全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(3): 484488 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30571216)和山西省自然科学基金项目(20051071)资助。
第一作者联系方式: E-mail: niuniugood@yahoo.com.cn, Tel: 13835400019
Received(收稿日期): 2010-07-30; Accepted(接受日期): 2010-11-26.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00484
应用 RNA沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒
(TMV)转基因烟草
牛颜冰 王德富 姚 敏 闫 钊 由文鑫
山西农业大学生命科学学院, 山西太谷 030801
摘 要: RNA 沉默是迄今最为有效的抗病毒策略, 利用该策略不但能获得免疫转基因植株, 且所得植株不易与其他
病毒基因重组或异源包壳、生物安全性较高。将本实验室已构建的携带有烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因
(ΔMP)和黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因(ΔRep)反向重复结构的植物表达载体 pBIN438-MP-Rep(i/r), 用农杆菌
浸润法转化普通烟草品种 K326, 共得 196 株转化植株, 经卡那霉素筛选和 PCR 检测发现 128 株为阳性转基因植株;
PCR-Southern和 RT-PCR分析表明外源基因已整合到烟草基因组并在转录水平上得到表达; ELISA结果显示 20.3%的
转基因植株对 CMV 和 TMV 复合侵染表现免疫性。本结果为利用 RNA沉默技术进行植物抗多种病毒育种提供重要
数据, 为防治其他多种病毒复合侵染提供借鉴。
关键词: RNA沉默; 黄瓜花叶病毒; 烟草花叶病毒; 双病毒抗性
Transgenic Tobacco Plants Resistant to Two Viruses via RNA Silencing
NIU Yan-Bing, WANG De-Fu, YAO Min, YAN Zhao, and YOU Wen-Xin
College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
Abstract: RNA silencing is a phenomenon of homologous RNA degradation induced by dsRNA, which is an effective strategy to
obtain virus resistant plants so far. By means of this strategy, higher bio-security immune transgenic plants were obtained, avoid-
ing recombining and transcapsidating with other virus genes. In this study, the recombinant plant expression vector pBIN438-MP-
Rep(i/r) consisting the inverted repeat of TMV-ΔMP and CMV-ΔRep fusion fragment was transformed into tobacco cultivar K326
via Agrobacterium-mediated. The transformants were selected in the culture medium with 100 mg L–1 Kan. One hundred and
ninety-six transgenic plants were obtained, one hundred and twenty-eight of which were positive plants, and the resistance to
CMV and TMV was tested at the degree of virus. PCR-Southern blot and RT-PCR analysis of the transgenic plants demonstrated
that the exogenous DNA was integrated into the tobacco genomic DNA and was expressed in transcriptional level. Resistance
assay indicated that about 20.3% transgenic plants were immune to the co-infection with TMV and CMV. This result will provide
to crops an important reference for plant anti-viral breeding and for preventing the viral co-infection.
Keywords: RNA silencing; Cucumber mosaic virus; Tobacco mosaic virus; Dual-virus resistance
黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)是
世界范围内分布最广、寄主最多、且极易传播的两
种植物病毒, 它们单一或复合侵染均能引起农作物
的严重病害, 后者的危害更为严重。因此寻求一种
快捷、有效的病毒复合侵染防治策略显得尤为迫切
和重要。利用病毒基因转化植物获取抗病毒植株是
当前防治病毒病害的重要途径。已有研究将不同植
物病毒的衣壳蛋白(CP)基因构建到不同表达盒中 ,
通过表达病毒衣壳蛋白而使转基因植株产生对多种
病毒的抗性[1-3]。但这种方法获得高抗转基因植物的
几率较小, 且该策略还存在异源重组等生态安全性
问题[4]。RNA 沉默是由双链 RNA(dsRNA)引发的一
种细胞内 mRNA 特异降解现象, 即发生沉默的基因
转录仍然正常进行, 而合成的 mRNA 在细胞质中发
生了序列特异性降解, 导致基因不能正常表达成蛋
白质[5]。RNA 沉默技术的应用, 为我们提供了一条
更为有效、安全的抗病毒新策略[6]。可通过将同一
病毒不同株系或不同病毒的有效核酸片段拼接, 构
第 3期 牛颜冰等: 应用 RNA沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草 485


