全 文 ： 综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
病毒编码基因介导的植物病毒抗性机理研究进展
赵焕阁 华元刚 刘志昕
(中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所热带热带作物生物技术国家重点实验室,海口 571101)
摘 要: 根据植物自身病毒编码基因的不同, 重点介绍了其病毒抗性机理的研究进展。
关键词: 植物自身病毒 病毒抗性 蛋白基因
The Advance in P lant ResistanceM echanism to Virus
M ediated by Virus-Encoding Gene
Zhao Huange Hua Yuangang L iu Zhix in
( Institu te of B io technology Research for T rop ical Crop s /Nationa lK ey
B iotechnology Laboratory for T rop ical C rop s, CATAS, Ha ikou 571101)
Abstrac:t Accord ing to the different encod ing gene of p lant host v irus, th is pape r rev iew ed plant resistance m echa-
n ism to v irus m ediated by different w ays, and the research key po ints in the future w ere pu t forwa rd.
Key words: P lant host-gene v irus V iral resistance Encod ing prote in
作者简介:赵焕阁 ( 1981-) ,女,在读研究生。联系电话: ( 0898) 66890770; E-m ai:l gezi8004@ 163. com
通讯作者:刘志昕
Ham ilton于 1980年首先提出了基因工程保护
的设想, 1986年 Pow ellAbe l等成功地将烟草花叶病
毒 ( Tobacco mosa ic virus, TMV )的外壳蛋白基因转
化到烟草植物中,获得能稳定遗传的第一例抗病毒
烟草植株 [ 1 ]。此后随着分子生物学和生物技术的
迅速发展,抗病毒基因工程这一崭新的领域成为了
植物基因工程研究的热点之一。目前, 抗病毒基因
工程的研究主要集中在三个领域, 即直接利用病毒
本身的基因或人工体外改造合成的基因转入受体植
物,利用植物体内自然存在的抗性基因和利用核糖
体失活蛋白基因 ( RIPs)来进行植物抗病毒基因工
程的研究, 同时人们也在不停的尝试其它的方法。
由于病毒基因容易获取、基因组小, 易鉴定、分离和
克隆, 自 1986年以来, 这一领域研究较多而且也培
育育成了不少抗病品种, 近两年在转基因抗病机理
上的研究也有较大的突破。本文主要根据病毒侵染
循环过程中不同步骤所利用的病毒外源基因不同,
对抗病毒基因工程的研究作简要的综述。
1 利用蛋白基因介导的抗性机理
1. 1 利用外壳蛋白 (结构蛋白 )介导的抗性机理
外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白, 功能是
将病毒基因组核酸包被起来, 保护核酸;与宿主相互
识别,决定寄主范围; 参与病毒的长距离运输等, 由
外壳蛋白 ( Coat pro te in, CP)介导的抗性是研究最
早、也是目前比较成功的抗病毒手段。其介导的抗
性最早是 Beachy根据病毒株系间的 交叉保护
( Cross-protection)现象 [ 2]提出的, 其抗性机理主要
是利用无毒的病毒外壳蛋白抑制病毒的复制或激发
宿主的抗性反应,策略主要是将病毒的外壳蛋白基
