全 文 ：# 综述与专论#
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
水稻条纹病毒研究进展
邓召花 张飞云*
(首都师范大学生命科学学院,北京 100037)
摘 要: 水稻条纹病毒引起的水稻条纹叶枯病在水稻种植区造成巨大的经济损失, 有关病毒本身及抗病基
因一直是近年研究的热点。根据近年的研究成果,综述在病毒的核酸、蛋白质、抗病基因及应用基因工程控制病害
等方面的研究进展, 并对利用抗病基因工程策略控制病害的应用前景进行了展望。
关键词: 水稻条纹病毒 抗病毒基因 抗病毒蛋白
Research Advance on Rice Stripe V irus( RSV)
Deng Zhaohua Zhang Fe iyun
(C ollege of L if e S cience, Cap italN orm al Un iver sity, B eijing 100037)
Abstrac:t R ice stripe v irus cause r ice stripe disease and resu lt in g reat econom ic lost in r ice plant area. The studies
on the v irus and inte rre la ted genes are bo th activ e in recent y ea rs. Based on the fruit of these studies, the recent prog ress of
the resea rches on the nuc leotides and prote ins o f the v irus, and the researches on the disease res istance genes and on how
to con tro l the disease, asw e ll as the future of the rice genetic eng ineer ing that app lies antiv irus genes, are rev iew ed in this
paper.
Key words: Rice str ipe v irus Antiv ira l gene Antiv ira l prote in
基金项目:北京市教委科技发展计划面上项目 ( KM 200310028102) ,国家自然基金面上项目 ( 30571010)
作者简介:邓如花 ( 1981-) ,女,硕士,从事植物分子生物学与植物病毒学的研究
通讯作者:张飞云
水稻条纹病毒 ( rice stripe v irus, RSV )引起的水
稻条纹叶枯病是一种虫媒病毒病害, 在世界范围内
有过多次大的发生, 已在水稻种植区造成巨大的经
济损失,有些灾害严重的地区甚至颗粒无收。 2004
年我国江苏省沿江、沿淮大部分地区稻飞虱传播的
水稻条纹叶枯病,发生在江苏省 40多个县, 波及面
为 2 000万亩左右, 严重发生面积 1 500万亩,严重
的地区一半稻田绝收。 2005年在江苏等地再次遭
受 RSV的袭击。如何防治病害发生及控制病害的
引发成为研究者迫切希望解决的问题。因此,有关
病毒本身及抗病基因的研究就成为近年来的研究的
热点。
1 水稻条纹病毒
水稻条纹病毒是纤细病毒属 (T enuivirus )的代
表种, 这一植物病毒属还包括玉米条纹病毒 ( ma ize
stripe virus)、水稻草状矮缩病毒 ( rice grassy stun t v-i
rus)和水稻白叶病毒 ( rice ho ja blanca virus) [ 4]。该
病毒属的病毒具有独特的基因组结构,其基因组由
四个单链正义病毒 RNA ( vRNA )和四个双链 RNA
组成,研究者推测其中的双链 RNA可能是体外操作
时,从病毒颗粒中提取病毒 RNA的过程中由分离的
单链病毒 RNA ( v iral RNA, vRNA )与其互补 RNA
( v ira l complementary RNA, vcRNA )形成的复合
体 [ 1, 5]。
1. 1 RSV的基因组