建植物表达载体导入植物, 获得同时抗多种病毒的
转基因植株。Jan等[7]将完整的芜菁花叶病毒的衣壳
蛋白基因(TuMV-CP)与番茄斑萎病毒的核基因片段
[218 bp(3/4N)]拼接转化烟草, 获得同时抗芜菁花叶
病毒和番茄斑萎病毒的转基因植株, 白庆荣等 [8]将
非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和
非翻译的马铃薯 Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组
成嵌合基因转化烟草 NC89, 获得对 PVX和 PVY混
合侵染表现免疫的转基因植株, 朱常香等 [9]将马铃
薯 Y 病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶
病毒(CMV)部分 CP基因拼接, 构建反向重复结构嵌
合基因的植物表达载体转化烟草 NC89, 获得同时
高抗 3 种病毒的转基因烟草。本研究以黄瓜花叶病
毒和烟草花叶病毒危害严重的烟草为研究材料, 将
已构建的含有 TMV 部分移动蛋白基因 (ΔMP)和
CMV部分复制酶基因(ΔRep)融合基因的反向重复结
构的植物表达载体 pBIN438-MP-Rep(i/r)转化烟草 ,
获得同时抗 CMV和 TMV的转基因植株, 为保护烟
草生产的可持续发展提供技术支持和理论依据, 并
为利用 RNA 沉默技术进行植物多抗病毒育种提供
重要数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)由
浙江大学提供。植物转化受体普通烟草(Nicotiana
tabacum)品种为K326, 农杆菌 LBA4404为本实验室
保存。植物表达载体 pBIN438-MP-Rep(i/r)由本实验
室构建[10](图 1), 该质粒的 T-DNA区段携有 D35S启
动子驱动的 MP-Rep-intron-Rep-MP基因。



图 1 植物双价表达载体 pBIN438-MP-Rep-intron-Rep-MP
T-DNA区简图
Fig. 1 The schematic map of T-DNA region of
pBIN438-MP-Rep(i/r)

限制性内切酶 Sal I、BamH I为 NEB公司产品;
TRIZOL试剂为 Invitrogen公司产品; DIG DNA La-
beling and Detection Kit和尼龙膜购自 Roche公司;
一步法 RT-PCR 试剂盒、质粒小量制备试剂盒为天根
生化科技有限公司产品; 胶回收试剂盒购于 Promega
公司; 乙酰丁香酮、Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR
引物合成、RNA酶抑制剂、卡那霉素、链霉素、激
素类为北京博迈德科技发展有限公司产品; 其余试
剂为进口或国产分析纯。
1.2 转基因植株的获得
采用冻融法将获得的植物双价表达载体
pBIN438-MP-Rep(i/r)导入农杆菌 LBA4404, 叶盘法转
化普通烟草 K326, 通过卡那霉素抗性筛选再生植株。
1.3 转基因植株的 PCR检测
采用 CTAB 法提取抗性植株和未转化植株叶片
总 DNA 进行 PCR 扩增,同时以质粒(含目的基因)为
阳性对照, 未转化植株 DNA 为阴性对照。其 PCR
程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min; 53℃退火
1 min; 72℃延伸 1 min; 30个循环; 72℃延伸 10 min,
4℃保存 1 h。反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 转基因植株的 PCR-Southern blot分析
按《分子克隆试验指南》 [11]上的方法进行
Southern 杂交。以构建的反向重复片段中的 MP 基
因为模板, 采用随机引物法合成探针, 地高辛进行
标记。
1.5 转基因植株的 RT-PCR分析
用 TRIZOL 试剂提取烟草叶片总 RNA, 并使用
扩增级DNase I (RNase free)对提取的总RNA进行处
理以除去污染的 DNA。RT-PCR程序为 50℃反转录
30 min; 94℃初变性 5 min; 94℃变性 1 min; 53℃退火
1 min; 72℃延伸1 min; 30个循环后72℃再延伸10 min,
4℃保存 1 h。反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 转基因植株的抗病性分析
待转基因植株长至 5~6叶期时, 取感染 TMV或
CMV 的烟草叶片分别按 1∶10 (W/V)比例用磷酸缓
冲液(PB, pH 7.4)研磨,进行汁液摩擦接种。采用 TMV
和 CMV 间隔接种和 2 种病毒同时混合接种。接种
后, 每隔 7 d观察并记录症状; 接种后 50 d, 用间接
ELISA 法[1]检测烟草中的病毒含量。以非转基因植
株为阴性对照, 通过症状观察和植株体内病毒含量
来确定转基因植株抗病类型。
2 结果与分析
2.1 转基因植株的获得
将构建的植物表达载体 pBIN438-MP-Rep(i/r)通
过冻融法转入农杆菌 LBA4404, 采用叶盘法转化烟
草 K326, 获转基因植株 196 株, 经卡那霉素筛选获
128株抗性植株, 都能正常生长、开花和结籽(图 2)。
486 作 物 学 报 第 37卷



图 2 转基因烟草植株开花(A)和结籽(B)
Fig. 2 Flowering (A) and seed-setting (B) of transgenic
tobacco plants