因进行体外克隆、体外重组及构建表达盒,然后将重
组的 CP基因转化到植物细胞内并得以表达, 从而
使转基因植物获得抗病毒的能力。自 1986年
Pow ell等成功利用外壳蛋白基因获得了抗烟草花叶
病毒 TMV侵染的转基因植物, 这一突破性成果不断
的广泛用于其它的病毒和植物。迄今为止, 已经克
隆了至少 15个病毒组中 30种病毒的 CP基因, 并
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
成功转化了 20多种植物,有些株系已进入田间试验
并显示了与实验室一致的抗病效果 [ 3 ]。
在早期的实验中, Pow e ll等和 R eg ister等利用
TMV病毒 CP基因获得抗病毒植株的试验, 发现 CP
介导的抗性表现一下特点: 其一,抗性与 CP蛋白的
表达量呈正相关; 其二, CP介导的抗性只对病毒粒
子起作用,一般不抗裸露的病毒 RNA的攻击;其三,
抗性与接种的病毒浓度有关,高浓度接种能克服 CP
介导的抗性。因此, 基于以上的研究, B eachy等认
为, CP介导的抗性是由于转基因植物表达的病毒外
壳蛋白干扰了病毒侵染早期的脱壳过程所致。然而
进一步的研究表明,这一认识还比较狭窄, Taschner
等人 [ 4]在苜蓿花叶病毒 ( ALMV ) CP介导的抗性研
究中, 发现低水平表达的 CP只具有对完整病毒粒
子的抗性,而高水平表达突变型 CP,则不仅对完整
的病毒颗粒具有抗性,还对裸露的 RNA具有抗性;
除苜蓿花叶病毒 ( ALMV )外,马铃薯 X病毒组 PVX-
CP介导抗性也对完整病毒粒子和裸露的 RNA具有
抗性。上述的两种抗性, 均依赖于转基因的蛋白表
达产物,因而属于蛋白质水平上介导的抗性。
随着研究的不断深入和扩展, 发现转 CP基因
的植物中 CP的含量与抗性水平之间缺乏相关性,
甚至在抗性植株中难以检测到转基因的蛋白质产
物,表明转基因蛋白质的表达并非是抗性所必须
的 [ 5] ,特别是 Re imann-Ph ilipp等通过试验发现一些
病毒截短的、反义的或不可转译的 CP基因也能介
导转基因植物对相关病毒的高度抗性, 且抗性可达
到免疫程度,这些表明 CP基因介导的抗性中存在
着不依赖于 CP本身的抗性机制。几乎与此同时,
病毒其它基因介导的抗性中也发现了类似情况,这
些研究揭示了 CP介导的抗性水平即有蛋白质水平
上介导抗性也有转基因 RNA水平上介导抗性。
尽管 CP介导的抗病毒植株已获得了成功, 但
还存在很多问题,主要是基因工程植株免疫类型和
高抗类型较少 [ 6]以及具有潜在危险性, 导入植物中
的外源 CP基因的表达产物可能包装另外一种病毒
或其它致病因子的基因组而形成一种新的致病因
子。
1. 2 利用非结构蛋白基因介导的抗性机理
1. 2. 1 利用复制酶基因介导的抗性机理 植物正
链 RNA病毒的复制酶属于依赖 RNA的 RNA聚合
酶 ( RNA-dependent RNA po lymerase, Rd Rp) , 是病
毒基因组编码的自身复制不可缺少的部分, 特异地
合成病毒的正、负链 RNA。利用病毒 RNA复制酶
( rep licase )的一部分基因的 cDNA转化植物, 从而
获得抗病毒植物,抗性的产生可能与干扰入侵病毒
穿越受侵细胞进入植物的输导系统有关 [ 7 ]。复制
酶基因是病毒非结构蛋白基因,通常由 1~ 2种由病
毒编码的蛋白质和多种寄主成份构成。在病毒编码
的复制酶蛋白质中存在多个保守序列,其中一个是
存在于所有 RNA聚合酶中的甘氨酸 -天冬氨酸 -
天冬氨酸三肽基元序列 ( GDD motif) ,它对聚合酶的
活性是必不可少的,另一保守序列是三磷酸核苷酸
结合结构域 (NTP b inding dom ain) ,位于另一种由病
毒编码的蛋白质中或与 GDD序列共处于同一蛋白
质中,此保守序列与螺旋酶活性有关,在病毒复制时