RSV以独特的基因组结构和表达策略, 使其成
为研究植物病毒与寄主和介体互作及协同进化机制
的模式对象。 1995年 Sh igem itsu Toriyam a等对日本
T分离物进行了全序列的测序, 其结果基因组全长
为 17 145bp, 随后中国 CX分离物和 HZ分离物也
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陆续测序完毕。与日本 T分离物全长 17 145bp相
比, CX 分离物少了 52bp, 而 HZ 分离物则多了
5bp
[ 8]。 3个分离物在基因组结构组成上完全一致,
均由四个单链正义病毒 RNA ( vRNA )和四个双链
RNA组成,按分子量递减的顺序分别命名为 RNA1、
RNA2、RNA3、RNA 4[ 7]。其中, RNA1采取负链编码
策略, 编码依赖 RNA的 RNA聚合酶 ( RNA-depend-
entRNA po lymerase, RdRp) , RNA2、3、4均采取双义
编码策略,即在 RNA的毒义链 ( v RNA )和毒义互补
链 ( vc RNA )的靠近 5c端处各有一个开放阅读框
( ( Open Reading Foxes, ORF ) , 都可以编码蛋白
质 [ 1, 3, 9] ,这一点已经被 Hamamatsu等于 1993年证
实。
1. 2 转录及复制特点
M am iTakahash i等通过对 RSV T分离物的四种
单链 RNA的 5c及 3c末端进行测序, RNA1的 3c末端
的核苷酸序列是 5c-GACUAUGUGU-3c, RNA2、3、4
的 3c末端的核苷酸序列是 5c-GACUUUGUGU-3c, 四
种 RNA的 5c末端序列都一样, 为 5c-ACACAAGUCC
-3c[ 3]。因此每种单链的 5c及 3c末端各有约 20个核
苷酸互补, 形成了负链病毒特征性的锅柄 ( panhan-
dle) 分子内二级结构。5c及 3c末端序列的高度保守
暗示了这一区域序列有可能在病毒基因组转录和复
制过程中有重要的作用, 形成的这一独特的二级结
构可能是依赖 RNA的 RNA聚合酶的识别位点 [ 3, 4 ] ,
Barbier P等的研究也已证实了这一推测。
Tor iyama S从 RSV 病毒粒子分离出 230K蛋
白,体外实验证明其为 RNA聚合酶 [ 5] , Barb ier P等
纯化出 RNA依赖的 RNA聚合酶, 使 RNA聚合酶与
RNA分离, 在体外实验发现该酶能以病毒四个 RNA
组分的 5c及 3c末端的长为 50个核苷酸的保守序列
作为的模板,进一步的体外转录实验证明位于 3c末
端的 15个核苷酸序列对依赖 RNA的 RNA聚合酶
来说是充当了特异启动子的作用 [ 1]。
在病毒的转录机制方面的研究也有一些进展,
早在 1996年有研究者从 RSV感染的小麦叶片中分
离到 RNA 4的 vRNA和 RNA3的 vcRNA的 mRNA,
并发现其 5c端都有 10 ~ 23个非编码氨基酸的序
列 [ 4] ,所以有研究者推测纤细病毒属 (T enuivirus)的
mRNA的转录可能采取加帽起始机制,这可能需要
病毒的 RNA聚合酶利用寄主细胞的引物来起始自
身 mRNA的合成。要完成这一过程,至少需要聚合
酶 5c端和 3c端序列结合位点、加帽引物产物的内切
酶活性位点以及核苷酸附加催化活性位点 [ 8]。通
过对纤细病毒属 ( Tenu ivirus )病毒与白蛉热病毒属
病毒的聚合酶比较结果表明, 在纤细病毒属病毒的
聚合酶中存在 5c端和 3c端序列结合位点和核苷酸
附加催化活性位点,及加帽引物产物的内切酶活性
位点所需的一些保守序列, 从侧面提供了纤细病毒
属病毒转录同样采用加帽机制的证据 [ 9 ]。
2 RSV的核酸及编码的蛋白质
2. 1 RNA1及 RNA聚合酶蛋白研究进展
RNA1是 RSV基因组中分子量最大的一条 [ 4]。
在 vcRNA 1上有一个长的 ORF, 它编码含有 2 919
个氨基酸残基的蛋白, 推测其即为病毒的复制酶蛋
白,其分子量约为 337kDa[ 4] , 这与经 SDS-PAGE检
测到的复制酶蛋白的相对分子质量 ( 23kDa)相差较
