全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 157-165(2013)
收稿日期: 2012-07-07; 修回日期: 2012-12-13
基金项目: 国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08004-004); 国家自然科学基金资助项目(31100056); 高等学校博士学科点
专项科研基金(20100097120011)
通讯作者: 高学文,教授,博导,主要从事分子植物病理学和植物病害生物防治研究; Tel: 025-84395268, E-mail: gaoxw@njau. edu. cn
第一作者: 郭佩佩,女,山西长治人,硕士研究生,主要从事植物转基因研究。
大豆凝集素基因 lec-s转化烟草
增强对烟草花叶病毒的抗性
郭佩佩, 伍辉军, 高学文∗
(南京农业大学植物保护学院 /农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室, 南京 210095)
摘要:将编码大豆凝集素的 lec-s基因插入植物表达载体 pBI121 中,构建植物重组表达质粒 pBI121:: lec-s。 由根癌土壤杆
菌 EHA105 介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。 PCR和 RT-PCR 检测证明 lec-s 基因已转入烟草植株中。 接
种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基
因烟草表现出对 TMV的抗性。 定量 RT-PCR检测发现,接种 TMV后,抗病防卫基因(PR-1a、GST1、Pal 和 hsr515)在转基
因烟草叶片中显著上调表达。 这些结果表明,大豆凝集素基因 lec-s 转化烟草可对 TMV 产生抗性,其作用机制可能在于
lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对 TMV的系统抗性。
关键词: lec-s; 转基因烟草; 烟草花叶病毒抗性; Quantitative RT-PCR; 防卫基因
Enhanced resistance to Tobacco mosaic virus in transgenic tobacoo plants with
lec-s from soybean　 GUO Pei-pei, WU Hui-jun, GAO Xue-wen　 (College of Plant Protection / Key Labora-
tory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing
210095, China)
Abstract: The lec-s gene encoding soybean lectin was inserted into transgenic vector pBI121. The leaf discs
from tobacco were transfected by Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 / pBI121:: lec-s. Kanamycin-re-
sistant transformed plants were obtained. PCR and RT-PCR analyses confirmed successful integration of the
foreign gene into the genome of the T1 generation tobacco plants. Bioassays revealed that the resistance of
transgenic plants to Tobacco mosaic virus (TMV) was increased; lesion numbers on leaves caused by TMV
were markedly reduced in transgenic plants comparing with the controls. Quantitative RT-PCR analysis indica-
ted that four defense-related genes, PR-1a, GST1, Pal, and hsr515, were up-regulated in transgenic lines in-
oculated with TMV. The up-regulations of these defense-relate genes were not observed in leaves of control
plant after inoculation. The results suggested that lec-s gene might play a role in the regulation of plant defense
responses through the induction of downstream defense-related genes after the recognition of microbial patho-
gens, thus the transformed tobacco plants with lec-s gene could enhance the resistance to TMV.
