动物体外模拟实验 动物体内环境与实验最佳条件有所不同,模拟动物体内的温度、pH,测定促进
效果。
1号纤维素酶的动物体外模拟实验(表 13)。
可见在模拟动物体内环境下,3种促进剂对纤维素酶 1号、2号均有促进效果,协同作用对酶的促进效
果最好。
与酶促反应的最佳条件相比,在模拟动物体内环境下促进剂的促进效果偏低。
3 试验结论
(1)在饲料中添加纤维素酶促进剂可显著提高饲料利用率,单方可提高30%左右,复方可提高约80%。
表 10 促进剂对纤维素酶 1号的协同促进作用
表 11 正交实验
厉重先等:纤维素酶促进剂在饲料中的应用初探 131
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第4期
(2)对不同来源的纤维素酶(酶活不同、厂家不同)的实验中均有良好促进效果。此促进剂具有广泛的
使用性,并有良好的可推广价值。
(3)纤维素酶促进剂为生物制剂,安全、可靠、无毒。
参 考 文 献
1 LulzenNW,NielsenMH,OxenboelKM,etal.Philosophical.TransactionsoftheRoyalSocietyofLondon[M],1993,283～300.
2 关铜,张世华.贵州畜牧兽医,2003,27(5):7.
3 谢占玲,吴润,李秀萍,杨家华.中国兽医科技,2003,33(9):45.
4 张海棠,王自良,郭东升.中国饲料,2000,33(11):14～16.
5 刘妙莲,王洁.精细与专用化学品,2002,(14):13～15.
表 12 促进剂对纤维素酶 2号的协同促进作用
表 13 纤维素酶 1号的动物体外模拟实验
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