2.2 转基因植株的 PCR检测
提取抗性植株叶片总 DNA 进行 PCR 扩增, 以
未转化植株为阴性对照, 质粒含目的基因为阳性对
照(本实验取目的基因 pBIN438-MP-Rep(i/r)中大约
500 bp长度的 MP片段为检测对象)。扩增产物的电
泳结果(图 3)表明, 抗性植株和质粒在 500 bp附近均
有特异条带, 而阴性对照植株却未扩增出相应的特
异条带 , 由此初步证实目的基因 pBIN438-MP-Rep
(i/r)己转入烟草中。



图 3 部分转基因烟草植株的 PCR检测
Fig. 3 PCR detection of transformed tobacco plants
M: 2 kb DNA marker; CK: 空白对照(水); 1: 质粒阳性对照;
2: 未转化植株; 3~9: 不同转基因植株。
M: 2 kb DNA marker; CK: blank (H2O); 1: plasmid positive control;
2: non-transformed tobacco plant; 3–9: different transformed
tobacco plants.

2.3 转基因植株 PCR-Southern blot杂交分析
为进一步明确转基因植株整合的真实性 , 对
PCR阳性植株进行了 PCR-Southern杂交(图 4), PCR
阳性植株都具有与阳性对照相同大小的 500 bp的杂
交带, 仍表现为阳性, 而阴性对照植株没有杂交出
任何条带, 说明目的基因 pBIN438-MP-Rep(i/r)确实
已整合进烟草基因组中, 获得了转基因植株。但从
图中还可看出部分转基因植株的杂交信号比阳性对
照稍弱,可能是二者 DNA 模板量不同, 导致所含目
的片段浓度不同的缘故。


图 4 部分转基因植株的 PCR-Southern杂交结果
Fig. 4 PCR-Southern analysis of transformed tobacco plants
M: 2 kb DNA marker; 1: 质粒阳性对照; 2~6: 不同转基因植株;
7: 未转化植株阴性对照。
M: 2 kb DNA marker; 1: plasmid positive control; 2–6: different
transgenic plants; 7: non-transgenic negative control.

2.4 转基因植株 RT-PCR分析
取经 PCR-Southern 杂交分析阳性的转基因植株,
以 TRIZOL 法提取总 RNA, 进行 RT-PCR 分析。从
电泳结果(图 5)可以看出, 非转基因植株和空白对照
都没有扩增出特异性条带, 而转基因植株扩增出大
约 500 bp的特异性条带, 表明插入的外源基因已在
转录水平上得到表达。



图 5 部分转基因烟草的 RT-PCR检测结果
Fig. 5 RT-PCR detection of transformed tobacco
M: 2 kb DNA marker; CK0: 空白对照(水); CK1: 未转化植株;
1~6, 10~12: 不同转基因植株; 7~8: 阴性对照(7: 未加 RNA模板;
8: 未加反转录酶); 9: 阳性对照(模板为 DNA)。
M: 2 kb DNA marker; CK0: blank (H2O); CK1: non-transgenic
plants; 1–6, 10–12: different transgenic plants; 7–8: negative
control (7: no RNA template; 8: no reverse transcriptase);
9: positive control (using DNA as template).

2.5 转基因植株抗病性分析
对每一阳性的转化植株进行无性扩繁 , 用
CMV、TMV的病汁液对六叶期的无性扩繁苗攻毒。
将其划分为 3种抗病表现型即免疫型(植株在整个生
育期未检测到病毒), 抗病型(植株前期无病毒, 但在
接种后 50 d 检测到少量病毒)和感病型(植株与对照
发病相似, 但稍轻)。
第 3期 牛颜冰等: 应用 RNA沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草 487


