全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 253鄄261(2011)
收稿日期: 2010鄄08鄄20; 修回日期: 2011鄄03鄄23
基金项目: 国家转基因生物新品种培育重大专项重点课题(2009ZX08009鄄044B); 国家自然科学基金资助项目(30770090); 农业部
农业公益性行业科研专项(nyhyzx07鄄051)
通讯作者: 谢联辉,教授,主要从事植物病毒研究; Tel: 0591鄄83769704, E鄄mail: fjxlh@126 . com;
吴祖建,研究员,主要从事植物病毒研究; Tel: 0591鄄83750593, E鄄mail: wuzujian@126 . com
第一作者: 张晓婷(1981 - ),女,河南洛阳人,讲师,博士,主要从事植物病毒病理学研究; Tel: 0371鄄63558170, E鄄mail: zhangxiaot鄄
ing921@163 . com。
水稻条纹病毒胁迫下的水稻蛋白质组学
张晓婷1,2, 谢荔岩1, 林奇英1, 吴祖建1*, 谢联辉1*
( 1福建省植物病毒学重点实验室,福建农林大学植物病毒研究所, 福州 350002; 2河南农业大学植物保护学院, 郑州 450002)
摘要: 采用双向电泳联用 MOLDI鄄TOF鄄TOF质谱对水稻感病品种武育粳 3 号和抗病品种 KT95鄄418 感染水稻条纹病毒
(Rice stripe virus,RSV)前后的叶片进行蛋白质组学分析。 结果显示,RSV 基因组编码的病害特异蛋白(disease specific
protein,SP)在武育粳 3 号中的积累量明显高于 KT95鄄418 中。 其他 25 个蛋白经质谱成功鉴定,包括 RSV NS2 蛋白,寄
主中与光合作用、细胞氧化还原状态和离子平衡状态及蛋白的合成、转运与翻译后修饰等相关的蛋白。 对这些差异表达
的蛋白与水稻感、抗病的作用进行了分析。
关键词: 水稻条纹病毒; 水稻品种; 蛋白质组学
Rice proteomics under the infection of Rice stripe virus 摇 ZHANG Xiao鄄ting1,2,
XIE Li鄄yan1, LIN Qi鄄ying1, WU Zu鄄jian1*, XIE Lian鄄hui1* 摇 ( 1Key Laboratory of Plant Virology of Fujian
Province, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2College of Plant
Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: Two dimensional electrophoresis (2鄄DE) and MOLDI鄄TOF鄄TOF MS were used to analyse the pro鄄
teomic changes in leaves of the susceptible cultivar WuYu3 and resistant cultivar KT95鄄418 rices infected with
Rice strip virus (RSV) . The results showed that disease specific protein (SP) of RSV accumulated more in
susceptible cultivar WuYu3 than that in resistant cultivar KT95鄄418. The other 25 proteins were identified suc鄄
cessfully by MS, including RSV NS2, host proteins related to photosynthesis, dynamic balance of cellular
redox state or ions and protein translation / translocation or modification. The possible functions of these host
proteins in the susceptible and resistant cultivars were discussed.