RNA双链复制型的解旋过程中起重要作用。两保
守序列共处于同一复制酶蛋白中,或处于不同的复
制酶亚基中。
复制酶介导抗性机理主要是源于病毒的复制酶
基因干扰病毒的复制。其抗性的机理可用 Suzuk i
等提出的复制酶基因的两种作用模型来描述 [ 8]。
模型 1: 认为转基因植物表达的完整复制酶蛋
白在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常
功能,从而打破了病毒正链和负链复制的平衡,或者
是干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径。
模型 2: 转基因植物表达的突变型或缺损型的
复制酶蛋白,在复制酶复合体的装配过程中,与野生
型复制酶竞争由寄主或病毒编码的复制酶复合体的
其它成分,或者竞争其它寄主因子或底物,从而使野
生型复制酶不能正常行使其功能, 干扰病毒的复制。
此外,缺损型复制酶基因也可以介导抗性,这种
抗性是高度专一的, 通常只限于同一种病毒。An-
derson等 [ 9 ]将黄瓜花叶病毒 ( CMV ) Fny株系的
RNA内部缺失 94个核苷酸后导入烟草 (缺失区包
含 GDD三肽基元序列 ) , 结果, 缺失造成开放阅读
框的移码, 其翻译产物只有完整的 97KD蛋白的
75%左右, 但表现出对 CMV 的高度抗性。又如,
Donson等 [ 10]在对 TMVU 1株系野生 183KD复制酶
基因进行的转化中,对发现的广谱病毒抗性转基因
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2006年增刊 赵焕阁等: 病毒编码基因介导的植物病毒抗性机理研究进展
株系研究表明,造成基因终止的是转基因中部插入
的一个 1. 4Kb的转座子 。病毒广谱抗性是由于插
入突变导致缺陷型复制蛋白的产生引起的。
复制酶基因介导的抗性机理非常复杂, 既可以
在蛋白质水平上又可以在 RNA水平上实现 [ 11 ]。从
抗性对病毒运动的抑制作用来看, 抗性是在蛋白质
水平上 , Carr等认为转基因植物表达的复制酶蛋白
在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功
能,打破了正负链复制的平衡或者干扰了控制复制
酶活性的反馈抑制途径, 影响了复制酶复合体的装
配。PVX165KD [ 12]复制酶及豇豆花叶病毒 CPMV
复制酶等介导的抗性则是 RNA介导的依赖同源序
列的抗性,在 RNA水平上实现 , lomonossoff认为转
录出的 mRNA与病毒的复制酶进行无效结合抑制
了复制酶的正常功能,或是 mRNA诱导了植物的自
然抗病性; W ilson认为 [ 13]转录后的 RNA序列上的
微小变化干扰了病毒复制过程中蛋白质-RNA之间
的相互作用。
利用复制酶基因组分有望获得高水平的抗病毒
工程的植株, 虽然近年来在抗 TGMV、BMV、BYMA
和 BYDY等病毒的研究中,利用干扰病毒复制酶活
性的策略,均在不同程度上干扰了病毒复制,但不足
之处是抗性范围过于狭窄。
1. 2. 2 利用病毒运动蛋白基因 植物病毒系统侵
染寄主经过两个明显的过程:病毒通过胞间连丝在
细胞间的移动和通过维管束系统在器官间的转移。
病毒在细胞间的移动, 主要受病毒本身编码的移动
蛋白 ( movement protein, M P)和寄主因素所控制。
MP一方面能够修饰胞间连丝, 而增加其有效孔径,
另一方面能结合病毒核酸,使病毒核酸的三维结构
改变成丝状的核酸-蛋白质复合体,这一复合体使病
毒较容易地通过胞间连丝。其抗性机理主要是利用
编码失去活性的病毒移动蛋白的基因干扰病毒的扩
散和移动。
MP介导的抗性主要是缺陷型 MP和异源 MP
介导的抗性。在对 TMV编码的 30KDa蛋白 ( P30)
研究中发现缺陷型的 MP与完整型 MP相比, 只有
缺陷型 MP才能介导转基因植株对病毒的抗性, 而