Key words: lec-s gene; transgenic tobacco; resistance to TMV; Quantitative RT-PCR; defense gene
中图分类号: S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)02-0157-09
　 　 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)
是一种植物正链 RNA病毒,可侵染 38 科 268 种植
物,引起多种重要的植物病毒病[1]。 由于 TMV 抗
逆性极强,对寄主专性寄生,加上植物缺乏完整的
　
植物病理学报 43 卷
免疫代谢系统,使得该病很难防治。 目前,由烟草
花叶病毒引起的植物病害,其防治方法主要包括:
种植抗(耐)病品种、加强田间管理、实行轮作和喷
施药剂。 但是,最经济有效的手段仍然是培育抗
TMV作物品种[2]。 植物抗病基因工程的发展为防
治植物病毒病害提供了一条新途径,主要思路是将
抗病毒相关基因通过基因工程手段转入受体植物
中,从而获得植物抗病新品种[3]。
凝集素是一种能凝集红细胞、多糖或糖复合物
的非免疫来源的糖蛋白[4]。 从多种植物、动物、细
菌、病毒和真菌中都可分离出凝集素[5],其中植物
凝集素是最大的一个家族,尤以豆科植物的种子中
凝集素含量最为丰富。 大豆凝集素是豆科植物凝
集素的一种,具有典型的豆科凝集素四级结构,由
等量的 2 种略有不同的 4 个亚基组成,每个亚基分
子量约 30 kDa。 通常所说的大豆凝集素是指对 N-
乙酞基 D-半乳糖胺 / D-半乳糖有结合特异性、分子
量约 120 kDa的一类糖蛋白,每个亚基都有 1 个共
价连接的含 9 个甘露糖的寡糖链[6]。
大豆凝集素具有防御虫害侵袭、清除入侵病原
微生物等功能[7, 8],但关于大豆凝集素抗植物病毒
的研究还未见报道。 在本实验室的前期工作中,利
用 RACE和反向 PCR 技术从大豆品种合丰 29 号
中分离得到一个新的大豆凝集素基因,命名为 lec-
s(DQ235094)。 本研究应用 RT-PCR 方法从大豆
抗病品种合丰 29 中克隆基因 lec-s,构建植物表达
载体 pBI121:: lec-s,将表达载体利用农杆菌介导
法导入到烟草中,经过筛选获得转基因植株,检测
外源基因插入表达以及对 TMV 的抗性,并初步研
究转化植株的抗 TMV机理。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
烟草品种为三生烟 (Nicotiana tabacum cv.
Samsun NN),取烟草叶片作为转化材料。 根癌土
壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105、
植物表达载体 pBI121 [含有 nptⅡ基因编码的卡那
霉素(Kanamycin,Km)抗性和花椰菜花叶病毒
(Cauliflower mosaic virus,CaMV) 35S 启动子)]
和烟草花叶病毒(TMV)由本实验室保存。
烟草组织培养基以 MS 培养基为基础[9],pH
5. 8,121℃灭菌 15 min。 预培养培养基:MS + 6-
BA 0. 5 mg / L;共培养培养基:MS +6-BA 1 mg / L;
筛选培养基:MS + 6-BA 1 mg / L + Km 100 mg / L
+ Cb 500 mg / L;生根培养基:1 / 2MS + Km 100
mg / L + Cb 200 mg / L + IAA 0. 2 mg / L;农杆菌培
养用 YEB培养基。
Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 连接酶、
dNTPs、核酸分子质量标准、 DNase Ⅰ、 Prime-
ScriptTM Reverse Transcriptase 和 SYBR Premix Ex
TaqTM Kit均购自 TaKaRa公司。 质粒抽提和 DNA
凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司。 植物 RNA 提
取试剂盒 Plant RNA Kit 购自 Omega 公司。 卡那
霉素(Kanamycin)、羧苄青霉素(Carbenicillin)购自
上海索莱宝生物科技有限公司。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 植物重组表达质粒的构建　 采用 RT-PCR
方法,从大豆品种合丰 29 中扩增出 lec-s 基因,利
用基因两端携带的限制性酶切位点 Sma Ⅰ和 Xba
Ⅰ,将其克隆到植物表达载体 pBI121 中,构建
pBI121::lec-s重组质粒。 构建成功的植物重组表
达质粒转化农杆菌菌株 EHA105,于 - 70℃保存,
用于下一步烟草的转化。
1. 2. 2　 农杆菌介导的烟草遗传转化　 烟草的转化
采用农杆菌介导的叶盘法[10]。 取烟草叶圆片(直
径 0. 5 cm)作为转化受体,在预培养基中预培养
1 ~ 2 d 后浸入备好的农杆菌菌液感染 20 min,然
后在共培养基上黑暗共培养 2 d。 共培养结束后,
将叶盘接入筛选培养基中 25℃、L∶ D =16 h∶ 8 h培
养,1 周继代 1 次。 1 ~ 2 周后即有愈伤组织的形
成,3 ~ 6 周开始有芽分化。 待绿芽长到 2 ~ 3 cm
高后,切下绿芽转入生根培养基中。 当根系发达成
为完整的植株,经炼苗后移栽至盆钵中,放到温室
培养。
