全 文 ：宜宾学院学报 Journal of Yibin University 优先数字出版

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收稿日期：2017-01-04 修回：2017-01-13
基金项目：安徽省教育厅自然科学基金重点课题（KJ2016A500）；亳州市中药科技创新团队项目（BZ2013zzb06）
作者简介：王庆（1982-），女，讲师，硕士，研究方向为中药活性成分提取分离
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杠板归多糖的纤维素酶提取工艺及体外抗氧化作用
王 庆，薛天乐，丁 锐
（亳州职业技术学院 药学院，安徽亳州 236800）


摘 要：采用单因素试验结合正交试验的方法对杠板归多糖提取工艺进行优选，并对其羟自由基清
除作用、超氧阴离子清除作用和还原能力进行研究。结果表明，最佳提取工艺为酶浓度为 5 mg/mL、
温度为 50 ℃、水料比为 30∶1 (mL/g)、时间为 120 min，在此工艺条件下，杠板归多糖的提取率可
达 3.68%。杠板归多糖对羟自由基的最大清除率为 78.56%，IC50 = 0.442 mg/mL，对超氧阴离子的最
大清除率为 89.81%，IC50 = 0.297 mg/mL，杠板归多糖还具有一定的还原能力。
关键词：杠板归；多糖；纤维素酶；提取工艺；抗氧化
中图分类号：R284.2
The Cellulase Extraction Technology and Antioxidant Activity of Polygonum perfoliatum
L. Polysaccharide
WANG Qing, XUE Tianle, DING Rui
(College of Pharmacy, Bozhou Vocational and Technicel College, Bozhou, Anhui 236800, China)
Abstract: To optimize extraction technology of Polygonum perfoliatum L. polysaccharide with a single-
factor test and orthogonal, then, to study hydroxyl free radical scavenging effect, superoxide anion
scavenging effect and reducing power of Polygonum perfoliatum L. polysaccharide. The experimental result
indicated that the optimal extraction condition is cellulase concentration 5 mg/mL, extraction temperature
50 ℃ water material ratio 30:1 (mL/g), extraction time 120 min. Under these conditions, the yield of
Polygonum perfoliatum L. Polysaccharide are 3.68%. The maximum scavenging rate of polysaccharide to
hydroxyl radical is 78.56%, IC50=0.442 mg/mL. The maximum scavenging rate of polysaccharide to
superoxide anion is 89.81%, IC50=0.297 mg/mL. Polygonum perfoliatum L. Polysaccharide also has a certain
reduction force.
Keywords: Polygonum perfoliatum L.; polysaccharides; cellulase; extraction technology; antioxidant
activity