Key words: Rice stripe virus; rice cultivars; proteomics
中图分类号: S435. 11摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0253鄄09
摇 摇 水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)是纤细
病毒属(Tenuivirus)的代表种,由介体灰飞虱(Lao鄄
delphax striatellus)以持久性方式传播,寄主范围广
泛。 其所致的水稻条纹叶枯病在 20 世纪中期传入
我国,现已成为我国水稻生产上的重要病害之一。
水稻在感染 RSV后出现展叶型条纹症状或叶
片褪绿、捻转下垂的卷叶型“假枯心冶症状。 细胞
病理学研究表明,水稻感染 RSV后,叶肉细胞中线
粒体增多,细胞核变大,叶绿体结构受到破坏,淀粉
粒大量积累,并形成多种形态的病毒内含体[1 ~ 5]。
作为严格的细胞内寄生生物,RSV 侵染寄主后不
但干扰其正常的生理代谢,引起细胞形态的明显改
变。 同时,RSV 还与寄主蛋白发生互作关系[6 ~ 8],
利用寄主蛋白进行复制、增殖和运动,导致其基因
和蛋白表达谱发生显著的变化[9 ~ 12]。 2004 年水稻
条纹叶枯病大流行期间,江苏省主栽品种武育粳 3
摇
植物病理学报 41 卷
号表现高度感病,而由其田间自然变异单株选育出
来的 KT95鄄418 却显示高度抗病。 鉴于此,针对这
2 个水稻品种的基因转录谱进行了分析,结果有
3 517 个基因出现差异表达,其中 2 002 个基因表
达上调,1 515 个基因表达下调[13]。
随着蛋白分离和鉴定技术的发展,蛋白质组学
已成为植物病理学研究的重要手段。 病原物侵染
后的蛋白质组学变化是揭示病害发生机制的一个
重要方面。 采用双向电泳联用质谱分析技术,稻瘟
病菌(Magnaporthe grisea)、水稻白叶枯病菌(Xan鄄
thomonas oryzae pv. oryszae,Xoo)和水稻黄斑驳
病毒(Rice yellow mottle virus, RYMV)侵染后水
稻的应答蛋白质组学研究已经开展[14 ~ 17],但由昆
虫传播的水稻病毒,尚无蛋白质组学方面的数据。
本研究以生产上发生严重的昆虫传病毒病水稻条
纹叶枯病为研究对象,采用双向电泳和质谱鉴定技
术对抗、感表现差异明显的武育粳 3 号和 KT95鄄
418 水稻品种(系)进行了蛋白表达谱分析,为进一
步揭示 RSV的致病机制提供参考。
1摇 材料与方法
1. 1摇 试验材料
1. 1. 1摇 水稻品种摇 供试水稻品种选用对水稻条纹
叶枯病表现感病的粳稻品种“武育粳 3 号冶及其对
RSV表现抗病的 KT95鄄418。
1. 1. 2 摇 介体昆虫及病毒毒源 摇 无毒灰飞虱是
2004 年采自江苏洪泽田间的无毒灰飞虱后代,经
由福建农林大学病毒所室内饲养确证不带毒的群
体;病毒毒源(RSV)由采自江苏洪泽田间的病株
经无毒灰飞虱饲毒接种分离纯化后,保存于粳稻品
种合系 28 上。
1. 2摇 试验方法
1. 2. 1 摇 供试水稻幼苗的栽培 摇 武育粳 3 号和
KT95鄄418 水稻种子经 70%酒精表面消毒后泡在
水中催芽,待白色幼芽长出时播种于盛有湿润营养
土(草炭土颐沙土 = 4颐 1)的塑料瓶中,每瓶育苗 20
株。 幼苗生长至二叶一心期时,一部分用于接种病
毒,作为试验处理组(T);另一部分在同样条件下
生长但不做任何接种处理,作为试验对照组(C)。
从育苗到取样,水稻幼苗均生长于 25 ~ 28益,
光照周期为 16 h光 / 8 h暗的玻璃温室中。
1. 2. 2摇 病毒接种摇 取 2 ~ 4 龄的无毒灰飞虱若虫
100 头在合系 28 RSV 病株上获毒取食 48 h,之后
