全 文 ：DNA 测序中常见影响因素的研究
宋艳斌1
马文丽1
郑文岭2
( 1南方医科大学分子生物学研究所,广州
510515; 2广州军区肿瘤分子生物学研究所,广州
510010)
摘
要:
对测序中的模板、引物、测序反应条件及测序反应纯化方法和仪器操作等进行研究。结果显示测序
模板的纯度影响测序的质量, 浓度对测序的长度有影响。引物设计时除符合一般设计原则外, Tm 值最好在
50
~ 60
之间,且无成串的 G、C。改变变性、退火、延伸的时间和温度对特殊 DNA 模板的序列测定有较好的效
果。测序反应产物的纯化有几种方法,以 70%乙醇沉淀法最经济、方便。因此模板的纯度和浓度对测序成功与否
起决定作用。最佳反应条件可降低成本,提高测序成功率, 乙醇沉淀法是首选的测序反应产物纯化方法。仪器操
作熟练、正确与否也会影响测序结果。
关键词:
DNA
循环测序
影响因素
The Influence of Some Factors on DNA Sequencing
Song Yanbin1
Ma Wenli1
Zheng Wenling2
(1Department of Biochemistry , the First Mili tary Medical Universi ty , Guangzhou
510515;
2Institute of Molecular Oncology, Liu Hua Qiao Hospital , Guangzhou
510010)
Abstract :
The effects of DNA templates, primers, cycle sequencing reaction conditions, purification methods, operation of in

strument were comparatively analyzed. The quality of sequencing was influenced by the purity of templates, the length of sequenc

ing was influenced by the concentration of templates. The Tm value of primers should be between 50
~ 60
and there shouldn

t be too much G+ C in the primers. The alteration of the temperature and time of the denaturation, annealing, extension facilitated
sequencing of some of the DNA templates. The purity and concentration of DNA templates were closely related to the quality se

quence data.The optimized reaction conditions could decrease the cost of sequencing and improve the ratio of success. The ethanol
precipitation was the optimized method of products purification of the sequencing reactions. Instrument operation could also influ

ence the sequencing results.
Key words:
DNA
Cycle sequencing
Factor
DNA序列测定是分子生物学领域最常用的技术之一,是了解基因结构和功能的基础。随着DNA序列测
定技术的不断改进和仪器自动化程度的不断提高,使得 DNA自动测序仪操作简化、灵敏度提高,对各种模板
均能得到较好的测序结果。我们在使用 ABI PRISMTM 310全自动测序仪的过程中发现, 模板的纯度和浓度,
引物和测序循环反应条件都会对测序结果产生重要影响[ 1~ 3]。为提高测序反应的效率, 我们对这些影响因
素进行了系统分析。
1
材料和方法
1. 1
测序模板和引物
PCR产物为 rpsL 基因序列。质粒 pGEM
3Zf ( + )由 PE 公司提供, T 载体中亚克隆 rpsL 基因。引物

21M13由 PE公司提供,扩增 rpsL基因的引物由 PE ABI 8909合成仪合成。
1. 2
测序模板的获得
PCR产物纯化和质粒提取都按照 omega公司试剂盒说明书操作。
收稿日期: 2004
09
13

生物技术通报

研究报告
          BIOTECHNOLOGY
BULLETIN








2005年第 1期
1. 3
测序反应
1. 3. 1
测序反应体系
( 1) Terminator Ready Reaction Mix( TRR, PE公司试剂盒提供) 8
l; 双链 DNA 200ng~
500ng, PCR产物 50ng~ 80ng; 引物 3. 2pmol; 去离子水适量, 总体积为 20
l。( 2) TRR 1
l; 双链 DNA 200ng~
500ng, PCR产物 50ng~ 80ng;引物 3. 2pmol;去离子水适量, 总体积为 5
l。
1. 3. 2
测序反应循环条件
( 1) 96
变性 10s, 50
退火 5s, 60
延伸 4min, 25个循环。( 2) 98
预变性
5min, 96
变性 30s, 50
退火 30s, 60
延伸 4min, 共30个循环。
1. 3. 3
测序反应产物纯化
( 1)异丙醇沉淀法,用 75%的异丙醇沉淀两次。( 2)乙醇沉淀法,用无水乙醇和
75%的乙醇各沉淀一次。( 3)试剂盒纯化法, 按照操作手册进行。
1. 4
电泳分析
1. 4. 1
在 ABI PRISMTM 310测序仪上进行。
2
结果
2. 1
模板与测序结果的关系
实验结果证明, 模板的纯度直接影响测序结果,大多数测序失败的原因主要因为模板的纯度不够,表现
为测序曲线峰图谱上仅显示出引物峰(图 1)。常用的检测核酸纯度的分光光度法只能作为参考。如果模板
浓度过高就会出现一段很高的峰位然后突然降低的谱形, 测序长度变短。如果模板量少就会出现峰位很低
甚至不能判读的情况。如果对 PCR产物直接进行测序时,首先要经电泳分析 PCR反应的特异性, 特异性高
的样品可直接用 PCR产物纯化试剂盒纯化后进行测序,特异性低的需要切胶回收或连接载体后进行测序,
否则测序结果会有很多重叠峰并出现很多N端,以致无法判读序列(图 2)。
图 1
使用质量差的模板绘制出的测序反应图谱
图 2
特异性较差的 PCR 测序图谱
2. 2
测序引物与测序结果的关系
引物的长度与特异性有关,同时也与 Tm 值有关, 实验证明, 引物的 Tm最好在 50
~ 60
之间, 不会造
成成串的 G、C出现;如若引物的Tm值超过 60
, 需要相应地调整测序反应循环条件才能获得较好的结果。
452005年第 1期