蓼科（Polygonaceae）植物杠板归（Polygonum perfoliatum L.）别名蛇倒退、贯叶蓼，
其酸，微寒。归肺、膀胱经，具有清热解毒，利水消肿，止咳的功效[1]。现代药理研究
表明，杠板归具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、抑制肝纤维化等作用[2-5]，目前，对于
杠板归的研究主要集中在黄酮类化合物方面[6-8]，对其所含其它化学成分研究较少。杠板
归所含成分复杂，活性多样，为综合开发利用杠板归资源，必须对其进行全面研究。近
年来随着研究的深入，以往作为杂质除去的多糖被发现具有抗肿瘤、抗病毒、提高免疫
力等多种活性，进而成为研究热点之一[9]。目前对于杠板归多糖的研究较少，仅有黄家
伟等应用丙酮沉淀法研究了杠板归多糖的提取工艺[10]，而酶技术应用于中草药有效成分
的分离提取取得了不少新的成果，尤其是应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构，加速
药用有效成分的溶出，提高药用有效成分的提取率[11-13]，因此本试验采用单因素结合正
交试验的方法研究杠板归多糖的纤维素酶提取工艺，并对其抗氧化性进行探讨，以期能
2017-01-20 11:13:46
http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1630.Z.20170120.1113.002.html
DOI：10.19504/j.cnki.issn1671-5365.20170120.001
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为杠板归的综合开发利用提供数据基础。
1 材料与仪器
1.1 试验材料
杠板归饮片（安徽省亳州市三义堂药业有限责任公司，产地安徽，批号 20150902），
纤维素酶（山东西亚化学工业有限公司，批号 L54738，酶活力为 10万 U/g），D-葡萄
糖（中国食品药品检定研究院，批号 110833-201509）、抗坏血酸（Vc）、苯酚、乙醇、
乙醚、氯仿、正丁醇、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷、浓硫酸、浓
盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等均为分析纯。
1.2 试验仪器
RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），V-5800紫外可见分光光度计（上
海元析仪器有限公司），800B型离心机（上海安亭科学仪器厂），DHG-9070A电热恒
温鼓风干燥箱（上海秼马恒温设备厂），pHS-3E型 pH计（上海精科仪器有限公司），
AUY220 电子分析天平（津岛国际贸易上海有限公司），SHB-III 循环水式多用真空泵
（郑州长城科工贸有限公司），HH-4恒温水浴锅（金坛市宏华仪器）。
2 试验方法
2.1 标准曲线的制备[14]
精确称取干燥至恒重的 D-葡萄糖 5.2 mg，用蒸馏水定溶于 50 mL的量瓶中，得对
照品溶液。准确移取对照品溶液 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置于 10 mL量瓶中，
蒸馏水定容至刻度线，摇匀。再分别移取上述各溶液 2.0 mL在 6支 10 mL的具塞试管
中，各加 5%的苯酚溶液 1.0 mL，然后迅速加入浓硫酸 5.0 mL，静置 10 min后，立即置
于 40 ℃水浴锅 15 min取出，冷却至室温，在波长 490 nm处测其吸光度，以 D-葡萄糖
浓度作为横坐标、吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程： y = 11.21 x + 0.0025
（ 2R = 0.9992），说明为葡萄糖在 0 ~ 0.0832 mg/mL之间具有良好的线性。
2.2 供试品溶液的制备及多糖提取率测定
杠板归烘干，粉碎，准确称取干燥至恒重的杠板归粉末 2.0 g，在水浴锅中以不同设
计条件进行提取，提取终点 90 ℃水浴灭酶 10 min，滤过，同法提取 3次，合并滤液，
70 ℃减压浓缩至约 20 mL，加入约 5倍体积的无水乙醇沉淀、离心，收集沉淀，Sevage
法除去蛋白质[15]，蒸馏水定容至 100 mL的量瓶中，从该量瓶中取 1.0 mL用蒸馏水再次
定容到 100 mL的量瓶中，得供试品溶液。准确吸取 2.0 mL 供试品溶液至 10 mL的具
塞试管中，按“2.1”节的方法测算多糖浓度，并按下式计算多糖提取率：
