全 文 ：第27卷 第12期
2015年12月
Vol. 27, No. 12
Dec., 2015
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2015)12-1489-05
DOI: 10.13376/j.cbls/2015208
∙ 发现的历程 ∙
收稿日期：2015-11-27
*通信作者：E-mail: zhongcuiqing@sibcb.ac.cn
“人造精子”与CRISPR-Cas9
钟翠青*，李劲松
(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031)
编者按：小鼠单倍体胚胎干细胞系的建立为遗传学的正反向筛选提供
了一种简便而又有效的工具。除此之外，孤雄单倍体胚胎干细胞能替
代精子使卵母细胞“受精”这一特性，更是实现了从细胞水平向动物
水平的完美转变。无论是从制备多基因遗传操作动物模型的角度，还
是在小鼠个体水平遗传筛选的层面，孤雄单倍体胚胎干细胞的出现都
将为基因功能学研究带来新的生命力。然而，孤雄单倍体的“受精”
能力极其有限，其产生健康半克隆小鼠的效率仅约 2%，这也成为孤雄
单倍体在个体水平广泛应用所面临并且亟需突破的一大瓶颈。通过正
反面的实验验证，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生
物学研究所李劲松课题组发现，雄性印记区域 H19-DMR和 IG-DMR
的异常去甲基化是半克隆小鼠发育异常的“祸根”。通过敲除这两个
DMR，成功将半克隆小鼠的出生效率提高至 20%，为利用孤雄单倍体
获得多基因遗传操作动物模型提供了最根本有力的保障。最后，结合
CRISPR-Cas9技术，他们创建了孤雄单倍体的 sgRNA 文库，并成功将
此“细胞文库”转化成携带基因突变的“小鼠文库”，由此创建了“个
体水平”遗传筛选的新方法、新思路。
近几年，小鼠单倍体胚胎干细胞的相关研究进
行得如火如荼。2011年，Anton Wutz 和 Josef M.
Penniger两个研究团队相继建立了小鼠的孤雌单倍
体胚胎干细胞，并成功将这种单倍体细胞运用于遗
传学的正向和反向筛选 [1-3]。随后，李劲松研究员
和周琪研究员带领的研究团队先后在体外获得了小
鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞 [4-5]。研究表明，这种
孤雄单倍体可以通过卵母细胞注射的方法 (称为
ICAHCI技术 )代替精子使卵母细胞发生“受精”，
进而产生后代——半克隆小鼠 (SC小鼠 )。因此，
这种孤雄单倍体胚胎干细胞也被称作“人造精子”，
这一技术也称为半克隆技术。众所周知，传统的基
因打靶是在胚胎干细胞水平进行遗传操作，而后通
过囊胚注射的方法实现生殖系的传递进而获得遗传
修饰的动物模型。而体外建立的孤雄单倍体同样具
有胚胎干细胞所具有的特性。因此，这种单倍体胚
胎干细胞也可以在体外进行任意的遗传修饰，进而
通过卵母细胞注射的方法进一步得到遗传修饰的小
鼠模型。利用此方法可以减少后代反复交配所耗费
的时间和产生的工作量。然而，研究发现 ICAHCI
产生半克隆小鼠的效率极低，并且进行遗传操作之
后孤雄单倍体的“受精”能力会进一步下降，这让
孤雄单倍体在制备遗传操作小鼠上的运用遇到了一
个无法逾越的障碍 [4-6]。
与此同时，CRISPR-Cas9技术的出现为实现基
因编辑的高效性和简便性带来了光明，也大大推进
了基因功能学研究的进程 [7-9]。利用 CRISPR-Cas9
技术可以轻而易举地实现细胞水平上基因编辑的同
时，也可以通过受精卵胞浆注射的方法快速获得遗
传修饰的动物个体 [10]。然而，利用 CRISPR-Cas9
制备动物模型也存在一些问题，例如遗传操作的动
物模型在 F0代存在基因型的不确定性，存在很高
生命科学 第27卷1490
比例的基因型嵌合；此外，一次性制备多基因编辑
的动物模型也较为困难和繁琐等。然而，利用孤雄
单倍体干细胞的渠道，可以在胚胎干细胞水平对基
因组进行任意的编辑，例如基因的敲除和敲入，然
后通过 ICAHCI技术将细胞水平上相应的基因修饰
进一步转化成动物模型，尤其是在获得多基因敲入
小鼠上的优势显现得更加突出。因为无论是利用传
统的基因打靶还是 CRISPR-Cas9的方法，都会在生
殖系传递交配过程发生基因型分离。倘若能突破半
克隆小鼠出生效率低的瓶颈，这将会大大简化和缩
短获得无嵌合及多基因遗传修饰动物模型所需的操
作流程和时间。
近期，CRISPR-Cas9文库的产生及其细胞水平
的大规模筛选将 CRISPR-Cas9技术推向一个更高的
层次 [11-13]。研究者将 CRISPR-sgRNA文库通过病毒
的方式导入到细胞中，利用 sgRNA/Cas9复合物对
基因组的切割能力，在全基因组水平中实现基因的
功能缺失，进而对细胞的生物学过程进行大规模的
遗传学筛选。然而，假若生物学过程的研究能够从
“平面”的细胞上升到“立体”的个体水平，即在