接种 CMV、TMV 病毒后 50 d, 转化植株的
ELISA 检测结果见表 1 (表 1 中仅列出了经 PCR-
Southern 杂交和 RT-PCR 分析的部分转基因植株的
ELISA检测结果)。所有的非转化烟草接种病毒后 25
d, 均表现病毒的典型症状, 后期植株下部叶片易干
枯下垂, 植株严重矮化, ELISA结果显示植株体内 2
种病毒含量明显高于阴性对照; 而转化植株间隔接
种 2种病毒后, 在 108株转化植株中有 22株表现为
免疫型植株, 26株为抗病型植株; 在 2种病毒混合接
种试验中, 84 株转化植株中有 16 株为免疫型植株,
19 株为抗病型植株; ELISA 检测显示, 免疫型植株
体内 2 种病毒含量与阴性对照差异不显著; 在 2 种
接种方式中 , 免疫型植株的比例分别为 20.3%和
19.0%。这表明所构建的包含 2种病毒融合基因的反
向重复结构转基因确实赋予转基因植株对 2 种病毒
一定水平的抗性。
3 讨论
早期的有关研究绝大多数是将不同植物病毒的
衣壳蛋白(CP)基因构建到不同的表达盒中, 通过表
达病毒衣壳蛋白而使转基因植株产生对多种病毒的
抗性[1-3]。但该策略对病毒只表现出中高度抗性, 而
不能完全抵抗病毒的侵染, 且在转基因植株细胞内
表达的某一病毒的衣壳蛋白有可能与自然界其他病
毒发生异源重组而导致危险性病毒的非正常传播[4]。
而本研究应用 RNA沉默技术, 将 CMV-ΔRep基因和
TMV-ΔMP 基因融合, 构建融合基因的反向重复结
构的植物表达载体, 导入烟草, 获得了 20.3%左右
的高抗 CMV 和 TMV 的转基因植株, 其优点在于,
转基因不产生蛋白质, 从而消除了 CMV和 TMV与
自然界其他病毒基因重组的可能 ,大大提高了转基
因植物的生物安全性。
RNA沉默(RNA silencing)是发生在RNA水平的
基于核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的
一种调控机制 ,是植物固有的一种抗病毒侵染的普
遍防卫反应[12]。双链 RNA(dsRNA)可诱导该过程的
起始, 构建能表达 dsRNA的转基因植物是目前防治
植物病毒病害的有效途径之一 [13-14]。有研究发现,
在含非发夹 RNA(hpRNA)结构外源基因的转基因植
物, 产生基因沉默的几率一般低于 10%; 而转录后
能形成 dsRNA的转基因诱发基因沉默的几率可高达
60%~100%[15-18]。本研究以构建的包含 CMV和 TMV

表 1 部分转基因植株的 ELISA检测结果
Table 1 ELISA detection for the transgenic plants by PCR-Southern and RT-PCR analysis
TMV CMV
接种方式
Inoculation methods
材料
Material
病毒含量
Virus concentration
(OD405±SD)
抗病表现型
Response
病毒含量
Virus concentration
(OD405±SD)
抗病表现型
Response
P1-8 0.027±0.005 f i 0.020±0.005 f i
P2-6 0.318±0.007 b S 0.214±0.005 c S
P3-9 0.253±0.006 d S 0.212±0.004 c S
P4-4 0.031±0.003 f i 0.021±0.010 ef i
P5-3 0.313±0.009 c S 0.228±0.005 b S
P5-6 0.052±0.006 e R 0.056±0.005 d R
+CK 0.323±0.008 a S 0.238±0.006 a S
CMV和TMV间隔接种
Inoculation with TMV
and CMV, in turn
–CK 0.028±0.004 f — 0.027±0.003 e —

P9-6 0.034±0.003 e i 0.025±0.005 e i
P11-2 0.226±0.005 b S 0.205±0.010 c S
P13-5 0.218±0.006 c S 0.237±0.004 a S
P7-8 0.045±0.008 d R 0.043±0.005 d R
P15-7 0.230±0.010 ab S 0.224±0.008 b S
P7-1 0.032±0.005 ef i 0.029±0.008 e i
+CK 0.236±0.004 a S 0.241±0.005 a S
CMV和TMV混合接种
Inoculation with TMV
and CMV, mixture
–CK 0.026±0.004 f — 0.024±0.006 e —
Pm-n: different transgenic plants; +CK: non-transgenic plants inoculated with TMV and CMV; –CK: non-transgenic plants with no vi-
rus infection; i: immunity plants; S: susceptive plants; R: resistant plants. Values with different letters are significantly different at the 0.05
probability level.
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病毒部分基因的融合基因的 hpRNA 结构植物表达
载体进行转基因, 结果表明有 20.3%的转基因植株
高抗两种病毒的侵染。进一步证明 dsRNA在基因沉
默中的关键性, 同样可高水平地诱导多病毒的融合
基因发生转录后基因沉默(PTGS), 进而达到同时抗
多种相关病毒的能力。至于转反向重复结构的转基
因植株其抗病效果能否在后代稳定遗传, 还有待进
一步研究。笔者将进一步进行温室大规模试验,为以
后进入大田应用试验,促使转基因表达 dsRNA 抗植
物病毒技术产业化应用提供理论基础。
4 结论
应用 RNA沉默技术, 以农杆菌浸润法将烟草花
叶病毒部分移动蛋白基因(ΔMP)和黄瓜花叶病毒部
分复制酶基因(ΔRep)融合后构建的反向重复结构的
植物表达载体转化烟草 , 获得了同时抗 CMV 和
TMV病毒复合侵染的转基因植株。
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