将其移至健康稻苗上饲养让其渡过循回期。
以每瓶稻苗(20 株)100 头带毒灰飞虱的接种
压力在武育粳 3 号和 KT95鄄418 健康稻苗上强迫接
种取食 48 h,接种后的幼苗移栽于 25益,16 h 光 /
8 h 暗光照周期的防虫网室中,记录发病情况直至
取样。
1. 2. 3 摇 样品的获取 摇 在处理组样品中选取 3 株
(显症时间相差不超过 24 h)水稻条纹病株,于显
症后第 7 d分别剪取其症状明显的病叶部分,做好
标记,迅速冻存于液氮中。 取自每株稻株的材料作
为一个生物学重复。
同时,从对照组样品中任选 3 株,各自与处理
组 3 个样品对应,剪取其相应叶位部分,迅速冻存
于液氮中。
1. 2. 4摇 蛋白样品的制备与含量测定摇 采用三氯乙
酸(TCA) /丙酮( acetone)沉淀法提取水稻蛋白。
称取 0. 2 g 水稻叶片放入预冷的研钵,在液氮中研
磨成精细的粉末,然后加入 2 mL 预冷的 TCA鄄丙
酮蛋白提取液,在冰上研磨至匀浆。 匀浆液转入
10 mL离心管中,4益下 25 700 g 离心 15 min,弃上
清。 沉淀用 2 mL预冷的丙酮(含 10 mmol / L巯基
乙醇)重悬, -20益下沉降 3 h后于 4益下 25 700 g
离心 15 min,弃上清。 用 2 mL 预冷的丙酮洗沉
淀, -20益下沉降 1. 5 h 后于 4益下 25 700 g 离心
15 min,弃上清。 再次用丙酮清洗沉淀后, - 20益
下沉降 0. 5 h,4益下 25 700 g 离心 15 min,尽量弃
去上清,沉淀置 - 20益保存使丙酮挥发,即得蛋白
干粉。
称取蛋白干粉 20 mg,真空干燥后加入 1 mL
样品裂解液(9 mol / L尿素、4% CHAPS、50 mmol / L
DTT、0. 2% Bio鄄Lyte 载体两性电解质 pH 3 ~ 10),
超声处理 10 伊 1. 5 min, 4益 下 18 000 g 离心
15 min,取上清。 用 Bradford 法测定蛋白含量后,
分装,于 -80益保存。
1. 2. 5 摇 IPG鄄SDS鄄PAGE 双向电泳 摇 第一向固相
pH梯度等电聚焦电泳( IPG)采用 pH 4 ~ 7,17 cm
线性 IPG 预制胶条,上样量为 408 滋g,上样体积
350 滋L。 水化和聚焦过程在 20益下自动进行。 程
序设置为:50 V聚焦 12 h;250 V聚焦 1 h,1 000 V
聚焦 2 h,8 000 V 聚焦 2 h;8 000 V 聚焦 60 000
Vh。 聚焦完毕后,取出胶条,在 5 mL 平衡液 I
(0. 375 mol / L Tris鄄HCl pH 8. 8,6 mol / L 尿素,
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摇
摇 3 期 摇 摇 张晓婷,等:水稻条纹病毒胁迫下的水稻蛋白质组学
20%甘油,2% SDS,2% DTT)和 5 mL 平衡液 II
(2. 5% 碘乙酰胺代替 2%DTT,其余组分同平衡液
I)中先后振荡平衡 15 min。 然后将经过 2 次平衡
后的胶条转移至 13% SDS鄄PAGE 胶上,每根胶条
10 mA预电泳至样品完全走出 IPG胶条,浓缩成一
条线。 加大电流以 35 mA 电泳至溴酚蓝指示剂达
到底部边缘时停止电泳。 电泳缓冲液为 25 mmol / L
Tris,192 mmol / L甘氨酸,0. 1% SDS,pH 8. 3。
1. 2. 6摇 硝酸银染色摇 电泳后的凝胶经超纯水清洗
3 遍后,进行银染,方法参考 Xia等[18]。
1. 2. 7摇 双向电泳图谱分析摇 用 EPSON PERFEC鄄
TION 1270 扫描仪扫描凝胶,图像保存为 TIFF 格