1. 2. 3 　 转基因烟草 T1 代的 PCR 检测 　 植物总
DNA提取采用 CTAB 法[11]。 用转基因烟草 T1 代
叶片总 DNA为模板,空载体转化植株和未转化植
株总 DNA作阴性对照,质粒 pBI121::lec-s做阳性
对照进行 PCR 扩增。 根据目的基因序列设计引
物,扩增目的基因(扩增产物 849 bp)。 PCR 扩增
引物序列见表 1。
851
　
　 2 期 　 　 郭佩佩,等:大豆凝集素基因 lec-s转化烟草增强对烟草花叶病毒的抗性
Table 1　 Oligonucleotides used in this study
Gene GenBank accession no. Primer sequence (5′-3′)
lec-s DQ235094 FOR: TCTAGAATGGCCACCTCCAACTTCTC
REV: CCCGGGTTAGATGGCCTCATTGAGCAC
EF-1a AJ223969 FOR: AGACCACCAAGTACTACTGCAC
REV: CCACCAATCTTGTACACATCC
PR-1a X05959 FOR: GCGTAACTCGGTTCGTG
REV: TATGGACTTTCGCCTCT
GST1 D10524 FOR: CCTTTCCCTCAATCCTT
REV: ACTGACATACTGGGCATC
Pal X78269 FOR: CGATAGACTTGAGGCATTT
REV: GTTCTCCATTGGCACCC
hsr515 X95342 FOR: TTGGGCAGAATAGATGG
REV: AACACCTCAGGCTCGTC
1. 2. 4　 转基因烟草 T1 代的 RT-PCR 检测　 使用
植物 RNA提取试剂盒 Plant RNA Kit提取 T1 代转
基因烟草总 RNA,经无 RNase的 DNaseⅠ处理后,
采用 Prime ScriptTM Reverse Transcriptase进行反转
录。 以适量的反转录产物作为模板,进行 PCR 反
应。 同时,以在真核生物中高度保守和组成性表达
的基因 EF-1a (Elongation factor-1 alpha gene)作
为内参,扩增产物 459 bp,扩增引物序列见表 1。
1. 2. 5　 T1 代转基因烟草抗 TMV效果评价　 选取
移栽后 6 周处于 7 叶期的 T1 代转基因烟草,采用
摩擦接种法接种 TMV[12]。 具体方法为双手洗净
后,用手指将 TMV病毒汁液摩擦接种于烟草叶片
上。 每个株系接种 10 株,每株接种中部 3 张叶龄
一致的叶片,每张叶片接种 50 μL 病毒汁液,汁液
浓度为 1 g 新鲜 TMV 病叶加 0. 01 mol / L 的磷酸
缓冲液(pH 7. 0)10 mL后再稀释 20 倍。 试验均设
3 个重复,同时以转空载体植株和未转化烟草作对
照。 48 h后调查叶片枯斑发生情况。 病斑数减少
率(% ) = [(转基因烟草病斑数 -转空载体烟草
病斑数) / 转空载体烟草病斑数] ×100。
1. 2. 6　 Quantitative RT-PCR(qRT-PCR)测定防卫
反应相关基因的表达量　 分别取接种 TMV 后 12
h和 24 h的转基因烟草叶片用液氮冷冻研磨,使用
试剂盒提取叶片总 RNA。 经无 RNase 的 DNaseⅠ
处理后,分别取 2 μg RNA 作模板,采用 Prime
ScriptTM Reverse Transcriptase进行反转录。 反转录
产物稀释 1 倍后,取 2 μL 作为模板,使用 SYBR
Premix Ex TaqTM Kit,采用 Two-step-qRT-PCR 在
ABI PRISM 7500 荧光定量 PCR 仪上进行 PR-1a、
GST1、Pal和 hsr515 基因表达量的测定,EF-1a 基
因作为内参,引物序列见表 1。 试验均设 3 个重
复,以空载体转化植株和未转化植株作对照,采用
2 - ΔΔCT方法进行实验数据处理[13]。
1. 2. 7　 数据分析　 数据分析均采用 SPSS 数据处
理系统软件中的 Fisher’s least-significant difference
法进行方差分析。
2　 结果
2. 1　 植物重组表达质粒 pBI121:: lec-s的构建
将编码大豆凝集素 lec-s 基因插入表达载体
pBI121 中,构建植物重组表达质粒 pBI121:: lec-
s。 该载体含有“CaMV35S 启动子-lec-s 基因-gus
基因-NOS终止子”和“CaMV 35S 启动子-nptⅡ基
因-NOS 终止子”2 个表达框。 pBI121:: lec-s的结
构如图 1 所示。
2. 2　 转基因烟草的获得
烟草叶盘与农杆菌黑暗共培养 2 d 后,转入含
羧卞霉素(500 mg / L)和卡那霉素(100 mg / L)的
筛选培基中。 1 周左右叶盘开始分化抗性愈伤组
织,然后逐渐分化出抗性芽。 待芽长至 2 cm时,切
下再生芽置于生根培养基中培养。待转化小苗株
951
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 1　 Schematic presentation of plant expression vector pBI121:: lec-s
LB: T-DNA left border; RB: T-DNA right border; nptⅡ: NeomycinphosphotransferaseⅡgene;
Pro: Promoter; Ter: Terminator; gus: β -glucuronidase gene.