310 100%C n
m
−× ×
= ×多糖提取率
式中，C是多糖的浓度(mg/mL)， n为稀释倍数(104)，m是样品的质量(g)。
2.3 方法学考察
（1）精密度试验：精密量取葡对照品溶液 2.0 mL，按照“2.1”节的方法测定吸光
度，重复测定 5次， RSD = 0.11%，表明该方法的精密度良好。
（2）重复性试验：精密称取杠板归粉末 2.0 g，共 5份，按照“2.2”节的方法制备
供试液，再按照“2.1”节的方法测定吸光度值，RSD = 1.7%，表明该方法的重复性良好。
（3）稳定性试验：精密称取杠板归粉末 2.0 g，按照“2.2”项方法制备供试品溶液，
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按照“2.1”节的方法于 0、2、4、6、8、12、24 h测定吸光度，RSD = 1.4%，表明供试
品溶液在 24 h内稳定。
（4）加样回收率试验：精密称取杠板归粉末 2.0 g，按照“2.2”节的方法制备供试
液，分别相同体积的供试品溶液中加入不同量对照品溶液，按照“2.1”节的方法测定吸
光度值，求得平均回收率为 99.7%， RSD = 1.2%，结果表明该方法回收率良好。
2.4 单因素试验
在其他影响因素相同的条件下，分别研究时间（30、60、90、120、150 min）、温
度（30、40、50、60、70 ℃）、酶浓度（1、2、3、4、5、6 mg/mL），水料比（10∶1、
20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g）这 4个单因素对杠板归多糖提取率的影响。
2.5 正交试验设计
根据单因素试验结果，在提取时间、提取温度、酶浓度和水料比这 4个影响因素
中，每个因素选择 3个较优水平，进行正交设计，优选最佳提取工艺。
2.6 体外抗氧化测定
（1）杠板归多糖对羟自由基的清除作用[16-17]
向供试试管中加入 2.0 mmol/L水杨酸 1.0 mL，0.15 mmol/L 硫酸亚铁 2.5 mL、6.0
mmol/L过氧化氢 2.5 mL，1.0 mL的浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL
的多糖溶液，最后加入 2.0 mL蒸馏水。以蒸馏水替代多糖溶液作为空白，以蒸馏水替代
水杨酸作为对照。上述 3组试管，取出冷却至室温，蒸馏水调零，在 510 nm波长处分
别测定吸光度。设 3个平行测试，取平均值。以抗坏血酸（Vc）作阳性对照。羟自由基
的清除率计算式为：
-( - )
100%
A A A
A
×对照空白 供试
空白
清除率=
（2）杠板归多糖对超氧阴离子的清除作用[17-18]
向供试试管中分别加入 1.0 mL的浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL
的多糖溶液、6 mL Tris-HCl （pH=8.2）缓冲溶液，混匀，37℃水浴恒温 20 min，再分别
加入 37℃预热的 7 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液 1.0 mL，摇匀，反应 4 min后加入浓 HCl
溶液终止反应，以蒸馏水替代多糖溶液作为空白。蒸馏水调零，在 325 nm 波长处分别
测定吸光度。设 3个平行测试，取平均值。以抗坏血酸（Vc）作阳性对照。超氧阴离子
的清除率计算式为：
-
100%
A A
A
×空白 供试
空白
清除率=
（3）杠板归多糖的还原能力[19]
向供试试管中分别加入 1.0 mL的浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL
的多糖溶液、2 mol/L（pH=6.6）的磷酸缓冲液 2.0 mL、1%铁氰化钾溶液，摇匀，50 ℃
水浴恒温反应 20 min，取出冷却至室温，加入 10%三氯乙酸 2.0 mL终止反应。领取试
管，取上述反应液 2.0 mL、蒸馏水 2.0 mL和 0.1%三氯化铁 0.4 mL混均，避光反应 30
min，蒸馏水调零，在 700 nm波长处分别测定吸光度。设 3个平行测试，取平均值。以
抗坏血酸（Vc）作阳性对照。
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3 结果与分析
3.1 单因素试验结果
（1）时间对多糖提取率的影响
图 1是多糖提取率随时间变化的情况。图 1显示，多糖提取率随时间呈先上升后下
降的趋势，最高点出现在 120 min，之后开始下降。下降可能是因为提取时间过长，提
取的多糖分子键断裂，在后来的醇沉和去蛋白的过程中损失所致。