式,分辨率设置为 400 dpi,放大倍数为 100% ,图像
深度 48 比特。 扫描后的图像用 ImageMaster 2D
Platinum 6. 0(GE healthcare Inc. )进行分析,蛋白
点检定参数设置为: Smooth鄄3, Saliency鄄7, Min
Area鄄60。 以目标蛋白 3 个重复具有相同趋势,相
邻位点相对一致,至少 2 个重复有 2 倍(蛋白点体
积比)以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。
1. 2. 8摇 差异表达蛋白质点的质谱鉴定摇 选取差异
蛋白质点切下,送复旦大学蛋白质组学研究中心进
行 MALDI鄄TOF鄄TOF / MS鉴定。
2摇 结果与分析
2. 1摇 双向电泳图谱分析
用 2D ImageMaster 2D Platinum 6. 0 分析“武
育粳 3 号冶和“KT95鄄418冶 RSV病叶和健康叶片的
电泳图谱,分别检定到 359 个(武育粳 3 号对照
组),315 个(武育粳 3 号处理组),514 个(KT95鄄
418 对照组),446 个(KT95鄄418 处理组)高清晰且
重复性强的蛋白质点。 对不同处理下蛋白质点的
表达丰度进行差异检测,共得到了 44 个差异表达
的蛋白质点(图 1)。 在等电点为 4. 5 ~ 5. 5,分子
量为 20 ~ 25 kDa 的位置,2 个水稻品种的试验处
理组图谱与对照组图谱相比都有明显的蛋白质积
累,标记为区域 A(图 1)。
Fig. 1摇 Two dimensional electrophoresis maps of proteins from RSV鄄infected
and non鄄infected leaves in WuYu3 and KT95鄄418
Panes show the significantly accumulated protein in RSV鄄infected samples (Region A);
arrows and numbers show interested spots and their numbers.
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摇
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摇 摇 在 44 个差异表达的蛋白质点中,武育粳 3 号
处理组与对照组相比较有 33 个,其中 25 个表达量
减少,8 个表达量增加;KT95鄄418 处理组与对照组
相比较有 15 个,其中 12 个表达量减少,3 个表达
量增加(图 1)。 编号为 4、5、7、8 的 4 个蛋白质点
在 2 个水稻品种处理组与对照组的比较中表达量
均减少(图 1)。
2. 2摇 差异表达蛋白质的质谱鉴定
在区域 A 中,分别从武育粳 3 号和 KT95鄄418
的病叶图谱中连续切取 5 个和 3 个蛋白质点进行
了 MALDI鄄TOF鄄TOF质谱鉴定。 所得质谱数据提
交到Mascot网站选用 NCBInr数据库进行搜索,结
果表明,这些蛋白质点都是 RSV 的病害特异蛋白
(disease specific protein,SP)。
另外 44 个蛋白质点中,编号为 4、5、7、8 的 4
个蛋白质点在 2 个水稻品种的处理组中均减少,分
别从 2 个水稻品种的对照组凝胶上切取进行质谱
鉴定,其他差异蛋白质点依照图 1 中的显示在不同
凝胶上切取,进行酶解和质谱分析,共 25 个差异蛋
白质得到鉴定,鉴定结果见表 1。
摇 摇 这些得到鉴定的蛋白质分别是 22 个基因编码
的产物(18 和 25、19 和 22、40 和 41 号点分别被鉴
定为相同的蛋白质),其中包括一个 RSV 编码的