Fig. 2　 The process of transformation and regeneration of the transgenic tobacco plants
A: Planting tobacco seeds in MS medium and obtaining transformed tobacco receptor;B: Tobacco discs co-cultivated
with the agrobacterium; C, D: The formation of callus on the explants and regeneration of shoots from the calli;
E: Regenerated shoots on the rooting medium; F: Rooted plantlets transferred to pots.
高 6 ~ 8 cm、根系发育良好后开瓶炼苗 2 d,再移栽
温室培养。 烟草的转化再生过程见图 2。 T1 代
PCR验证共获得 32 个阳性株系。 各转化株系自
交得到的种子分单株收获。 将 T1 代转基因种子表
面消毒后播于含卡那霉素(300 mg / L)的 MS培养
基中筛选,取阳性绿色小苗移栽到盆钵中温室培
养,用于下一步试验。
2. 3　 转基因烟草的 PCR检测
随机选取 5 个株系的 T1 代转基因植株提取
总 DNA,根据目的基因设计特异引物进行 PCR
检测。 结果表明,阳性对照(质粒 pBI121:: lec-
s) 、5 个株系的转基因烟草植株均能扩出相应目
的基因的特异片段,而未转化植株和转空载体
植株没有扩增条带出现(图 3) 。 回收特异性条
带,经测序得知 PCR 扩增产物为 849 bp,与目的
基因 lec-s 的同源性为 100% ,初步表明外源基
因在这 5 个株系的 T1 代烟草植株中获得稳定
遗传。
061
　
　 2 期 　 　 郭佩佩,等:大豆凝集素基因 lec-s转化烟草增强对烟草花叶病毒的抗性
Fig. 3　 PCR detection of lec-s in transformed tobacco plants
Lane M: DL 2 000 Marker; Lane 1: Wild-type plant; Lane 2: Vector transformed plant; Lane 3:
Plasmid pBI121:: lec-s as positive control; Lane 4-8: Transformed tobacco plant.
2. 4　 转基因烟草的 RT-PCR检测
对随机选取的 T1 代转基因植株进行 RT-PCR
检测(图 4)。 结果显示 T1 代转基因植株均能扩增
出相应目的基因的条带,但未转化烟草和转空载体
烟草均检测不到外源基因的表达。 同时以在真核
生物中高度保守的 EF-1a 基因作为内参,在所有
烟草植株中均有表达,这说明转基因植株中外源基
因能在转录水平正常表达。
2. 5　 转化植株抗 TMV检测结果
接种 TMV后 48 h接种叶片上出现坏死斑,为
TMV侵染三生烟后发病的典型症状。 接种叶片的
病斑数统计结果表明,与未转化和转空载体的烟草
相比,接种 TMV 后转 lec-s 基因烟草的 T1 -11 和
T1 -20 株系病斑数显著减少,对 TMV 均表现出明
显的抗性(图 5),其中 T1 -11 株系病斑数约减少
41. 72% ,T1 -20株系病斑约减少43 . 79% (图6) 。
Fig. 4　 Expression of lec-s gene in transgenic tobacco plants detected by RT-PCR
Lane M: DL 2 000 Marker; Lane 1: Wild-type plants; Lane 2: Vector transformed plants; Lane 3-7: Transgenic lines.