且这一抗性具有广谱性, 其机理可能是由于缺陷型
MP与完整型 MP竞争胞间连丝上的结合位点而实
现的。在表达雀麦花叶病毒 BMV MP对非寄主转
基因植物烟草的试验中, 发现异源的 MP可以代替
同源缺失型 MP的作用表现出抗性 [ 14]。这些研究
激发了人们用缺陷的或异源的 MP介导广谱病毒抗
性的设想和实验,使得转一种基因而抗多种病毒成
为可能,这一抗病毒途径可能具有广阔的应用前景。
在一些由一系列重叠阅读框 ( TGB)编码运动蛋
白的病毒中, 转基因植物中表达的突变 TGB蛋白只
能介导较窄的病毒抗性, 与前面的作用方式不完全
一致。S ijen等 [ 15]通过研究也发现转基因植物中表
达 CPMV的全长 MP与缺陷 MP介导同样水平的抗
性。
2 利用 RNA介导的抗性机理
2. 1 利用病毒卫星 RNA
某些病毒除基因组 RNA外,还伴有一些小片段
RNA, 称为卫星 RNA ( Sate lliteRNA ),携带卫星 RNA
的病毒称为辅助病毒。卫星 RNA与辅助病毒的基
因组无序列同源性,其复制需要依靠辅助病毒,而它
本身对于辅助病毒的复制并非必需。迄今已报道有
6组共 26种植物病毒带有卫星 RNA, 卫星 RNA对
植物病毒病的影响主要有 3类:一是加重症状;二是
无调节作用;三是减轻症状。而利用病毒卫星 RNA
来获得抗性的方法就是根据第 3种影响来设计的。
1986年, B aulcombe等 [ 16]首次将 CMV卫星 RNA的
克隆转入烟草,获得了抗 CMV的基因工程植株。
卫星 RNA介导抗性的机制是卫星 RNA与病毒
基因组 RNA争夺病毒复制酶。由于卫星 RNA能更
有效地占据 RNA复制酶,而且其分子小,复制周期
短,因此, 随着复制循环的增加,卫星 RNA的复制量
远远大于基因组 RNA的复制量,最终使病毒基因组
的复制受到抑制。这一方法具有卫星 RNA只需低
水平的表达,并且不产生异源蛋白,提高转基因植物
的安全性的优点。但这种抗性只在侵染晚期发挥作
用,而且,转基因植物体内减轻症状的卫星 RNA有
可能会突变成加重病症的卫星 RNA, 因而具有一定
的潜在危险性。
2. 2 利用病毒反义 RNA
反义 RNA是指能与 mRNA互补配对的单链
RNA。该方法的设计对象可以是 CP基因、复制酶
基因或病毒基因组的其它成分。转基因植物中表达
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
的反义 RNA核酸顺序与病毒基因组 RNA互补配
对,从而抑制病毒 mRNA重要序列的表达, 阻断病
毒的侵染。
目前,已经对 TMV、CMV、PVX等病毒构建了反
义 RNA转基因植株,但只表达出较微弱的抗性,说
明反义 RNA介导的抗性没有很好的效果。最近
N elson用 TMV为材料的研究发现,只有表达病毒基
因组的 3端非编码区的反义链的转基因植株才对
TMV有较强的抗性。总之, 利用病毒反义链 RNA
作为抗病毒基因工程的策略。由于反义 RNA是针
对单一病毒基因设计的, 它可能不如 CP介导的抗
性那样广谱,但由于 DNA病毒在核中就能转录它们
的基因组,若将它与其它手段相结合或许会产生较
好的潜能。
2. 3 利用缺陷干扰型 RNA
在自然情况下,有些病毒的某些基因发生缺失,
就形成缺陷干扰型 RNA ( Defective interfering RNAs,
DIRNA s)。D IRNA s在动物中普遍存在,而在植物中
仅存在于番茄束矮病毒组 ( Tom bus v irus)和香石竹
斑驳病毒组 ( Carom v irus)中。DIRNA s必须依靠病
毒才能复制。因此,当缺陷 RNA s和正常病毒感染
同一细胞时, 缺陷 RNAs可迅速增殖, 利用正义
RNA去竞争病毒复制酶的结合位点,干扰了正常病
毒的复制,限制了病毒的扩散, 干扰病毒的复制,从
而减轻病症。但这一策略具有潜在危险性, 因为在
