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生物技术通报

研究报告
          BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2006年第 2期
银杏 DNA提取及 RAPD分析*
余立辉
张楚英
梁红**
(仲恺农业技术学院生物技术研究所,广州
510225)
摘
要:
采用 SDS 裂解液和苯酚/氯仿/异戊醇 提取液从银杏叶中提取银杏总 DNA,并进行 DNA 样品分光
光度测定和琼脂糖凝胶电泳分析。通过引物筛选和反应参数优化, 选用 3 个随机引物对 DNA 样品进行 RAPD 扩
增,获得较为清晰并有一定多态性差异的扩增谱带, 初步摸索出适合于以银杏叶为材料的 DNA 提取方法和 RAPD
扩增程序,为研究银杏遗传多态性及种质资源研究提供一种实用的分析方法。
关键词:
银杏
DNA
RAPD
Extract of DNA from Ginkgo Leaves and its RAPD Amplification
Yu Lihui
Zhang Chuying
Liang H ong
( Biotechnology inst itut e , Zh ong kai Unive rsi ty of A gr ic ul tur e and Te chnolog y , G uangz h ou
510225)
Abstract:
The total DNA w as ext racted from g inkgo leaves w ith SDS lysate and pheno l/ chlor oform/ iso amyl
ex tr act . The DNA was determined by spectropho tog raphy and analyzed by electr opho resis. 10 random pr imers were
used in RAPD amplif ication of t he g inkgo DNA and 3 of them produced amplificat ion bands in electrophor etog ram.
Through par amet er optim izat ion, distinct bands of amplificates with some diver sity w ere found in electrophor eto

g ram. A proper method for ginkgo DNA ex tr act and a suitable procedure fo r RAPD am plification w ere established.
This pr ov ides a practical ana lyt ic method fo r studies on genet ic div ersity and germplasm resour ces in g inkgo.
Key words:
Ginkgo
DNA
RAPD


银杏( Ginkgo bi loba L. )也称白果树,为原产我国的活化石植物, 雌雄异株。由于其在科学上和经济上
的意义而较多地被研究。银杏目植物起源于距今三亿多年前的古生代石炭纪, 而中生代侏罗纪是银杏目植
物发展的全盛时期[ 1] 。根据化石研究资料和品种资源调查, 地球上曾经出现的银杏目植物有共有 20余属
150多种,现仅存单科、单属、单种,即 Ginkgo biloba L . [ 2, 3]。我国是银杏栽培和白果生产的大国, 资源总量
占全世界的 90%以上。我国栽培的银杏品种繁多, 但由于没有统一的品种划分标准, 特别是相当部分栽培
品种均未进行品种审定, 在品种的认定和推广应用上存在着一定的混乱,同种异名或同名异种的现象时有发
生。为此,我们开展了本研究,以期在分子生物学方面为银杏资源的分类和遗传多态性分析提供一些证据。
1
材料与方法
1. 1
植物材料
本试验所用材料为园子类银杏(暂定名为
广东园子
)雌、雄株,枝条取自广东省南雄市坪田镇, 1999年
冬嫁接于仲恺农业技术学院(于广州市)的银杏圃内,取当年生鲜叶作为 DNA 提取材料,即取即用。
1. 2
DNA 提取
取鲜叶 1 g 于研砵中加液氮磨成粉末后加入 2 m l SDS裂解液( 1. 25% SDS, 100 mM Tris
HCl, 5 mM
EDTA, 500 mM NaCl, 1% 巯基乙醇, 1% PVP, pH 7. 5)磨成匀浆,于 65
中水浴 30 min后 10 000 rpm 离
心 8 min。取上清液加入 1/ 10体积 3 M NaAc,混匀后再加入等体积 苯酚/氯仿/异戊醇( 12: 12: 1)提取液,
收稿日期: 2005
10
14