NS2 蛋白。 其他蛋白质按照功能分为 4 个类群。
2. 2. 1摇 参与光合作用蛋白摇 共有 10 个,包括 4 个
核酮糖 1,5鄄二磷酸羧化酶 /加氧酶(Rubisco)亚基
(编号为 12、13、32、35)、质体蓝素(plastocyanin,编
号为 8)、类囊体内腔 17. 4 kDa 蛋白( thylakoid lu鄄
menal 17. 4 kDa protein, chloroplast precursor
P17郾 4,编号为 10)、细胞色素 b6鄄f 复合体 Fe鄄S 亚
基(Cytochrome B6鄄F complex Fe鄄S subunit,编号为
18 和 25)和光系统 II放氧复合体蛋白 2 前体(pho鄄
tosystem II oxygen鄄evolving complex protein 2 pre鄄
cursor,编号为 19 和 22)。
2. 2. 2摇 氧化还原酶类摇 共有 5 个,包括定位于叶
绿体的 Cu鄄Zn超氧化物岐化酶前体(Cu鄄Zn SOD,
编号为 14)、Cu鄄Zn 超氧化物岐化酶(Cu鄄Zn SOD,
编号为 24)、M型硫氧还蛋白前体(Trx,编号为 9)
和 2 个功能没有明确的蛋白质 Os02g0328300(蛋
白质点编号为 1)和 Os02g0192700(蛋白质点编号
为 6),它们分别与一种具有氧化还原酶活性的果
实蛋白和硫氧还蛋白过氧化物酶具有较高的同
源性。
2. 2. 3摇 核糖体蛋白摇 共有 2 个,包括一个酸性磷
酸化蛋白(Os08g0116500,编号为 34)和一个定位
于叶绿体的 50S核糖体蛋白 L12 前体[50S riboso鄄
mal protein L12, chloroplast precursor (CL12),编
号为 37]。
2. 2. 4摇 其他功能蛋白摇 共有 5 个,包括代谢酶类
如腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 ( adenosine
diphosphate glucose pyrophosphatase,编号为 40、
41)、推定的核糖鄄5鄄磷酸异构酶(putative ribose鄄5鄄
phosphate isomerase,编号为 3)、甘氨酸剪切系统蛋
白 H(glycine cleavage system protein H,编号为 7)
和一个推定的小泛素相关修饰物( small ubiquitin鄄
like modifier,SUMO,编号为 17)。
3摇 讨论
3. 1摇 病毒蛋白
已有研究表明,RSV SP蛋白在 RSV侵染后不
同时期的水稻病株和带毒昆虫的卵巢、肠腔等部位
大量存在,在病株中的表达水平比在昆虫中高 50
倍[19]。 Lin 等[20]发现 SP 蛋白在病叶中的积累量
与褪绿花叶症状的严重度密切相关,且在不同品种
中其达到积累高峰的时间也有所不同。 Liang
等[4]用免疫胶体金标记抗体只在显症的叶片中才
检测到 SP 蛋白。 本研究采用双向电泳技术成功
分离了 RSV侵染后武育粳 3 号和 KT95鄄418 的叶
片总蛋白,在双向电泳图谱上发现 RSV SP 蛋白的
分子量约为 20 ~ 25 kDa,等电点 4. 5 ~ 5. 5,该蛋白
质在 2 个水稻品种的病叶中都有积累,在症状较重
的武育粳 3 号中的积累量明显高于 KT95鄄418 中,
积累量与寄主的症状严重程度呈正相关。 该结果
进一步证实 RSV SP 与病毒在不同抗病水稻品种
上的致病力相关。
另外,在武育粳 3 号的 RSV 病叶蛋白双向电
泳图谱中分子量约 25 kDa,等电点约 6. 0 的位置
上,我们鉴定得到了 RSV NS2 蛋白。 Liang 等[4]
采用Western印迹法在水稻病叶蛋白提取物的上