转基因植株内发生 RNA重组时, 有可能产生新的
病毒。Huntley等用雀麦草花叶病毒不同片段的核
酸,经重组形成缺陷型 RNA后导入水稻, 获得了具
显著抗病毒特性的转基因植株。
2. 4 依赖于同源序列的 RNA介导的病毒抗性机理
在利用病毒起源的基因进行抗病毒植物基因工
程的研究中, 经常出现与蛋白质表达无关的抗性。
L indbo等 [ 17] ( 1993)发现 RNA沉默与植物病毒有着
密切的联系, 并就此提出了 RNA介导抗病性的概
念。随后 Dougherty等和 Ka lantidis等 [ 18 ]发现在高
抗 (或近似免疫 )的转基因植株中, 转基因 RNA在
病毒入侵前,由于病毒转基因自身诱发了 RNA沉默
机制, 而以序列特定性的行为被降解了;而在部分抗
性的转基因植株中,转基因 RNA在病毒入侵前不完
全启动了 RNA沉默机制。
现在越来越多的试验证明, 基因沉默与病毒抗
性具有高度特异性,只有当转基因与病毒 RNA具有
同源性时才可发生。因此,称之为 RNA介导的依赖
同源序列 ( homo logy-dependent resistance, HDR)的病
毒抗性。目前普遍认为这一机理是细胞质中的一种
互补 RNA ( cRNA )参与了转基因 mRNA 和病毒
RNA的降解过程, 这种 cRNA可能是细胞质中的依
赖于 RNA的 RNA聚合酶 ( RdRp)以转基因 RNA为
模板合成的, cDNA能分别与转基因 mRNA及同源
RNA互补配对形成二聚体, 二聚体首先被特异性
dsRNA se所切割,随后被胞质外切核酸酶进一步降
解 [ 19]。由病毒基因介导的 HDR不但与转基因的高
拷贝或 /和高水平转录有关,也与多拷贝的基因排列
方式和转基因的长度有关。由于其抗性程度强, 易
获高抗 (免疫 )的转基因植株和较高的生物安全性
的优点,该方法具有较好的发展前景。
3 利用核酶基因介导的抗性机理
核酶 ( R ibozym e)是一类具有特殊二级结构、能
特异性催化切割自身以及其它 RNA分子的小分子
RNA, 它广泛存在于一些类病毒和病毒卫星 RNA序
列中,核酶基因能抑制病毒基因的复制剪接核表达。
核酶可以分为锤头型和发夹型两类。目前主要是锤
头型核酶的结构特点进行人工设计,即在酶活性中
心两侧接上有特定碱基序列的两段 RNA臂, 使这两
条臂能特异的与底物 RNA (如病毒 RNA )按碱基互
补配对原则结合,然后活性中心部位将底物切开。
Ed ing ton等首次设计出可酶切烟草原生质中
TMV-RNA的核酶,他把 TMV上的 RNA聚合酶编码
区一分为二。该核酶本身侧链 40个核苷酸, 与酶切
位点周围的 TMV序列互补,防止了病毒的复制。许
政凯等设计了以 TMV移动蛋白基因为靶的核酶, 也
能抑制病毒的复制。试验结果表明核酶能使靶内的
一个磷酸二酯键断裂,直接破坏了靶 RNA的生物学
功能。De Feyter等 [ 20]在马铃薯卷叶病毒的试验中
发现基因的反义序列和核酶的抗病毒效果一样。它
存在潜在一定的危险性,核酶可能将细胞 RNA作为
靶 RNA切割而破坏细胞的正常功能。
4 结语
自 20世纪 80年代以来, 植物抗病毒基因工程
研究不论在深度还是广度上的进展都十分迅速, 特
20
2006年增刊 赵焕阁等: 病毒编码基因介导的植物病毒抗性机理研究进展
别是来源于病毒的抗性基因 ,应用前景十分引人瞩
目。到目前为止,应用转基因植物抗病毒成功的有
西葫芦、番木瓜、转病毒烟草、番茄、甜椒等作物,但
不同病毒来源基因介导的抗性都有其各自的优点和
不足, 特别是自然条件下 RNA的突变率较高和多种
病毒的混和侵染。在病毒起源的基因介导的病毒抗
性中, RNA介导与 PTGS相关依赖于同源序列的抗
性机理的研究是一个热点,以实现介导广谱病毒抗
性的可能性。
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