宋艳斌等: DNA测序中常见影响因素的研究
2. 3
测序反应条件与测序结果的关系
测序反应体系( 1)和( 2)对测序结果的影响不大,都可以测出约 500bp。但( 2)使用的TRR仅为( 1)的 1/
8, 这就大大降低了测序反应的成本。测序反应循环条件要根据模板和引物的不同进行调整, 当模板中 GC
含量较高时,先在 98
预变性 5min,当引物的 Tm值大于 60
时,退火温度可以省略, Tm小于 50
时,可延
长退火时间或降低退火温度。当引物反应在 50
~ 60
之间进行时, ( 2)可取得良好的测序结果。
2. 4
测序产物纯化方法比较
当使用异丙醇纯化产物时,经常因为未反应的 dNTP 也被沉淀而影响结果判读。而使用乙醇沉淀产物
时,既经济又方便,且效果好。使用试剂盒纯化虽然效果好,但价格昂贵。
2. 5
仪器操作和保养与测序结果的关系
仪器的正确操作会直接影响测序结果。例如仪器的校正和分析条件的选择都会影响最终的测序结果。
因为仪器的保养可保证测序结果的可靠性和稳定性, 并可延长仪器的使用寿命。测序所使用的试剂保存和
定期更换对测序结果好坏也有影响。
3
讨论
实验证明, 测序成功的关键是测序模板的纯度,大多数测序失败都是由于模板的纯度不够所致[ 4]。检测
模板纯度时常用分光光度法测定核酸浓度和纯度这仅能作为参考,我们的经验是使用质量可靠的试剂盒,就
可以保证模板的质量。当使用 PCR产物直接测序时, 首先要用电泳确定条带的特异性,如若特异性不好,则
要切胶回收特异条带或将其亚克隆入载体后再测序。虽然将特异条带克隆入载体比较麻烦,但使用克隆载
体进行引物测序,可解决 PCR产物直接测序时遇到的开始序列测不好的问题。例如, 模板的浓度过高时,电
泳信号过强,会出现平头峰,所测出的序列较短。模板浓度过低时,电泳信号弱,峰形较低,误差大,可信度较
差。当模板中的 GC含量较高或含有特定的二级结构时, 可通过调整变性,退火的温度或时间, 或者增加循
环次数来解决模板结构所带来的问题[ 5]。
在设计测序引物时除了要遵守一般的引物设计原则外,特别要注意引物的长度不能过长,这样不仅可以
控制引物的Tm 值,还可以降低引物的合成成本。
测序反应条件的优化可以使测序反应适用于不同的模板,获得稳定的测序结果。如果将测序反应体系
中的TRR由 8
l降为1
l,就会大大降低测序成本,使每次测序的成本降至百元以下。我们比较了几种不同
的测序反应产物纯化方法,实验证明乙醇沉淀法方便、快速、经济,是首选的纯化方法之一。
应用 DNA测序仪进行 DNA序列测定, 可以大大缩短测序的时间,降低测序的成本,保证测序的质量,虽
然使用的是一些常用的分子生物学技术,但对其中关键因素的影响进行研究,对于解决测序中常见的疑难问
题,提高测序成功率有重要的参考价值。
参 考 文 献
1
黄庆,张雪,府伟灵,等.医学信息, 2003, 16( 7) : 342~ 345.
2
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何云贵,房海燕,夏昆,等.中华医学遗传学杂志, 2000, 17(2) : 122~ 124.
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Chen Q,Neville C,Mackenzie A, et al. Biotechniques, 1996, 21(3) : 453~ 457.
5
Xiao CY,Zhang SZ,Wu H, et al. Chin J Med Genet , 1998, 15( 4) : 238~ 241.
46







生物技术通报 Biotechnology
Bulletin







2005年第 1期