清中检测到了该蛋白的存在,但其表达量很少,且
只在新侵染叶片的叶肉细胞和表皮细胞中表达,
有些内含体中也能够检测到NS2蛋白,分子量为
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摇
摇 3 期 摇 摇 张晓婷,等:水稻条纹病毒胁迫下的水稻蛋白质组学 752
摇
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22郾 8 kDa,与本研究中发现的 NS2 蛋白分子量位
置比较一致,等电点也与预期值相符。 从图谱上可
以看出,即使在武育粳 3 号病叶中,NS2 蛋白的表
达量也很低,不易被检测出来。 在 KT95鄄418 病叶
蛋白双向电泳图谱的相应位置上则没有 NS2 蛋白
质点的出现。 这一研究结果表明,在不同的抗性品
种中 NS2 蛋白的表达量存在差异,它与病害的发
生严重度有关。
其他病毒蛋白在本研究中未得到鉴定,其原因
可能有三。 一是由于这些蛋白的分子量和等电点
超出了本研究的检测范围(分子量小于 30 kDa,等
电点 4 ~ 7),因而未能得到鉴定,如 RSV RNA1 编
码的 RNA 聚合酶,RNA2 和 RNA4 的负链编码产
物 NSvs2 和 NSvs4,RNA3 编码的病毒外壳蛋白
(coat protein,CP)等;二是由于某些蛋白如 NS3 蛋
白,其分子量约 24kDa,与 SP 的分子量比较接近,
在双向电泳检测中被高丰度表达的 SP 或其他寄
主蛋白所掩盖;三是由于这些蛋白的表达量相对较
低,不能够在双向电泳图谱上有效显示。 在进一步
的研究中,可以通过层析法去除高丰度蛋白,或采
用蛋白分级提取技术亦或窄范围 IPG 胶条电泳后
拼接技术拓宽双向电泳的检测能力,深入挖掘
RSV侵染后病毒蛋白在寄主体内的表达变化。
3. 2摇 光合作用相关蛋白
3. 2. 1 摇 核酮糖鄄1,5鄄二磷酸羧化酶 /加氧酶(Ru鄄
bisco) 摇 本研究中鉴定得到 Rubisco 大亚基肽段与
3 个蛋白质点对应,其中 2 个分子量较小的肽段
(蛋白质点编号为 12、13)在感染 RSV后的武育粳
3 号叶片中表达量降低,分子量为 25 kDa 左右的
肽段(蛋白质点编号为 32)在感染 RSV 后的武育
粳 3 号叶片中表达量增加。 这反映了 Rubisco 大
亚基的片段化作用,即在一定的条件下 Rubisco 大
亚基发生了体内降解,不同的降解片段表达情况不
同。
类似的 Rubisco 大亚基片段化作用在前人的
研究中也有报道。 Agrawal 等[21]对臭氧胁迫下水
稻蛋白表达谱分析表明,11 个 Rubisco大亚基的片
段,分子量介于 15 kDa 和 49 kDa 之间。 Zhao
等[22]采用 MALDI鄄TOF / MS鉴定了水稻双向电泳
图谱上不同生长时期表达差异的 49 个蛋白质点,
发现其中 32 个与 Rubisco 大亚基同源,完整的
Rubisco大亚基等电点范围很广,分子量集中于 55
kDa,片段化的 Rubisco大亚基多数位于等电点 6. 5
左右,分子量 30 ~ 40 kDa 的位置。 该研究所获得
的双向电泳图谱相应位置,如 55 kDa 和等电点
6郾 5 左右,分子量 30 ~ 40 kDa 的位置,本研究所得
图谱上都有相应的蛋白质点显示。
3. 2. 2摇 光合电子传递载体摇 光合电子传递是光合
作用的重要过程。 本研究中鉴定得到了与重要的
光合电子传递载体质体蓝素和细胞色素 b6鄄f 复合
体 Fe鄄S 亚基同源的蛋白,它们的表达量在感染
RSV后的水稻叶片蛋白双向电泳图谱中相对健康
叶片蛋白图谱中较少,在感染 RSV 后的武育粳 3
号水稻叶片蛋白双向电泳图谱中检测不到。
其中,与细胞色素 b6鄄f 复合体 Fe鄄S 亚基同源