大。这一差距暗示了在不同的体系中,复制酶可能
经历了不同的翻译后修饰:病毒侵入细胞后,先翻译
出复制所需的蛋白,这些蛋白的一种或多种与寄主
的蛋白共同组成复制酶复合体 [ 5]。
早在 1989年 Toriyama S等通过分析日本 RSV
T分离物中 vcRNA1所编码蛋白的氨基酸序列, 就
推测该蛋白包含依赖 RNA的 RNA聚合酶 ( RdRp )
的结构区域 [ 5]。后研究者通过对纤细病毒属 ( Te-
nu iv irus)及番茄斑萎病毒属 ( Tospov irus)等属编码
的 RNA聚合酶蛋白进行同源性比较发现它们最保
守的区域几乎都集中于 N端第 1 650 ~ 2 000位的
氨基酸区域内, 在这一区域内包含 Poch等认为的
pre A、A、B、C、D、E 6个基元序列 ( motif), 并有 18
个高度保守氨基酸有序排列于第 120~ 210个氨基
酸大小的区域内 [ 10]。通过对 RNA聚合酶蛋白 N端
序列膜定位和跨膜特征等方面的分析,结果表示这
些 RNA聚合酶蛋白最有可能定位于细胞质 [ 8]。研
究还发现在编码氨基酸 N端的第 1 531 ~ 1 552位
存在典型的亮氨酸拉链模式序列,这一序列早已被
证实具有结合 RNA的功能 [ 10 ] ,这与聚合酶采取加
帽机制完成转录过程的要求符合。
2. 2 其他核酸片断的研究近况
据 1991 Yafeng Zh等对 RSV的 RNA 3的研究
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表明, RNA3也是采用双义编码策略,在 RNA3毒义
链 ( vcRNA3)上编码一个分子量为 35 134的蛋白,
证明是病毒的外被蛋白 ( coat pro tein, CP ) [ 7]。 vR-
NA3编码一个 23 874的非结构蛋白 ( non-structure
pro tein, NS)NS3,有研究者发现该蛋白质在病叶中
的积累量与症状的发展关系密切, 认为它与病毒的
致病性相关 [ 4]。W estern杂交显示该蛋白在宿主植
物及病毒的传播载体中都能合成, 并且能在被感染
植物的组织细胞内聚集成聚合体 [ 11] , 这与已报道的
水稻草状矮缩病毒 ( RGSV ) RNA5编码的非结构蛋
白蛋 (NS5蛋白 )能自身 N端紧密连接形成同型二
聚体相似 [ 12]。在 RNA3的非编码的基因间隔区存
在 742个碱基对的 A、U富集区, 能形成含有 126个
碱基的发夹机构, 其中 72. 6% 形成碱基对, 这一二
级结构可能的作用推测是稳定单链 RNA ( sing le
strand RNA, ssRNA )的结构, 或者在转录 mRNA时
起终止作用 [ 7]。
Y afeng Zhu等通过对日本 T分离物的研究发现
RNA4区段含有 2个开放阅读框 ( ORFs) , 也利用双
义编码策略, vRNA4的 ORF编码病害特异性蛋白
( d isease-spec ific pro tein, SP),分子量为 20 541Da[ 14 ] ,
后来研究证明该蛋白能在病株中大量聚集, 形成不
定形的内含体和针状结构,并与症状的发展关系密
切 [ 16]。该蛋白在水稻细胞的细胞核、细胞质、叶绿
体、液泡和介体昆虫的组织中被大量的检测到,但利
用免疫检测并没有在 RSV病毒粒子发现该蛋白,这
说明该 S蛋白并不是一个运动蛋白或病毒的结构蛋
白,其具体功能还不知 [ 16]。 RNA4的毒义互补链
( v iral comp lem entary strand)的 ORF编码一个未知
功能的蛋白,该蛋白是分子量约为 32 474Da的非结
构蛋白 [ 14]。
在 RNA4的两个 ORFs之间存在非编码区即基
因间隔区 ( in tergenic reg ion, IR ), 可形成发夹结构,
此发夹结构可能具有终止 mRNA转录及保持 ssR-
NA稳定性的作用。非编码区序列的内部具有两个
重要的结构特征,一是具有插入序列;二是有两处反
向重复序列,可形成两个明显的发夹结构;其中一个
序列比较保守,形成的发夹结构稳定,但另一个发夹
结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差