图 1 提取时间对多糖提取率的影响
Fig.1 Influence of extraction time on polysaccharide extraction rate
（2）温度对多糖提取率的影响
图 2表明了多糖提取率与温度变化的关系，可见多糖提取率在温度为 50 ℃时最高，
随后开始下降。因为温度过高影响了酶的活性，故而导致提取率下降。

图 2 提取温度对多糖提取率的影响
Fig.2 Influence of extraction temperature on polysaccharide extraction rate
（3）酶浓度对多糖提取率的影响
图 3反映了多糖提取率受酶浓度影响的情况。由图 3可以看出，多糖的提取率随着
0
1
2
0 30 60 90 120 150 180
多
糖
提
取
率
/%
提取时间 /min
0
1
2
3
20 30 40 50 60 70 80
多
糖
提
取
率
/%
提取温度 /℃
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酶浓度的上升而不断上升。但当浓度超过 5 mg/mL时，提取率不再增加，这是因为此时
所有底物都与酶结合，增加酶浓度，已没有多余的底物与之结合。

图 3 纤维素酶浓度对多糖提取率的影响
Fig.3 Influence of cellulase concentration on polysaccharide extraction rate
（4）水料比对多糖提取率的影响
图 4 表明多糖的提取率是随着加水量的增加而不断增加的，但当加水量超过 30 倍
时，提取率几乎不再变化，考虑到加水量大不仅造成资源浪费，而且会对后续操作带来
困难，所以水料比为 30∶1为比较适合的提取条件。

图 4 水料比对多糖提取率的影响
Fig.4 Influence of ratio of water to material on polysaccharide extraction rate
3.2 正交试验结果与分析
表 1-3是酶浓度、温度、时间、水料比四个因素正交试验的情况。结合表 2和表 3
可以看出，四个因素中酶浓度对提取率有显著影响（ P < 0.05），其他因素影响不显著，
其影响顺序为：酶浓度>温度>时间>水料比，最佳提取条件为酶解时间为 120 min，水浴
温度为 50 ℃、酶浓度为 5 mg/mL、水料比为 30:1。
0
1
2
3
4
0 1 2 3 4 5 6 7
多
糖
提
取
率
/%
酶浓度 /(mg/mL)
1
2
3
4
5
0 10 20 30 40 50 60
多
糖
提
取
率
/%
加水量 /倍
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表 1 正交试验因素水平表
Table 1 Orthogonal factor level table
水平 时间 /min 温度 /℃ 酶浓度 /(mg/ML) 水料比 /(mL/g)
1 90 40 3 20
2 120 50 4 30
3 150 60 5 40
表 2 正交试验结果表
Table 2 Orthogonal test results table
试验号 时间 /min 温度 /℃ 酶浓度 /(mg/ML)
水料比
/(mL/g) 提取率 /%
1 1 1 1 1 1.17
2 1 2 2 2 2.66
3 1 3 3 3 3.11
4 2 1 2 3 2.53
5 2 2 3 1 3.54
6 2 3 1 2 2.17
7 3 1 3 2 3.39
8 3 2 1 3 2.06
9 3 3 2 1 2.62
均值 1 2.313 2.363 1.800 2.443
均值 2 2.747 2.753 2.603 2.740
均值 3 2.690 2.633 3.347 2.567
极差 0.434 0.390 1.547 0.297
表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 F值 显著性
时间 0.333 2 2.504
温度 0.239 2 1.797
酶浓度 3.590 2 26.992 P < 0.05
水料比（误差） 0.133 2 1.000
F0.05(2,2)=19.00， F0.01(2,2)=99.00
3.3 工艺验证
正交设计不包括最佳工艺组合，需做验证试验。准确称取 5份杠板归粉末，每份 2.0
g，分别以最佳提取工艺进行提取，测算多糖的提取率，结果在最佳工艺条件下，杠板归
多糖的提取率分别为 3.72%、3.42%、3.58%、3.88%、3.81%，平均为 3.68% （ RSD =
1.8%， n =5），高于正交试验中任何一组，且稳定性较好。
3.4 体外抗氧化测定
（1）杠板归多糖对羟自由基的清除作用
图 5反映了 Vc和杠板归多糖对羟自由基的清除情况。可见，随着浓度的增加，Vc
和杠板归多糖对羟自由基的清除率都在不断增加，在浓度小于 0.4 mg/mL时，杠板归多
糖对羟自由基的清除率高于 Vc，浓度在 0.4 mg/mL 以上时，杠板归多糖对羟自由基的
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清除率低于 Vc，两者对羟自最大由基的清除率，杠板归多糖为 78.56%（多糖浓度=2.0
mg/mL），Vc为 92.58%。所得数据应用 PASW Statistics 18.0软件进行分析，得 Vc对
羟自由基的 IC50为 0.442 mg/mL，杠板归多糖对羟自由基的 IC50为 0.480 mg/mL，说明
杠板归多糖有较强的清除羟自由基作用。

