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酶法结合超声波提取粉葛葛根素的研究
李甜甜1，傅 舒2，3，刘晓风2，李 东2，王舒雅1，郑 涛1，*
(1.南京工业大学，江苏南京 211816;2.中国科学院成都生物研究所，四川成都 610041;
3.中国科学院大学，北京 100049)
收稿日期:2014－08－21
作者简介:李甜甜(1989－) ，女，硕士，研究方向:天然产物提取。
* 通讯作者:郑涛(1982－) ，男，博士，研究方向:生物质能源化利用、生物电化学合成、天然产物绿色提取技术等。
基金项目:中国科学院环境与应用微生物重点实验室开放基金项目(KLCAS－2013－05) ;江苏省自然科学基金(BK20130932) ;江苏省高校自然科
学基金(13KJB530009)资助。
摘 要:目的:以提高粉葛葛根素的得率为目的。方法:在优选出纤维素酶结合超声波的方法基础上，采用单因素实验
和响应面实验法，对影响酶解反应的主要因素进行了优化。结果:最佳酶解反应条件为固液比 1∶31(g /mL)、酶解时间
9.8h、酶添加量 31.84U /g，超声条件为功率 150W、频率 40kHz、时间 30min。在此条件下得率为 0.728%，比优化前提高
15.37%，比单纯超声波提取法和传统乙醇浸提法分别高出 24.7%和 28.0%。结论:初步建立了纤维素酶结合超声波技
术提取粉葛葛根素的最优工艺条件。
关键词:纤维素酶，粉葛，葛根素，因素，响应面分析
Ｒesearch of enzymatic hydrolysis assisted ultrasonic for
extraction of puerarin from Kudzu
LI Tian－tian1，FU Shu2，3，LIU Xiao－feng2，LI Dong2，WANG Shu－ya1，ZHENG Tao1，*
(1.Collage of Biotechnology and Pharmaceutical，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，China;
2.Chengdu Institute of Biology，Academy of Sciences，Chengdu 610041，China;
3.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract:To increase yield of puerarin，enzymatic hydrolysis assisted ultrasonic extraction was used to extract
puerarin from Kudzu.A Box－Benhnken design(BBD)involving three main variables such as solid － liquid ratio，
enzymatic time and enzyme dosage at three levels was employed based on single factor experiments.The optimal
values of these variables were determined by response surface analysis.The optimal conditions were as follows:
solid－ liquid ratio of 1∶31(g /mL)，enzymatic time of 9.8h and enzyme dosage of 31.84U/g.Moreover，the validity of
the established model was verified.The experimental yield of puerarin of 0.728% was in good agreement with the
predicted one of 0.723%，which was 15.37% higher than unoptimized group and separately 24.7% and 28.0%
higher than ultrasonic extraction and ethanol extraction methods.