* 基金项目:广东省科技百项重大项目
银杏产业化示范
(编号 99B05903)部分内容
作者简介:余立辉( 1982
) ,男,在校生
** 通信作者:梁红,男,博士,教授,主要研究方向为资源植物学、植物生物技术
轻轻摇匀。10 000 rpm 离心 8 m in,取上清液加等体积氯仿摇匀后再次离心。转移上清液,加入 1/ 10体积 3
M NaAc混匀,再加等体积异丙醇,静置 5 min后再次离心, 倾去上清液,用 75%乙醇洗沉淀两次后自然风
干,保存于
20
冰箱中备用。
DNA 样品用 TBE 缓冲液溶解后, 于 260 nm、280 nm 处用 SmartspecTM 3000型分光光度计(美国 Bio

Rad公司生产)进行浓度测定。并用 0. 8%琼脂糖凝胶进行电泳分离以确定 DNA样品质量。
1. 3
RAPD扩增
RNA 样品用灭菌的重蒸水溶解后, 用上海生工公司生产的随机引物(表 1)和北京鼎国公司生产的 PCR
试剂盒,在 Hema 8000型 PCR仪(珠海黑马公司生产)上进行 RAPD扩增,并用 1. 5%琼脂糖凝胶进行扩增
产物分离。
反应体系如下: 模板 DNA(约 100ng )





1
l
10
缓冲液 2. 5
l
MgCl2 ( 25 mM ) 2
l
dNT P ( 10 mM ) 0. 5
l
引物 ( 5
M ) 1
l
Taq酶 ( 0. 5 U /
l) 4

加灭菌重蒸水至 25
l
反应条件如下: 预变性





94
5 m in
40次循环 94
10 s - 37
60 s - 72
90 s
最后延伸 72
10 min
引物的碱基序列为
1. 5

GAAA CGGGT G
3

2. 5

CAGCACCCA C
3

3. 5

TCT CCCT CAG
3

另有 7个随机引物不能扩增出 DNA带,其序列在此省略不表。
2
结果与分析
2. 1
银杏叶 DNA 提取
以完全伸展的银杏嫩叶为材料,按常规的 SDS法稍作改良, 进行 DNA提取,其 DNA 的提取率可达 1.
43%(雄株)和 0. 18%(雌株)。从表 1可以看出,所提取的 DNA 的 A260/ A280值接近于 1. 80,具有较高的
纯度。以该 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳分离, 可见到 1条清晰明亮的 DNA 带(图 1) , 说明所提取的
DNA 质量较高。虽然在本试验中并没有用 RNA 酶处理样品 DNA, 但电泳图谱中也没有出现明显可辩的
RNA 带,也说明其所含 RNA 相对于 DNA 来说是极少量的。
2. 2
银杏叶 DNA 的 RAPD扩增


以所提取的银杏叶 DNA 为模板, 用 10个随机引物进行 RAPD扩增, 其中有 3个随机引物扩增出 DNA
带, 7个随机引物不能扩增出 DNA 带。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,经 EB 染色后得到电泳图谱
82