Fig. 5　 Symptoms of resistant transgenic tobacco plants against TMV infection
WT: Wild-type plant; VEC: Vector transformed plant; T1 -11, T1 -20: Transgenic plant.
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植物病理学报 43 卷
Fig. 6　 Difference in lesion numbers of trans-
genic tobacco plants with TMV
WT: Wild-type plant; VEC: Vector transformed plant; T1 -
11, T1 -20: Transgenic plant; Data are expressed as means ±
SD; “ ∗ ”: Indicate a significant difference between treat-
ments and vector at P <0. 05.
未转化烟草与转空载体的烟草接种 TMV 后病斑
数没有明显差异。
2. 6　 防卫相关基因的表达情况
为了探究转基因烟草对 TMV 抗病性增强的
分子机理,采用 qRT-PCR 检测接种 TMV 前与接
种后 12 h和 24 h转基因烟草叶片中防卫反应基因
PR-1a、GST1、Pal 和 hsr515 的表达情况 (图 7)。
结果显示,在未接种 TMV 的情况下,转基因烟草、
未转化烟草和转空载体烟草的叶片中 PR-1a、
GST1、Pal和 hsr515 基因表达差异不显著,说明接
种 TMV前转基因烟草处于正常的生理状态。 接
种 TMV 12 h和 24 h 后,转 lec-s 基因烟草 2 个株
系的叶片中 PR-1a、GST1、Pal 和 hsr515 基因均显
著上调表达,说明 TMV 侵染后转基因烟草叶部上
述基因的mRNA快速积累,而在未转化烟草和转
Fig. 7　 qRT-PCR detection of the accumulation of defense-related genes in transgenic plants
A: 12 h post inoculation with TMV; B: 24 h post inoculation with TMV; WT: Wild-type plant; VEC:
Vector transformed plant; T1 -11, T1 -20: Transgenic plant;Data are expressed as means ± SD;
“ ∗ ”: Indicate a significant difference between treatments and vector at P <0. 05.
261
　
　 2 期 　 　 郭佩佩,等:大豆凝集素基因 lec-s转化烟草增强对烟草花叶病毒的抗性
空载体烟草的叶部,TMV 侵染并未造成 PR-1a、
GST1、Pal和 hsr515 基因的上调表达。 由此推断,
在受到 TMV侵染时,lec-s基因编码的大豆凝集素
表达可能是转基因烟草中 PR-1a、GST1、Pal 和
hsr515 基因上调表达所必需的。
3　 结论与讨论
转基因烟草由于其基因转化技术成熟,从侵染
到获得再生苗的周期较短,已被作为一个模式工作
系统,常被用来进行植物抗病性研究。 本研究中我
们对大豆凝集素基因 lec-s进行了转基因烟草及其
抗病性的研究。 获得的转基因烟草表现出对 TMV
的抗性,qRT-PCR的检测结果也表明,与转空载体
烟草相比,转基因烟草中的防卫反应基因显著上调
表达,说明大豆凝集素基因 lec-s 可能参与了植物
的抗病信号通路,从而赋予烟草对 TMV 的抗性,
为该基因应用于植物病害的防治提供了依据。
以往的报道表明,植物凝集素在植物中具有防
御功能。 除几丁质酶之外,凝集素是目前所知的唯
一可以识别并结合昆虫肠胃及真菌、细菌等微生物