异较大 [ 16]。
此外, Y afeng Zhu等通过对日本 T分离物和 M
分离物的非编码区的序列进行比较, 两者显示出
89. 6%的相似性 [ 14] , L i等通过对我国水稻条纹病毒
( RSV ) 22个分离物 RNA4基因间隔区 ( IR )序列进
行比较表明, 我国 RSV RNA 4 IR在长度上存在
634bp、654bp及 732bp 3种不同的类型,但其所形成
的发夹结构没有变化, 这表明基因间的非编码区易
于变异;也表明此二级结构较核酸的序列对病毒的
感染性更具有决定作用 [ 18]。推测这些序列形成的
发夹结构最可能的功能是控制间隔区两旁基因编码
区转录终止及对 ssRNA稳定性起到调控作用, 从而
影响病毒的生物学性质 [ 16]。B last分析结果暗示插
入片段很有可能是病毒直接从寄主 (大、小麦 )基因
组中通过重组 ( Recombina tion)获得的 [ 9]。
从病毒本身、昆虫及寄主植物体内发现了一些
功能未知的非结构蛋白, 为各核酸片段的相应编码
框编译,研究这些非结构蛋白的功能,将有助于进一
步研究病毒编码各蛋白之间的联系,对于病毒所编
码蛋白的功能、病毒粒体在机体内外的组装、病毒在
细胞间的运动和长距离转运、调控机制、致病机理、
病毒与寄主 (植物和昆虫 )间的互作和共同演化的
分子机制以及病毒的起源等问题的研究都具有重要
意义。
3 抗 RSV病害基因工程及病害控制的展望
3. 1 病害控制的策略
植物对病毒病的抗性可分为对病毒的抗侵染
性,对病毒的相容性及对介体昆虫的抗性等。传统
的控制病害方法是利用杀虫剂或分离对病毒具有忍
耐性的水稻品种,都无法从根本上减轻病毒病的危
害 [ 13, 21]。近年来,在转基因工程防治水稻条纹叶枯
病的研究中,采取在植物中表达病毒的蛋白基因,转
基因植物体内大量表达病毒蛋白基因,对病毒的侵
染曾表现出一定的抗性, 但是这种转基因植物的抗
病毒基因本身就是病毒的基因, 存在一定的环境危
险,同时, 这种抗病性随着时间的推移,有降低和消
失的趋势,其机理目前还不清楚。还有研究者依据
核酶的特性设计合成特意切割 RSV病毒 RNA保守
区及编码病害特异性蛋白基因的核酶,但目前还没
有较理想的效果 [ 21]。
利用水稻基因组中的抗病毒基因及抗昆虫介体
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
基因进行基因工程研究, 培育出抗病毒或抗昆虫的
水稻品种。邓可京等还提出一种利用改造灰飞虱体
内共生菌防治 RSV的新思路, 渐减弱昆虫介体的传
毒能力,最终达到阻断其对病毒的传播。由于灰飞
虱传毒是个复杂的过程, 且不同地区的灰飞虱与病
毒的亲和力,病毒在介体内的循回期均不同。因此,
这种方法还需要在实践中加以检验 [ 12]。因此, 现在
认为选育和推广抗病品种是最经济有效的方法。
3. 2 抗病基因近年研究进展
多年来一直进行抗水稻条纹病毒的抗病品种及
抗病基因的研究,已有研究表明,大部分粳稻品种感
病,而多数籼稻和陆稻具有抗性。已发现两个抗性
位点 stv-a、stv-b, W ash io等报道过有些籼稻抗病品
种含有另一抗病基因 Stvb-I,最近,日本学者通过分
子标记的连锁分析,将水稻抗条纹叶枯病基因 S tvb-
I定位于水稻染色体第 11片段上,并构建了包含有
S tvb-I基因的分子文库, 为进一步分离抗性基因奠
定基础 [ 18, 19, 21 ]。另外一些的籼稻品种的抗性受多
基因控制,也有人认为条纹叶枯病的抗性受多基因
控制, 如有研究结果显示对条纹叶枯病的抗性由主
基因和微效修饰基因控制。显然这些结果的差异与
研究所用实验材料有关,如水稻抗病品系 -BL 1.中
研究发现存在抗条纹叶枯病的抗性基因, 独立于基
因位点 stv-b[ 19, 21]。
我国学者万建民等利用 81个株系组成的
K inmaze /DV85重组自交系群体, 根据 QTL Cartogra-
pher软件的分析, 在第 1、7、11号染色体上分别检测
到 3个抗条纹叶枯病的 QTL, 在第 1、7、号染色体上
检测到的抗条纹叶枯病基因属首次报道, 但是根据