个体的层面上进行生理过程的揭示和阐述，对还原
生命的发生过程及其本质更具有指导意义。目前，
CRISPR-Cas9文库实现的种种筛选大部分仍只能停
留在细胞水平的层面上，很难模拟生物个体中生物
学过程发生的复杂性以及真实性。而 2015年 3月
Phillip Sharp 与张峰研究团队在 Cell杂志上首次运
用 CRISPR-Cas9文库，以小鼠的肺癌为模型，进行
动物组织水平的大规模遗传筛选，为 CRISPR-Cas9
在动物体内的遗传学筛选开启了新的大门 [14]。研究
者利用 Cas9表达的小鼠为载体，其肺癌的发生和
转移为研究目标，CRISPR-sgRNA文库为手段，研
究小鼠肺癌发生与转移的“制造者”。通过将突变
的细胞文库移植到小鼠中，研究者时刻追踪小鼠的
肿瘤形成以及转移情况，然后对形成的肿瘤所携带
的 sgRNA进行测序。最终，研究者获得了一些导
致肺癌发生和转移的已知基因，同时挖掘出一些可
能诱发肺癌发生和转移的未知基因。这些未知基因
也通过小文库的方式得到了进一步的验证。很显然，
这种动物组织水平的遗传筛选比细胞层面的筛选更
有优势。首先，小鼠的肺癌发生和转移无法在体外
进行模拟；其次，对于癌症的发生来说，生物个体
的微环境极其重要。倘若能够运用 CRISPR-Cas9文
库实现一个小鼠个体的全文库或者小文库遗传学筛
选，这将对生命科学的研究产生重要而又深远的影
响。目前，利用 CRISPR-Cas9文库进行个体水平的
遗传学筛选依旧是一个空白。因为仅采用目前的受
精卵胞浆注射 sgRNA文库的方法获得小鼠个体文
库是非常耗时费力的。那么，如果能寻找到一个“中
间体”，既能够携带 sgRNA文库，又能将所携带的
文库进一步转化成小鼠文库，那么就真正能实现哺
乳动物个体水平的遗传筛选，从而填补生命科学研
究手段的一个空白。很显然，本实验室所建立的小
鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系将是一个极其有效的
“媒介”。首先，这种细胞是胚胎干细胞，具有胚胎
干细胞无限增殖和胚层分化的特性，因此可以在细
胞水平进行 CRISPR-Cas9文库的导入和筛选。除此
之外，这种细胞系是“单倍体”，可以像精子一样
让卵母细胞发生“受精”，如此，就能有效地将细
胞水平的遗传操作传递给动物个体。
然而，无论是利用孤雄单倍体胚胎干细胞获得
遗传操作模型，还是实现小鼠个体文库的遗传筛选，
都应该以半克隆技术能高效产生小鼠为前提。因此，
寻找到导致半克隆小鼠出生效率低以及建立提高小
鼠出生率的对策迫在眉睫。
之前的研究结果已经提示了半克隆小鼠发育异
常的原因：即 H19-DMR区域的甲基化无论在细胞
还是异常的半克隆小鼠中均出现异常的擦除 [4]。而
小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞所有的遗传物质来源
于精子，并且部分保留了精子所具有的表观遗传特
性，包括基因印记。H19-DMR和 IG-DMR是雄性
印记中两个极其重要的印记区域 [15-16]，其在父本中
表现为 DNA的甲基化状态，在母本中则相反。这
两个甲基化差异区域 (DMR)的甲基化异常能够阻
碍小鼠的正常胚胎发育，之前的研究也进一步表明
H19-DMR和 IG-DMR的敲除可以有效提高孤雌小
鼠的出生率 [17-18]。实验结果显示，伴随着孤雄单倍
体胚胎干细胞的建立和体外传代培养，H19-DMR
的甲基化出现异常的擦除，并且在发育到期的 SC
小鼠中，正常的 SC小鼠 H19-DMR的甲基化表现
出正常的甲基化水平，而生长阻滞型的 SC小鼠则
无一例外地发生了异常的 DNA去甲基化。H19-
DMR的去甲基化能够直接影响 H19-Igf2印记簇
H19和 Igf2的正常表达，进而影响半克隆胚胎的正
常发育。倘若将 H19-DMR敲除，理论上可以部分
模拟 H19-DMR发生甲基化的状态。因此，本课题
组从 H19-DMR敲除的小鼠 [19]的精子中建立了 3株
H19-DMR KO (H19 △ DMR)的孤雄单倍体胚胎干细
胞，并且通过 ICAHCI技术产生半克隆小鼠。结果
钟翠青，等：“人造精子”与CRISPR-Cas9第12期 1491
表明：H19-DMR KO 的 AG-haESCs能够提高正常
SC小鼠的出生效率，出生率在 4%~12%之间浮动。
实验还发现，3株 H19-DMR KO 的 AG-haESCs产
生 SC小鼠的效率大相径庭。2株 H19-DMR KO 的
AG-haESCs产生 SC小鼠的效率只有 4%左右，并
且产生的 SC小鼠中 1/2为生长发育阻滞的小鼠，
即出生时或出生后 1 h内死亡。而另外一株 H19-
DMR KO 的 AG-haESCs获得 SC小鼠的效率高达
12%，并且其早期代数产生的 SC小鼠基本都是健
康的，但随着细胞传代次数增加，逐渐出现生长阻
滞型的 SC小鼠。针对另一个重要的雄性印记 IG-
DMR进行甲基化分析，结果发现 H19-DMR KO 的