Key words:cellulase;Kudzu;Puerarin;factors;response surface analysis
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2015)13－0175－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 13． 028
葛素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美称，是国家
卫生部首批批准的药食同源药食两用植物［1－2］。葛
根为豆科多年生落叶藤本植物甘葛藤(P.thomsoni
Benth)的干燥根，富含葛根淀粉和葛根黄酮(含量约
为 1% ～12%)。其中葛根黄酮的主要成分为葛根素、
大豆苷、大豆苷元等，具有抗癌、抗衰老、降低胆固
醇、治疗心脑血管疾病、解酒等功效［3－5］，因此，对葛
根有效成分的提取方法的研究对开发该植物资源具
有重要意义。
目前，葛根素的提取分离方法有回流法、渗漉
法、浸渍法、煎煮法等［6－7］，但存在原料消耗大、产率
低、提取时间长的问题［8］。近年来，酶技术作为新的
强化提取技术发展迅速，具有传质速率高，能耗低、
有机溶剂用量少、提取物稳定等特点。纤维素酶可
降解 β－1，4 糖苷键从而破坏植物细胞壁，加速有效
成分的溶出，提高有效成分的提取率［9－10］。邢秀芳
等［11］将纤维素酶用于葛根异黄酮的提取工艺中，通
过对比实验加酶处理得到的样品比未加酶的葛根异
黄酮的收率提高了 13%。超声提取法是近年来较新
型的提取方法，超声空化作用有助于破坏细胞膜，促
进物质释放与溶出，且超声波的不断振荡和热效应
有助于溶质扩散，具有效率高、提取时间短、能耗低、
节约溶剂等优点，已广泛应用于化合物及生物活性
成分等物质的提取［12－13］。
176
酶法结合超声波技术用于天然产物活性成分的
提取，已有相关报道，例如灵芝多糖、山楂总黄酮
等［14－15］，但将该技术用于提取葛根中有效成分至今未
见文献报道。因此，本文对酶解提取葛根素的主要
影响因素进行研究，并通过响应面优化法得出了纤
维素酶结合超声波技术提取粉葛葛根素的最优工艺
条件，为葛根素的工业化提取和相关功能性食品或
药物的开发提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
葛根 粉葛，采集于江西省上饶横峰葛源镇。
将采集样品洗净，去除表面泥沙，晾干、切成片状，于
60℃烘干、粉碎，过 60～80 目筛后于干燥器中保存备
用;葛根素对照品(纯度≥98%) 国药品生物制品
检定所;纤维素酶 Celluclast 1.5L(反应最适温度
45℃，滤纸酶活(自测)为 31.84U /mL) 诺维信
公司。
HITACHI L2000 高效液相色谱仪 美国安捷伦
公司;KQ3200DE型数控超声波仪 昆山市超声仪器
有限公司;数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;
FA2004N电子分析天平 上海精密科学仪器有限
公司。
1.2 实验方法
1.2.1 葛根素提取
1.2.1.1 乙醇浸提法 准确称取若干份粉葛样品
1.000g于 100mL锥形瓶中，加入 70%乙醇，使固液比
为 1∶20，提取温度 70℃，浸提 2h。结束后离心得上清
液并量取体积。
1.2.1.2 超声提取法 准确称取若干份粉葛样品
1.000g于 100mL锥形瓶中，加入 70%乙醇，使固液比
为 1 ∶ 20，提取温度 60℃，提取 30min。用功率为
150W、频率为 40kHz 的超声波器提取。结束离心得
上清液并量取体积。
1.2.1.3 纤维素酶结合超声波提取法 准确称取若
干份葛根样品 1.000g 于 100mL 锥形瓶中，45℃自然
pH 下酶解一定时间，酶解结束后离心收集上清液
Ⅰ。固体残渣按 1.3.2 超声提取条件进行提取，然后
离心得上清液Ⅱ。合并上清液Ⅱ和Ⅰ所得待测液并
量取体积。
1.2.2 葛根素得率的测定 将以上三种方法所得待
测液过 0.45μm微孔滤膜过滤后，采用 HPLC 法测定
葛根素浓度，并计算得率。HPLC 条件是:流动相为
甲醇∶水 25∶75，流速 1.0mL /min，柱温 30℃，检测波长
250nm，进样量 5μL。标准曲线的制定:称取葛根素
标准样品，用甲醇配制成 0.5mg /mL 的溶液，作为对
照品溶液。按照一定梯度精密稀释成一系列标准溶