的蛋白质点有 2 个(蛋白质点编号为 18 和 25),它
们的分子量基本一致,图谱显示约为 20 kDa,等电
点有所不同,分别约为 5. 0 和 6. 0。 在本研究中有
2 个分子量相近等电点不同的蛋白质点与细胞色
素 b6鄄f复合体的 Fe鄄S亚基对应,说明在感染 RSV
后,该蛋白亚基可能发生了翻译后修饰,或者可能
产生了不同的结合方式。
质体蓝素(Plastocyanin,Pc)的氧化还原状态
的平衡及其与细胞色素 b6鄄f 复合体和光系统玉的
相互作用是影响光合过程中电子转运效率的重要
因素。 在感染 RSV 后的水稻中,质体蓝素前体的
表达量下降,说明水稻寄主在感染病毒后,光合作
用的电子转运效率降低,同化作用减弱,提前进入
了衰老阶段。 这与叶片上出现的褪绿斑驳症状相
符合。 比较 2 个供试水稻品种处理组和对照组的
叶片双向电泳图谱可以看出,在感染 RSV以后,武
育粳 3 号中质体蓝素的表达量相对 KT95鄄418 中减
少得更多,与 2 个水稻品种叶片上症状的严重程度
一致。
3. 2. 3摇 PS域放氧复合体 摇 PS域的生理功能是吸
收光能,进行光化学反应,同时产生强的氧化剂,发
生光水解作用(photohydrolysis),释放出氧气,并把
水中的电子传递给质体醌。 已有研究表明,PS域
对干旱、盐胁迫、土壤低温等胁迫环境非常敏感。
Shimizu等[12]对水稻感染 RDV后的基因转录谱进
行分析表明,一个 33 kDa PS域外周蛋白基因在水
稻感染 RDV后转录量减少。 本研究中 23 kDa PS
域外周蛋白在感染 RSV 后表达量减少,但其作用
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摇 3 期 摇 摇 张晓婷,等:水稻条纹病毒胁迫下的水稻蛋白质组学
机制和与病害症状发生之间的关系还需要进一步
的研究证实。
3. 3摇 氧化还原酶类
伴随着光合成过程不可避免地会产生一些活
性氧分子( reactive oxygen species,ROS)。 ROS 控
制植物代谢过程中的多个途径,同时对光合作用的
结构产生直接破坏。 ROS 平衡的调节网络非常复
杂。 拟南芥中参与 ROS调控的基因至少有 152 个
之多,包括多种 ROS的生成酶类或清除酶类,是一
个非常冗余和动态的调控网络[23]。
本研究发现 5 个氧化还原酶在感染 RSV后的
2 个水稻品种叶片中表达降低。 这一现象反映了
水稻在感染 RSV以后细胞内的氧化还原平衡状态
的改变。 Allan等[24]研究表明,在抗病品种和感病
品种中,TMV 或离体的 TMV CP 都能够刺激胞内
ROS 的产生,产生这一刺激过程的最初识别反应
发生在寄主细胞的质膜外,并且必须有 TMV CP
的参与。 RSV 对寄主细胞内 ROS 的诱导作用是
否也需要其外壳蛋白的参与,特异性识别病毒蛋白
的寄主组分有哪些,都是值得进一步研究的问题。
另外,ROS 的过量生成可能直接破坏 PS域或
PSI等重要光合作用结构,导致光合成状态的氧化
损伤,使光合效率降低或发生光抑制作用。 同时,
活性氧分子控制植物代谢中的多个途径,环境改变
导致光化学能量吸收和植物代谢中能量利用的失
衡将进一步加大其对光合成状态的损害。 本研究
证实,许多光合作用相关蛋白的表达在感染 RSV
后的水稻中发生了改变,这些改变是否与细胞的氧
化还原失衡有关,它们之间的协调关系如何,是后
续研究需要回答的重要问题。
3. 4摇 核糖体蛋白
核糖体是细胞生长和分化中多肽链合成的场
所,由 40S和 60S 2 个核糖核蛋白体亚基组成。 本
研究中鉴定得到的 2 个核糖体蛋白都属于核糖体
大亚基 12 kDa 蛋白家族( ribosomal protein L12P
family)。
34 号蛋白质点所对应的 Os08g0116500 与玉