AG-haESCs其 SC小鼠出生效率与 IG-DMR的甲基
化程度呈正相关。H19-DMR KO 的 AG-haESCs其
IG-DMR甲基化维持的越好对其产生 SC小鼠越有
利，而细胞的不断传代和培养所导致的 IG-DMR甲
基化逐渐丢失，会直接影响 SC小鼠的正常发育。
与此同时，本课题组对这些发育异常的 SC小鼠进
行 IG-DMR的甲基化分析，以及对 SC小鼠不同器
官组织中 IG-DMR在 Dlk1-Dio3印记簇的相关印记
基因进行表达水平分析，结果发现：异常小鼠的
IG-DMR甲基化出现严重擦除，伴随着相应印记基
因的表达水平发生异常的上下调。这些结果表明：
在 H19-DMR敲除的情况下，IG-DMR的异常凸显
出来，进而阻碍半克隆胚胎的正常发育。因此，本
课题组采用 CRISPR-Cas9的方法在 IG-DMR的上
下游分别设计一个 sgRNA以实现 IG-DMR的敲除。
在获得这种H19△DMR–IG△DMR–AGH (DKO-AG-haESCs)
双敲的孤雄单倍体胚胎干细胞之后，进行 ICAHCI
实验以监测 SC小鼠的出生情况。研究发现：SC小
鼠的出生效率提升至高达 20%左右，与球形精子
进行卵细胞注射获得后代的效率 (26%)较接近。为
了进一步验证实验结果，本课题组利用 IG-DMR
KO的小鼠精子 [20]建立 IG-DMR KO (IG△ DMR)的孤
雄单倍体胚胎干细胞系，然而其 SC的出生效率只
有 1%~2%。在此基础上，采用相同的策略敲除
H19-DMR，并在获得 IG△ DMR–H19△ DMR–AGH (DKO-
AG-haESCs) 的孤雄单倍体胚胎干细胞后进行
ICAHCI，其产生 SC的效率也是 20%左右。之前
的研究表明：后期代数并且进行基因打靶的孤雄单
倍体很容易丧失产生 SC小鼠的能力。因此通过
CRISPR-Cas9方法，对已经无法产生 SC小鼠的
AG-haESCs进行 H19-DMR和 IG-DMR的敲除，发
现其产生半克隆小鼠的能力获得恢复，效率在 18%
左右。由此可见，H19-DMR和 IG-DMR的异常甲
基化是孤雄单倍体胚胎干细胞高效产生半克隆小鼠
的两大障碍 [20]。同样，H19-DMR和 IG-DMR对于
胚胎发育的重要性在本课题组后续的关于卵子来源
孤雌单倍体胚胎干细胞高效产生半克隆小鼠的工作
中得到进一步的证实 [22]。
既然双敲的孤雄单倍体 (DKO-AG-haESCs)具
有高效产生 SC小鼠的能力，那么之前关于孤雄单
倍体应用的所有设想都能得以实现。为了验证这些
设想，本课题组首先在 DKO-AG-haESCs水平上进
行多基因遗传操作。结合 CRISPR-Cas9手段，分别
敲除 DKO-AG-haESCs的 Tet家族 (Tet1、2、3)和
p53家族 (p53、p63、p73)，然后通过 ICAHCI一步
获得 Tet家族 (Tet1、2、3)和 p53家族 (p53、p63、
p73)三基因杂合敲除的 SC小鼠。除此之外，还尝
试在 DKO-AG-haESCs上实现精确基因编辑，在
Tet家族的成员 Tet1、2、3末尾分别敲入不同的荧
光报告蛋白，并获得多基因敲入的 SC小鼠。而且
研究发现，这些不同的基因编辑对 DKO-AG-
haESCs获得 SC小鼠的效率并无影响。
最后，为了实现 CRISPR-Cas9所介导的动物
个体水平遗传学筛选，本课题组将 CRISPR sgRNA
文库通过慢病毒的方式导入到单倍体，并尽量保证
每个细胞携带一个针对不同基因的 sgRNA，由此得
到CRISPR sgRNA的细胞文库。为了实现基因突变，
通过细胞瞬转 Cas9表达质粒的方法实现了 Cas9在
细胞的表达与基因突变，然后通过 ICAHCI的方法
一步获得携带不同突变的杂合子小鼠文库。由于在
遗传筛选过程中，很多基因为隐性基因，因此本课
题组希望获得双等位基因突变的小鼠文库。为此，
采用将已经瞬转 Cas9并发生突变的 sgRNA单倍体
文库进行 ICAHCI获得半克隆胚胎，并且通过在半
克隆胚胎中注入 Cas9 mRNA使卵母细胞的基因组
(sgRNA来自于注入的单倍体细胞 )也发生突变，
进而一步得到双等位基因突变的 SC小鼠文库。但
是，这种方法在操作上较为复杂。为了简化显微操
作步骤，首先建立 Cas9稳定表达的单倍体细胞株，
并在此基础上感染 CRISPR sgRNA的病毒文库，获
得 Cas9和 sgRNA均稳定表达的 DKO-AG-haESCs。
由于注入卵母细胞的单倍体中携带 Cas9和 sgRNA，
其能够进一步突变卵母细胞的基因组，因此这种方
法能够一步得到双等位基因的 SC小鼠文库。
相比于目前已有获得遗传修饰小鼠模型的手
段，双敲的孤雄单倍体胚胎干细胞具有以下优势。
生命科学 第27卷1492
其一，遗传修饰的单倍体细胞可以进行预筛选和分
析，以保证获得的 SC小鼠是特定的目的遗传修饰，
并且避免了 CRISPR-Cas9受精卵胞浆注射所遇到的
嵌合问题；其二，双敲的孤雄单倍体获得 SC小鼠
的效率和存活率很高，可以保证获得足够多的后代