表面的糖缀合物的植物蛋白。 在正常情况下,植物
凝集素仅作为储存蛋白而不表现任何特异活性,即
行使其内源功能;一旦植物受到微生物、昆虫等的
危害,植物凝集素就会从植物的受害细胞释放出
来,与病原物或昆虫消化道上特定的糖蛋白结合,
扰乱其正常的生理生化功能,最终表现为对病虫害
的抗性,即行使其外源功能[14]。 目前为止,已经有
许多植物凝集素基因成功地用于植物抗病虫害基
因工程,例如,雪花莲凝集素基因、豌豆外源凝集素
基因、菜豆凝集素基因、苋科凝集素基因以及Ⅱ型
核糖体失活蛋白基因等[15]。
虽然利用植物凝集素基因来防治植物病虫害
已成为国内外生物技术工作者新的研究热点,且不
断有植物凝集素成功应用于植物抗病基因工程的
报道出现,但关于植物凝集素抗植物病毒病机理的
报道,目前仅限于Ⅱ型核糖体失活蛋白,它通过作
用于病毒的毒性链起抗病毒作用[16]。 部分植物凝
集素还具有抗动物囊膜病毒的活性。 动物囊膜病
毒的膜上具有糖蛋白,凝集素与这些糖蛋白结合,
从而抑制囊膜病毒的侵染[17]。 而目前对大豆凝集
素的报道中,还没有与Ⅱ型核糖体失活蛋白性质及
作用机制相似的报道,同时植物病毒的外壳蛋白在
结构上又与动物病毒存在差异。 因此,虽然本研究
发现转大豆凝集素基因的烟草对植物病毒(TMV)
有显著的抗性,但具体的作用方式和机理还需要进
一步研究。
植物对寄生性病原物的抗性可以通过水杨酸
(salicylic acid, SA) 介导的防卫信号通路来实
现[18, 19]。 PR-1a、GST1 是 SA 信号通路的重要基
因;Pal 是苯丙烷类物质代谢有关的基因,参与植
保素、木质素和酚酸类生物合成等;hsr515 是过敏
反应 ( hypersusceptible response, HR ) 标 志 基
因[20 ~ 23]。 本研究中,转基因烟草接种 TMV 后 12
h和 24 h,烟草中防卫基因 PR-1a、Pal 和 GST1 和
HR标志基因 hsr515 均显著上调表达,并且最终表
现为转基因烟草对 TMV 的抗性增强。 推断 lec-s
基因在烟草体内表达,可能同时激活了烟草中的抗
病性 SA 信号通路和过敏性细胞死亡(hypersensi-
tive cell death,HCD)信号通路,赋予烟草对 TMV
的抗性。 在这一点上,大豆凝集素基因的作用和辣
椒甘露糖结合凝集素(Pepper mannose-binding lec-
tins)基因 CaMBL1 类似。 将 CaMBL1 基因转入植
物中,可以提高植物中 SA 的积累量,激活防卫反
应基因并导致类似 HR的植物细胞死亡,从而使植
物对病原物的抗性增强。 而将 CaMBL1 基因在植
物中沉默后,植物对病原物变得敏感,SA 含量下
降,活性氧物质减少,防卫基因的表达量也下降。
这些结果说明 CaMBL1 基因在识别病原微生物
后,通过调控下游的防卫基因和 SA 积累,在植物
的防卫反应中起重要作用[24]。 此外,还有报道表
明木菠萝相关凝集素( Jacalin-related lectins)基因
也表现出类似的功能。 TaJRLL1 基因是一种木菠
萝相关凝集素基因,其编码的蛋白质具有 2 个木菠
萝类似凝集素结构域。 TaJRLL1 基因在植物中表
达时,转基因植株对病原物的抗性增强,SA信号通
路中的相关防卫基因表达水平也增强;反之,如果
将 TaJRLL1 基因在植物中沉默,植株对病原物的
抗性减弱,SA信号通路相关基因的表达水平也降
低,这说明 TaJRLL1 基因可能参与了 SA介导的防
卫信号通路[25]。 lec-s 基因可能和 CaMBL1 基因、
TaJRLL1 基因一样,作为 SA 介导的防卫信号通路
的一个组成部分,参与了植物的抗病信号通路。 为
了进一步明确大豆凝集素的抗病毒功能及其机制,
还需要更深入的研究。
361
　
植物病理学报 43 卷
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责任编辑:于金枝
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