液，以峰面积为 Y值，葛根素(mg /mL)为 X值计算标
准曲线方程:Y = 9 × 10 －7 X + 32183，Ｒ2 = 0.9999。待
测液的测定:分别取所得的待测液，供 HPLC 测定分
析。根据峰面积计算上清液中葛根素的得率。
葛根素得率(%)= c × v × nm × 100
式中:浓度 c(mg /mL) ;v 为上清液体积(mL) ;n
为:稀释倍数;m为粉葛重量(mg)。
1.2.3 纤维素酶结合超声波提取葛根素的单因素
实验
1.2.3.1 酶解时间对葛根素得率的影响 加入 70%
乙醇溶液 15mL，酶添加量为 0.2mL /g，分别酶解 2、4、
6、8、10、12、13h，反应结束后处理方法同 1.2.1.3。
1.2.3.2 酶解固液比对葛根素得率的影响 酶添加
量为 0.2mL /g，加入 70%乙醇溶液，使固液比分别为
1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g /mL)，酶解 2h，反
应结束后处理方法同 1.2.1.3。
1.2.3.3 酶添加量对葛根素得率的影响 加入 70%
乙醇溶液 20mL，酶解时间 2h，酶添加量分别为 0、
0.5、1、1.5、2、2.5(mL /g)，反应结束后处理方法同
1.2.1.3。
1.2.4 纤维素酶结合超声波提取粉葛葛根素的响应
面优化实验 响应面分析法(Ｒesponse Surface
Methodology)是一种寻找多因素系统中最佳条件的
数学统计方法［16－17］。在单因素实验结果的基础上，
进行 3 因素 3 水平的 Box－Behnken 设计，各因素的
低、中、高水平分别以(－1，0，1)表示，见表 1。获得
实验数据后，进行二次回归拟合，得到带交互项和
平方项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效
应，最后在一定水平范围内确定最优实验条件，并
进行验证。
表 1 响应面分析因素及水平表
Table 1 Factors and levers of
response surface Box－Benhnkens design
因素
水平
低水平
(－ 1)
中水平
(0)
高水平
(+ 1)
X1 固液比(g /mL) 8 10 12
X2 酶解时间(h) 1∶25 1∶30 1∶35
X3 酶添加量(mL/g) 1 1.5 2
2 结果与分析
2.1 不同处理方法的葛根素得率
不同处理方法的葛根素得率见表 2，用超声波
提取法所得的葛根素的得率比乙醇浸提法所得的
葛根素的得率只提高了 2.6%，但是提取时间大大
缩短。粉葛经酶解后采用超声辅助提取法所得葛
根素的得率比乙醇浸提法和超声波提取法分别提
高了 10.9%和 8.05%。为了进一步提高粉葛中葛
根素的得率，以下采用酶解与超声波辅助提取相结
合的方法提取粉葛葛根素，并对酶解的主要影响因
素进行研究。
表 2 不同提取方法的葛根素得率
Table 2 Yield of puerarin with different approach method
提取方法
葛根素提取
得率(%)
提取时间
(h)
乙醇浸提法 0.569 2
超声波提取法 0.584 0.5
酶法结合超声提取法 0.631 2.5
177
2.2 纤维素酶结合超声波提取葛根素的单因素实验
2.2.1 酶解时间对葛根素得率的影响 酶解时间对
葛根素得率的影响，结果见图 1。随着酶解时间的增
加，葛根素得率也随之增加。增加酶解时间能使原
料中物质溶解的更加充分，当酶解时间为 10h 时葛
根素得率到达到最大值，继续增加酶解时间反而使
葛根素得率下降，这可能是黄酮类物质本身易被氧
化，过长时间的提取会破坏其结构，从而降低葛根素
得率［18］，且提取时间越长能耗及其它经济成本越大，
故 10h为较合适的酶解时间。
图 1 酶解时间对葛根素得率的影响
Fig.1 Effect of enzymatic time on yield of puerarin
2.2.2 酶解固液比对葛根素得率的影响 根据传质
速率方程［19］，溶剂的质量体积比即固液比是影响提
取速率和提取得率的主要因素之一，酶解固液比对
葛根素得率的影响结果见图 2。随着固液比的增加，
葛根素得率也随之增加，固液比为 1∶30(g /mL)时葛
根素得率达到最高值 0.662%。这是因为随着溶剂
量的增大，溶剂和葛根粉末之间的接触面积变大，增