以满足表型的分析；其三，携带 CRISPR sgRNA文
库和 Cas9表达的双敲单倍体细胞可以运用于个体
水平的遗传学筛选。不同的 SC小鼠可以通过同一
对引物 PCR测序的方法鉴定出其携带的 sgRNA，
进一步通过分析该 sgRNA针对的基因序列确定该
小鼠是否发生基因突变。这类似于每个 SC小鼠带
有自己的“条形码”，只要知道这只小鼠携带的
sgRNA，就能分析出该小鼠携带何种基因突变。当
然，目前利用单倍体干细胞与 CRISPR-Cas9文库实
现个体水平的遗传筛选也遇到了如下问题。(1)获
得的 SC小鼠中双等位基因突变的效率还有待进一
步的提高。(2)获得全基因的 SC小鼠文库相当耗时
费力，并且需要非常大的小鼠平台支持，对于单个
实验室来说是不可行的。因此，建议采用小文库的
方案会比较可行。(3)后续的 SC小鼠表现分析也较
为复杂。除此之外，很多实验室需要一定的时间去
掌握单倍体胚胎干细胞的培养和 ICAHCI技术。总
之，利用双敲孤雄单倍体胚胎干细胞产生多基因敲
除或敲入的动物模型将会是一个很好的手段 (图 1)。
尤其是，结合 CRISPR sgRNA文库，双敲的单倍体
可以作为一种强有力的“媒介”进行大规模筛选 (包
括研究发育、疾病发生等生物学过程 )。
当然，最后，本课题组希望能够进一步揭示雄
性印记区域 H19-DMR和 IG-DMR促进胚胎正常发
育并高效产生 SC小鼠的潜在机制，进而对印记基
因存在的意义及其如何调控胚胎的发育有更加深刻
的理解。
图1 双敲的孤雄单倍体胚胎干细胞有效运用于建立多基因遗传操作小鼠模型以及产生CRISPR-sgRNA小鼠文库
钟翠青，等：“人造精子”与CRISPR-Cas9第12期 1493
致谢：感谢导师李劲松研究员，感谢他为我的成长
和课题进展倾注大量的心血。感谢实验室的副研究
员吴宇轩老师、计算所的杨力研究员对工作的悉心
指导与帮助。除此之外，还需要感谢合作伙伴尹奇、
谢振飞、白梅竹和董瑞，正是我们之间相互默契的
配合，才使这项工作进展顺利并最终完成。
[参 考 文 献]
[1] Leeb M, Wutz A. Derivation of haploid embryonic stem
cells from mouse embryos. Nature, 2011, 479: 131-4
[2] Elling U, Taubenschmid J, Wirnsberger G, et al. Forward
and reverse genetics through derivation of haploid mouse
embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2011, 9: 563-74
[3] Leeb M, Dietmann S, Paramor M, et al. Genetic
exploration of the exit from self-renewal using haploid
embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2014, 14: 385-93
[4] Yang H, Shi L, Wang BA, et al. Generation of genetically
modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid
embryonic stem cells. Cell, 2012, 149: 605-17
[5] Li W, Shuai L, Wan H, et al. Androgenetic haploid
embryonic stem cells produce live transgenic mice.
Nature, 2012, 490: 407-11
[6] Shi L, Yang H, Li J. Haploid embryonic stem cells: an
ideal tool for mammalian genetic analyses. Protein Cell,
2012, 3: 806-10
[7] Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new
frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.
Science, 2014, 346: 1258096
[8] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome
engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013,
339: 819-23
[9] Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human
genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339: 823-26
[10] Wang H, Yang H, Shivalila CS, et al. One-step generation
of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/
Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013, 153: 910-8
[11] Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, et al. Genome-scale
CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.
Science, 2014, 343: 84-7
[12] Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, et al. Genetic screens in
human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science,
2014, 343: 80-4
[13] Koike-Yusa H, Li Y, Tan EP, et al. Genome-wide recessive
genetic screening in mammalian cells with a lentiviral
CRISPR-guide RNA library. Nat Biotechnol, 2014, 32:
267-73
[14] Chen S, Sanjana NE, Zheng K, et al. Genome-wide
CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and
metastasis. Cell, 2015, 160: 1246-60
[15] Barlow DP, Bartolomei MS. Genomic imprinting in
mammals. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2014, 6:
a018382
[16] Bartolomei MS. Genomic imprinting: employing and
avoiding epigenetic processes. Genes Dev, 2009, 23:
2124-33
[17] Kono T, Obata Y, Wu Q, et al. Birth of parthenogenetic
mice that can develop to adulthood. Nature, 2004, 428:
860-4
[18] Kawahara M, Wu Q, Takahashi N, et al. High-frequency
generation of viable mice from engineered bi-maternal
embryos. Nat Biotechnol, 2007, 25: 1045-50
[19] Thorvaldsen JL, Mann MR, Nwoko O, et al. Analysis of
sequence upstream of the endogenous H19 gene reveals
elements both essential and dispensable for imprinting.
Mol Cell Biol, 2002, 22: 2450-62
[20] Lin SP, Youngson N, Takada S, et al. Asymmetric
regulation of imprinting on the maternal and paternal
chromosomes at the Dlk1-Gtl2 imprinted cluster on mouse
chromosome 12. Nat Genet, 2003, 35: 97-102
[21] Zhong C, Yin Q, Xie Z, et al. CRISPR-Cas9-mediated
genetic screening in mice with haploid embryonic stem
cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell, 2015,
17: 1-12
[22] Zhong C, Yin Q, Xie Z, et al. Parthenogenetic haploid
embryonic stem cells efficiently support mice generation
by oocyte injection. Cell Res, 2015 [Epub ahead of print]