图 5 杠板归多糖对羟自由基的清除作用
Fig.5 The free radicals scavenging effect to hydroxy radical of polysaccharide of Polygonum
perfoliatum L.
（2）杠板归多糖对超氧阴离子的清除作用
杠板归多糖对超氧阴离子的清除作用如图 6所示。由图 6可以看出，杠板归多糖对
超氧阴离子的清除率明显高于 Vc，当多糖浓度为 1.5 mg/mL 时，杠板归多糖对超氧阴
离子的清除率最大，为 89.81%，Vc 对超氧阴离子的最大清除率为 76.36%（浓度=1.0
mg/mL）。利用 PASW Statistics 18.0软件对试验数据进行分析，得 VC对超氧阴离子的
IC50为 0.685 mg/mL，杠板归多糖对超氧阴离子的 IC50为 0.297 mg/mL，说明杠板归多
糖有很强的清除超氧阴离子作用，并且明显高于 Vc。

图 6 杠板归多糖对超氧阴离子的清除作用
Fig.6 The free radicals scavenging effect to superoxide anion of polysaccharide of Polygonum
perfoliatum L.
0
20
40
60
80
100
0 0.5 1 1.5 2 2.5
清
除
率
/%
浓度 /(mg/mL)
Vc
杠板归多糖
0
20
40
60
80
100
0 0.5 1 1.5 2 2.5
清
除
率
/%
浓度 /(mg/mL)
Vc
杠板归多糖
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（3）杠板归多糖的还原能力
杠板归多糖具有一定的还原能力（见图 7）。由图 7可以看出，随着浓度的增加，
Vc 对羟自由基的清除率都在不断增加，表现出较强的还原性，而杠板归多糖还原力增
加缓慢，弱于 Vc。

图 7 杠板归多糖的还原作用
Fig.7 The reduction of polysaccharide of Polygonum perfoliatum L.
4 结论与讨论
通过单因素试验结合正交试验优选杠板归多糖的提取工艺，并其进行抗氧化性研究，
结果表明：
四个因素对多糖提取率影响依次为：酶浓度>温度>水料比>时间，酶浓度对提取率
有显著影响，最佳提取条件为时间 120 min、温度 50 ℃、酶浓度 5 mg/mL、水料比（mL/g）
30∶1，在最佳工艺条件下，杠板归多糖的提取率可达 3.68%。
杠板归多糖对羟自由基有较强的清除作用，最大清除率为 78.56%，IC50 为 0.480
mg/mL。对超氧阴离子的清除率很强，最大清除率为 89.81%，IC50=0.297 mg/mL，明显
高于 Vc对照品（最大清除率为 76.36%，IC50=0.685 mg/mL）。杠板归多糖具有一定的
还原能力。
本研究表明，利用纤维素酶提取技术可以有效提高杠板归多糖的提取率，且杠板归
多糖具有较强的体外抗氧化活性，可以作为药品或功能性食品进行开发，具有广阔的市
场前景。
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0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6 8
吸
光
度
浓度 /(mg/mL)
Vc
杠板归多糖
宜宾学院学报 王庆，薛天乐，丁锐：杠板归多糖的纤维素酶提取工艺及体外抗氧化作用 优先数字出版 (9)

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