加了扩散速度，有利于有效成分的溶出。当固液比
大于1∶30(g /mL)时，随着固液比增大葛根素得率下
降，可能是随着溶剂量的继续增加，降低了酶的有效
作用浓度和催化活性，从而使葛根素得率降低［20］。
从浸提效果、减少溶剂用量和降低浓缩负荷这三方
面综合考虑，溶剂用量不宜过大。同时溶剂用量过
大也会增加提取成本。
图 2 酶解固液比对葛根素得率的影响
Fig.2 Effect of solid－liquid ratios on yield of puerarin
2.2.3 酶添加量对葛根素得率的影响 酶添加量对
葛根素得率的影响结果见图 3。随着酶添加量的增
加，葛根素得率随之增大，当酶添加量大于 1.5mL /g
时，葛根素得率增幅減小，可能因为葛根中纤维素成
分含量一定，当其全部被纤维素酶的结合位点所结
合后，即使再加酶也无多余的底物来进行酶解反应。
添加过量的酶也会增加酶解反应的不均匀性，从而
影响酶解速率，所以葛根素得率增加度较小［21－22］。从
1.5mL /g酶添加量 2.5mL /g 比 1.5mL /g 时的葛根素
得率只提高了 1.82%，从经济成本和效率方面考虑，
较佳的酶添加量为 1.5mL /g。
图 3 酶添加量对葛根素得率的影响
Fig.3 Effect of enzyme dosage on yield of puerarin
2.3 纤维素酶结合超声波提取葛根素的响应面优化
研究
在单因素实验的基础上，选择影响葛根素得率
的三个主要酶解因素:固液比(X1)、酶解时间(X2)、
酶添加量(X3) ，以葛根黄酮的主要成分葛根素得率
为响应值，进行响应面分析实验。实验设计与结果
见表 3。
表 3 响应面实验设计及结果
Table 3 Design and result of response surface methodology
实验号 X1 固液比 X2 酶解时间 X3 酶添加量
葛根素得率
(%)
1 0 － 1 － 1 0.712
2 － 1 1 0 0.707
3 0 0 0 0.722
4 1 0 － 1 0.705
5 0 0 0 0.721
6 0 0 0 0.722
7 － 1 0 － 1 0.707
8 0 1 1 0.686
9 0 － 1 1 0.652
10 － 1 － 1 0 0.633
11 0 0 0 0.721
12 － 1 0 1 0.683
13 0 1 － 1 0.688
14 0 0 0 0.701
15 1 － 1 0 0.650
16 1 1 0 0.627
17 1 0 1 0.678
应用统计软件 Design－Expert 8.05b 对表 3 的数
据进行回归分析，得到因子 X1(固液比)、X2(酶解时
间)、X3(酶添加量)与响应值 Y(葛根素得率)间的关
系方程为:Y = 0.72 － 0.007793X1 + 0.008908X2 －
0.013X3 － 0.028X1X2 － 0.005178X1X3 + 0.013X2X3 －
0.026X1
2－0.038X2
2 + 0.003787X3
2，Ｒ2 = 0.9250。
对上述模型进行方差分析及显著性评价，由表 4
178
表 4 二次多项模型及其各项方差分析
Table 4 Variance analysis of second order polynomial equation
来源 平方和 自由度 均方 F值 概率 p 显著性
模板 0.016 9 1.771E－003 9.60 0.0035 显著
X1 5.019E－004 1 5.019E－004 2.72 0.1431
X2 5.720E－004 1 5.720E－004 3.10 0.1217
X3 1.252E－003 1 1.252E－003 6.78 0.0352
X1X2 3.334E－003 1 3.334E－003 18.07 0.0038
X1X3 1.146E－004 1 1.146E－004 0.62 0.4567
X2X3 5.711E－004 1 5.711E－004 3.09 0.1220
X2
2 2.376E－003 1 2.376E－003 12.87 0.0089
X2
2 5.756E－003 1 5.756E－003 31.18 0.0008
X2
3 4.517E－005 1 4.517E－005 0.24 0.6360
误差总计 1.292E－003 7 1.846E－004