米 60S酸性核糖体蛋白 P1(P52855)类似,是一个
酸性磷酸化蛋白( acidic ribosomal protein,ARP),
分子量约 11. 4 kDa ~ 12. 2 kDa,等电点为 4. 1 ~
4郾 3,在体内发生磷酸化作用[25]。 P1 蛋白的磷酸
化修饰是植物面临胁迫环境时的一种适应方式。
本研究中测得 34 号蛋白质点的分子量约为 18
kDa,与 Chang 等[26]对拟南芥 80S 核糖体进行双
向电泳的图谱中 L12 蛋白的位置相近。 37 号蛋白
质点是定位于叶绿体的 50S 核糖体蛋白 L12 前
体,分子量约为 20 kDa,等电点约 5,在高等植物中
负责与各种翻译因子结合并催化 GTP 水解。 在
RDV侵染后的基因表达谱分析中,12 个核糖体蛋
白基因的表达被抑制[12]。 双向电泳图谱显示,在
感染 RSV后这 2 个蛋白的表达量降低,P1 蛋白可
能发生了磷酸化修饰。 这一结果暗示了病毒侵染
对寄主基因表达调控的另一种方式,即可能通过调
节核糖体蛋白的表达、互作和翻译后修饰对其他
mRNA的翻译产生选择性作用。 这一过程在玉米
的发芽和淹水胁迫中已较为明确,但在寄主对病毒
的响应中如何作用,目前尚没有充分的实验证据。
如果该途径在病毒与寄主的互作中的确存在,是否
还有其他的核糖体蛋白参与了这个调节,它们的调
节机制是怎样的? 这些都是很有研究价值的新课
题。
3. 5摇 其他蛋白
除前述几类蛋白外,本研究还鉴定得到了几种
代谢酶类和一个推定的小泛素相关修饰物( small
ubiquitin鄄like modifier,SUMO)。 SUMO是 20 世纪
90 年代发现的一类泛素相关的修饰蛋白,可以与
各种胞内靶标蛋白结合,调节蛋白的相互作用、定
位、活性和稳定性。 在植物开花时间的调控、耐热
性、依赖水杨酸的病害防御反应和植物对冷害、干
旱、ABA胁迫的响应等过程中都涉及 SUMO 化作
用的调节。 酵母双杂交实验表明,SUMO 可能通
过乙烯产生的信号诱导植物防御反应[27]。
由于 SUMO的作用底物非常广泛,SUMO 化
途径能够调控多种基因的表达,对细胞代谢影响巨
大。 本研究中对应的 17 号蛋白质点与区域 A 比
较接近,其在水稻感染 RSV 后的信号传导途径中
如何作用尚不清楚。 研究表明,多种病毒如细胞巨
化病毒(Cytomegalovirus)、单纯疱疹病毒(Herpes
simplex virus,HSV)和腺病毒(Adenoviruses)等在
与寄主的互作中涉及 SUMO 化途径[28 ~ 30],但其作
用机制尚不明确。 CELO 腺病毒 Gam1 蛋白的体
952
摇
植物病理学报 41 卷
内表达能够使 SUMO化作用中的连接酶 E1、E2 失
活,阻断寄主的 SUMO化途径[31]。 RSV病毒是否
通过类似的作用途径干扰寄主的 SUMO化途径尚
需进一步验证。
4摇 结论
本试验比较了 2 个粳稻品种在感染 RSV后的
蛋白表达谱差异。 在双向电泳图谱上显示了 RSV
SP和 RSV NS2 蛋白的相对分子质量、等电点及表
达情况。 用相关软件对双向电泳图谱进行分析后,
经质谱鉴定获得了 25 个目标蛋白质点的注释信
息。 通过分析这些蛋白在感染 RSV后的水稻中的
可能作用,我们认为感染 RSV 后水稻寄主的代谢
变化主要体现在光合作用、细胞氧化还原状态和离
子平衡状态的改变及蛋白的合成与翻译后修饰、加
工、转运等方面。 在后续的研究中,我们将对这些
差异表达的蛋白做进一步的功能分析,明确其在水
稻条纹叶枯病症状出现过程中的具体作用,结合已
开展的基因转录谱研究,最终构建水稻在感染
RSV后的系统生物学模型,分析水稻对 RSV 的响
应机制。
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