生物技术通报 Biotechnology
Bullet in







2006年第 2期
(图 2)。从图 2可以看出,用不同引物的扩增效果是不同的,其 DNA带从 3条到 6条不等, 3号引物的酶带
最少而 2号引物最多;而且,不同引物所扩增的 DNA 带在电泳中的迁移率也有差异。就 1号引物和 2 号引
物的 RAPD扩增而言,雌株和雄株的 DNA 总的带型基本一致, 但也表现出一定的差异。1号引物的扩增结
果是雄株比雌株至少多出 1条 DNA带, 2号引物的扩增结果是雌株比雄株多出 1条 DNA带, 3号引物的扩
增结果是雄株有 DNA 带而雌株却没有 DNA 带,均表现出一定的雌雄性别差异。
图 2
银杏叶 DNA的 RAPD扩增产物电泳图谱
1. 1号引物(
) , 2. 1号引物(
) , 3. 2号引物(
) , 4. 2号引物(
) , 5. 3号引物
(
) , 6. 3号引物(
)
3
讨论
3. 1
银杏 DNA提取
银杏是起源于我国的经济林、果和
药用植物,在植物的进化中处于特珠的
地位,认为是裸子植物向被子植物演化
的过渡类型[ 3~ 5] , 但这些研究均着重于
形态学特征的比较,缺乏分子生物学的
证据。高质量 DNA 的提取分离是进行
分子生物学研究的基础, 可为生物遗传
多态性和亲缘关系的研究提供直接的
分子遗传和微观进化方面的证据。有
关银杏叶 DNA 提取已经有一些成功的报道 [ 6, 7] , 但所提取的 DNA 是否适应于 RAPD扩增或其他的 PCR
扩增,未见有后续的报道。在本研究中,为了除去银杏叶中的酚类和多糖, 在 SDS 提取液中加入 1%的 PVP
和 1%的

巯基乙醇,取得了较理想的效果,所提取的 DNA 样品能满足 RA PD扩增的要求并得到稳定的结
果。
3. 2
RAPD扩增条件的优化
RAPD标记是应用较广泛的一类分子标记, 由于所应用的随机引物与 DNA 模板的互补性并不十分严
格,在扩增过程中所采用的复性温度较低,在一定程度上影响扩增产物的稳定性。因此, 在严格一致的条件
下提取 DNA 样品和反应条件进行优化是保证扩增结果稳定可靠的关键。本研究中,通过模板 DNA 的梯度
试验确定了扩增反应的初始模板 DNA 用量为 50~ 100 ng、Mg2+ 浓度为 2 mM、dNT P 浓度为 50~ 400
M、
Taq酶浓度为 2 U 时扩增效果较佳, 其扩增产物的电泳图谱稳定性好。扩增反应的温度控制也是一个重要
的因素。由于随机引物只有 10b,且多数与模板 DNA 不能严格互补, 必须降低复性温度并相应增加延伸反
应的时间,才能得到较好的扩增效果。本研究中 40个扩增循环的温度确定为 94
( 10s) - 37
( 60s) - 72

( 90s) ,其扩增产物有足够的 DNA量可供电泳分析, DNA 扩增带清晰可见。超过 42个循环并不能增强扩
增效果,电泳图谱反而较为模糊,这可能是由于酶活性下降所致。
银杏是雌雄异株植物,虽然对不同品种雌、雄株的同工酶差异和核型差异进行过深入的研究, 仍未能有
一致性和肯定性的结论[ 8~ 10] 。本研究发现, 同一引物分别扩增雌、雄株的 DNA, 其扩增产物的电泳图谱有
一定差异,这种差异是否为性别相关的遗传标记。还需要进一步的实验数据。由于本研究只以一对雌、雄株
品种为材料,还不能作定论,将继续进行多品种雌、雄株的 RAPD 比较,以期对银杏性别的遗传机理有更全
面更深入的了解。
参 考 文 献
1
曹福亮著.中国银杏. 南京:江苏科学技术出版社, 2002, 12~ 22.
2
郭善基主编.银杏优良品种及其丰产栽培技术. 北京:中国林业出版社, 1996, 1~ 7.
3
梁立兴编著,中国当代银杏大全. 北京:中国林业大学出版社, 1993, 1~ 364.
4
王伏雄,陈祖铿.植物学报, 1983, 25( 3) : 199~ 207.
832006年第 2期









余立辉等:银杏 DNA 提取及 RAPD分析
5
邢世岩,孙霞.武汉植物研究, 1996, 14( 3) : 279~ 286.
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姜玲,蔡礼鸿.植物生理学通讯, 2000, 36( 4) : 340~ 342.
7
潘伟明,梁红,余胜康.仲恺农业技术学院学报, 2002, 15( 2) : 45~ 48.
8
钟海文,杨中汉.果树科学, 1982, 18( 1) : 1~ 4.
9
四川省林科所种源组. 四川林业科技, 1981, ( 4) : 12~ 13.
10
何梅,李懋学.遗传, 1996, 18( 3) : 3~ 5.