失拟误差 9.648E－004 3 3.216E－004 3.93 0.1096 不显著
纯误差 3.272E－004 4 8.180E－005
总计 0.017 16
可见，该模型 p =0.0035 ＜ 0.01，失拟项 p = 0.1096，表明
该模型失拟不显著，回归极显著。一般认为，相关系数
Ｒ2 大于 0.9，表明预测值能与实验值具有高度相关
度［23］，该方程系数 Ｒ2 =0.9250，进一步说明回归模型与
实验数据的拟合性较好，能够解释葛根素得率的变化，
可以应用于酶解提取葛根素得率的理论预测。
依据模型参数 F 值的大小，各影响因素对响应
目标值葛根素得率的影响程度依次为酶添加量 ＞酶
解时间 ＞固液比。此外，一次项中 X3 的回归系数显
著，说明酶添加量对葛根素得率有显著影响;交互项
中 X1 与 X2 的偏回归系数极显著，说明固液比与酶
解时间的交互项对葛根素得率有显著(p ＜ 0.05)影
响，而其余的交互作用不显著。响应面图形是响应
值对各因素(X1、X2、X3)所构成的三维空间的曲面
图，根据回归方程，将一个影响因子固定在其中心水
平(Xn = 0) ，得到其它两个因素交互作用的响应曲
面，可以直观的从图 5、图 6 看出。
图 4 固液比与酶解时间对葛根素得率的响应面曲面图
Fig.4 Ｒesponse surface of the solid－liquid ratio
and hydrolysis time on the yield of puerarin
通过回归模型理论预测酶粉葛提取葛根素的最
佳条件为 X1 为 1∶31.35，X2 为 9.81，X3 为 1，即固液比
1∶31.35，酶解时间 9.81h、酶添加量为 1mL/g(31.84U/g)，
在此条件下从粉葛提取葛根素的理论预测值可达
0.723%。考虑到实际操作的可行性，将酶法结合超
图 5 固液比与酶添加量对葛根素得率的响应面曲面图
Fig.5 Ｒesponse surface of the solid－liquid ratio
and enzyme dosage on the yield of puerarin
图 6 酶解时间与加酶量对葛根素得率的响应面曲面图
Fig.6 Ｒesponse surface of the hydrolysis time and
enzyme dosage on the yield of puerarin
声波提取粉葛葛根素的最佳反应条件修正为:固液
比 1∶31，酶解时间 9.8h，加酶量 1mL /g。
2.4 纤维素酶结合超声波提取葛根素最优工艺条件
的验证实验
采用固液比 1∶31(g /mL) ，酶解时间 9.8h、酶添加
量为 1mL /g进行验证实验，共进行 4 次实验，平均值
为 0.728%，与预测值 0.723%较为接近，相对误差为
0.69%，比优化前(0.631%)提高了 15.37%，比传统
乙醇浸 提 法 (0.569%)和 单 纯 超 声 波 提 取 法
(0.584%)分别提高了 28.0%和 24.7%，表明本文建
179
立的酶法结合超声波提取粉葛葛根素最优工艺条
件，既能提高提取得率，又具有一定的可靠性和重
现性。
3 结论
本论文以提高葛根素提取得率为目的，通过单
因素实验和响应面优化研究，建立了纤维素酶结合
超声波提取粉葛葛根素的最优工艺条件，即固液比
1∶31(g /mL)、酶解解时间 9.8h、酶添加量 31.84U /g，
超声功率 150W、频率 40kHz、时间 30min。在该条件
下，葛根素的提取得率达 0.728%，比优化前提高了
15.37%，比传统乙醇浸提法(0.569%)和单纯超声波
提取法(0.584%)分别提高了 28.0%和 24.7%。
2010 年版《中国药典》规定，粉葛葛根素含量应
不低于干燥品质量的 0.30%方可入药［2］。本文所选
用的葛根品种总黄酮得率达到 2.1%，葛根素得率达
到 0.728%，符合药用要求。其鲜葛根淀粉含量高达
70.9%，可广泛应用于保健食品行业，具有很高的经
济价值。该品种已实现大规模的种植加工，是综合
开发利用葛根资源的较优选择。
目前工业中常用的醇水提取方法中有效成分提
取率低、工序复杂等问题，而酶解与超声提取法两种
提取技术连用可以实现优势互补，在温和可控制的
条件下提取出更多的黄酮类物质，在保健食品及药
物开发中具有很大的开发前景和应用潜力。
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