已有的研究结果,尚不能确定这两个抗性基因位点
是否为主效的 QTL。另外, 水稻品种 DV 85具有多
种抗性基因,特别是在同一染色体区域携带的不同
抗病基因, 而这些基因间的相互作用也有待于研
究 [ 21]。近来在一些抗水稻白叶枯病、抗稻瘟病的水
稻品种种也发现了一些抗水稻条纹叶枯病的抗性基
因,引起了研究者的注意。
水稻自 1972年来在日本大量种植的含有基因
stvb-I的水稻品种对抗水稻条纹病毒及保护水稻作
物丰收取得一定的成功, 但是它们最终还是变得易
受感染,所以病毒的选择进化要求我们寻找新的抗
病品种及更有效的抗条纹叶枯病的基因资源, 而有
效的抗病基因的抗病机理及是否是主效的抗病基因
还需待一步的研究与证实。
3. 3 病害控制的问题和展望
植物病毒病害是农作物的重要病害, 对农业生
产造成了极大的威胁。水稻条纹叶枯病作为一种植
物病毒病,引起了水稻作物严重的经济损失,其防治
早已是研究者关注和研究的重要对象,也已经发展
了多种防治策略来控制这类病害。近 20多年来发
展起来的抗病毒转基因植物, 为防治这一病毒病提
供了思路,但是转入的基因多为病毒自身的基因,或
抗性范围比较窄的抗病基因。多年来,研究者致力
于寻找真正的抗水稻条纹病毒的抗性基因和抗病品
种的培育,虽取得一定成效,但是它们最终还是变得
易受感染,造成的经济损失有增无减,这促使研究者
进一步寻找更有效的抗条纹叶枯病的基因资源。
近年来在多种植物的科属中发现了一些重要的
抗病毒蛋白,如美洲商陆叶片、根及种子中含有的一
些商陆抗病毒蛋白 ( Pokew eed antiv iral pro tein,
PAP)、紫茉莉抗病毒蛋白 (M irabilis antiv iral pro tein,
MAP)等具有较好的抗病毒效果, 这些抗病毒蛋白
是一种核糖体失活蛋白 ( ribosome inact ivating pro-
te in, R IP),能专一地从真核生物核糖体 60S大亚基
的 28S rRNA特殊位点上切下一个腺嘌呤, 使其难
与蛋白质合成的延伸因子 EF-2 /GTP复合体结合,
从而阻碍了蛋白质的合成 [ 22] ,是一种广泛存在于高
等植物中的蛋白质。将这类蛋白的基因导入植物体
内后,转基因植物也可获得相应的抗病毒特性,在防
治植物病毒病的研究方面取得了有益的进展 [ 23]。
有些抗病毒蛋白可直接作用于病毒的核酸上, 导致
脱嘌呤,使病毒不能正常复制; 有些可作为酶抑制
剂,特异地抑制与病毒复制相关的蛋白酶,从而抑制
病毒复制,应用这类蛋白质可以直接抑制植物病毒
的增殖。另外一些抗病毒蛋白诱导其它蛋白或物质
的产生,使植株产生系统抗性。植物中的抗病毒蛋
白形式多样,且都具有非常好的抗病毒活性,许多这
类蛋白质具有广谱抗性 [ 23] , 而且在玉米、大麦中也
发现的核糖体失活蛋白, 经转基因在烟草中表达表
现出抗真菌活性,推测水稻本身也可能存在这一类
蛋白,这为利用这些抗病毒蛋白的基因进行病毒病
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的防治提供了新的思路。
从所发现的这类蛋白质来看, 大部分具有酶的
活性, 或作为酶的抑制剂, 而有些抗水稻条纹病毒的
水稻品种存在一些有效的抗病基因, 这种结果也间
接的告诉我们,在植物当中本身就存在抗病毒基因。
这也提示研究者,除了探索更有效的抗水稻条纹病
毒的抗病基因外,从水稻的抗病品种寻找抗病毒蛋
白,及探索这种抗病毒蛋白的基因,然后将这种抗病
毒蛋白作为转基因工程植株的材料, 无论从环境、基
因资源的开发利用及病虫害的防治, 都会带来良好
的前景。
4 结语
近年关于病毒的核酸、蛋白质及水稻或者其他
植物中存在的抗 RSV病毒的基因的研究成果不仅
对于搞清病毒各编码蛋白联系、病毒的致病机理、病
毒与寄主 (植物和昆虫 )间的互作和共同演化的分
子机制以及病毒的起源等问题的研究提供了依据,
而且对病害的控制提供了思路, 且积极投入了水稻
栽培方面的应用,促进了病害的控制和优良抗病品
种的培育,所存在的问题将促使研究者在抗病基因
方面值得做进一步的探索。
参 考 文 献
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