基因干预治疗的新星


RNAi
信息交流

第四军医大学王立峰、李莹、刘新平、药立波科研工作者快速发展了 RNA i( RNA inter ference)技术,为
选择性抑制特异性基因的表达提供了有利的工具。RNA i是外源的 ds RNA ( double st rand RNA, > 19 bp)
进入细胞后,激活细胞内的自然存在的加工活性, 引起对侵入的外源 ds RNA 及具有同源序列的单链 RNA
降解(包括内源性的 mRNA)的现象。RNAi技术目的多作为基因功能研究的有利工具,随着 RNAi分子机
制研究的不断深入, 它将成为最有潜力的基因干预治疗方法。
RNAi的简要机制:在动植物细胞中, 细胞内暴露 ds RNA ( double st rand RNA)会导致与其同源的
RNA 的转录后基因沉默 ( PTGS) ; RNAi简单模型: 当 ds RNA 导入细胞后, 被 Dicer 所激活。它是一种
RNase Ⅲ样的酶, 含有一个螺旋结构域 helicase domain 切割成为 21~ 25bp的 siRNA( small interference
RNA, siRNA)。这一个过程需要 ATP 能量, 被切割成 21 ~ 25bp 的 siRN 再与 RNA 诱导沉默复合物
( RNA
induced silencion complex , RISC)结合并激活, s iRNA 在 ATP 提供能量后解链, 以它的反义链作为
模板识别目的 mRNA,引导 RISC对其进行降解,最终抑制目的基因的表达。反义的 siRNA 可能是通过传
统的Watson
Cr ick碱基配对原则,与目的基因特异性结合而执行相应功能。siRNA 的反义链结合到目的
mRNA 后,不仅诱导 RISC 对该基因进行降解, 同时还激活 RdRp( RNA
dependent RNA Polymer ase)介导
的单链 RNA 的合成, 产生大量的 dsRNA。这些 dsRNA 再次被 Dicer 切割成许多 siRNA, 进入下一个
RNAi的循环。为此, 只需要少量的 dsRNA 就可产生高特异性的、高效的基因沉默作用。另外, dsNRA 的
导入还必须避免它介导产生 PKR抑制效应。然而对质粒、病毒载体的改造已提高了转染 RNA或 DNA 的
组织特异性与效率, 若加入布此卡因麻醉剂到 DNA 和脂质体复合物中, 就能提高对哺乳动物的转染效率。
对 RNAi与基因组功能的研究,可找到特异受体, 酶或其他效应分子与激活效应的关系。早期实验通过
转染长链 dsRNA 诱导 RNAi,引起基因沉默,从而可在果蝇中分析胰岛素的信号转导途径。RNAi可以抑
制病毒的复制和感染;若用 RNAi,以 M
BCR/ ABL 的融合处作靶位点,可封闭 M
BCR/ ABL 的表达。因为
M
BCR/ ABL 的融合只在白血病细胞中才存在, 且 M
BCR/ ABL 的敲除强烈诱导细胞已凋亡, 故可间接起
到选择性杀伤白血病细胞的作用。
RNAi技术是一种很有用的研究工具,且在基因干预治疗应用中有很大的潜力,它将会在应用前景中超
过反义核酸技术和三链结构复合体技术,不久很快成为一种最有效的基因治疗手段应用于临床。 秦春圃
(上接第 80页) 参 考 文 献
1
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马传喜,吴兆苏.作物学报, 1993, 19( 16) : 562~ 566.
4
Payne PI, Law CN, Mudd EE. T heor Appl Genet , 1980, 58: 113~ 120.
5
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生物技术通报 Biotechnology
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2006年第 2期