全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
引言
电压依赖性阴离子通道(voltage-dependentanionchannelVDAC)是一类重要的线粒体外膜蛋白,是线
粒体通透性转变孔复合体的组成成分,VDAC可以和其他一些因子结合如 Bcl-2家族蛋白,HBx等使线粒体
通透性增加调节细胞色素 c的释放从而促进线粒体依赖性细胞凋亡[1,2]。在真核生物中至少共有 3个成员组
成 VDAC1,VDAC2和 VDAC3,这三个成员在机体中的功能不同。VDAC1主要在质膜中表达,在机体中起着
及其重要的作用,不仅可以促进 ATP的释放[3]并且还是细胞氧化还原反应的感受器,对维持细胞氧化还原
平衡有很重要的作用 [4]。本研究应用测序及电子拼接技术等从猪胚胎 cDNA文库中分离并获得猪新基因
VDAC1,并将此基因进行物理定位。为猪此基因的进一步研究奠定了分子生物学基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 DNA样品 猪 DNA样品:猪血样采自广西大学动物科学技术学院巴马小型猪,DNA按照常规的苯
酚-氯仿抽提法提取。
辐射杂种板(RH):法国农业科学院 Martin Yerle博士惠赠
1.1.2 试剂 Taq酶,西班牙琼脂糖购自北京鼎国生物技术有限公司,引物合成及测序在北京博亚公司,回
收试剂盒为北京天为时代科技有限公司。
猪电压依赖性阴离子通道1基因的
分离及物理定位
叶香尘 兰干球 蒋和生 郭亚芬 王爱德
(广西大学动物科学技术学院,南宁 530005)
摘 要: 从猪胚胎骨骼肌cDNA文库中筛选出一克隆子,通过测序及电子延伸获得包含全长 CDS的猪 VDAC1
基因cDNA序列。比对发现此基因在核苷酸和氨基酸水平与人及小鼠都具有较高的同源性。应用辐射杂种板(RH)对此
基因进行染色体的精确定位,定位结果显示VDAC1基因定位在猪2号染色体长臂。
关键词:cDNA DVAC1 辐射杂种板 骨骼肌 猪
IsolationandPhysicalLocationofPorcineVdac1Gene
YeXiangchen LanGanqiu JiangHesheng GuoYafen WangAide
(ColegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,13XiulingRoad,Nanning530005,P.R.China)
Abstract: Inthispaper,asingleclonewasisolatedfrom pigfetusskeletalmusclecDNAlibrary (constructedby
ourlab),thecDNAcontainingful-lengthcdssequenceforpigVDAC1genewasgainedfolowingcommercialsequenc-
ingandelectronicelongation.Thepiggenesharedhigherhomologywiththatofhumanandmouseinnucleotideand
proteinlevel.ThephysicalmappingforpigVDAC1wasperformedusingradiationhybridpanel(RH),andthemapped
resultshowedthegenewasmappedpigchromosome2forlongarm.
Keywords:cDNA DVAC1 RadiationhybridpanelSkeletalmuscle Pig
收稿日期:2006-02-14
作者简介:叶香尘,女,硕士研究生,研究方向:动物遗传育种
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
1.2 方法
1.2.1 猪 VDAC1基因 cDNA的分离 从猪胚胎骨骼肌 cDNA文库(本室构建)中,分离一单克隆,两端测
序、NCBI比对后发现此序列与人和小鼠的 VDAC1基因高度同源,根据测序获得的序列查找所有的猪 EST
序列(htp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),并应用 DNAstar软件将所有序列拼接在一起,从而获得猪 VDAC1
基因的全长 cDNA序列。
1.2.2 猪 VDAC1基因定位片段的分离 根据获得的全长 cDNA序列及人的 VDAC1基因的基因组序列
(GI:42406224)用 PrimerPremier5.0在猪的外显子中设计定位引物并跨一个内含子,其引物序列为:L:
5GATGTCTTCACCAAGGGCTAT3R:5GTCCATTCTCAGATTTTGTTTTC3,位于第二外显子和第三外显子
中。扩增体系(20!l)为:1×PCRbufer,15nmolMgCl2,6pmol引物,3nmoldNTP,0.8UTaq酶,50ngDNA。反应条
件为预变性 95℃,5分钟,然后变性 95℃,30分钟,退火 58℃,30分钟,延伸 72℃,30分钟,最后一步延伸
72℃,10分钟,共 35个循环。应用 DNA凝胶回收试剂盒回收后测序以验证其序列的正确性。
1.2.3 猪 VDAC1基因的定位 扩增反应在 118管辐射杂种板(RH)中进行,其引物及反应条件同上,而反
应体系减为 10!l,相应的试剂用量也减半,并且在每次扩增反应中还包含猪基因组 DNA,仓鼠基因组 DNA
及不含模板的阴性对照。其扩增产物在含 EB的 1.5%的琼脂糖中检测。结果为阳性的用 1表示,阴性用 0表
示 , 不 好 判 型 的 用 ? 表 示 , 检 测 结 果 为 1000100001000000011000000001000000000?0000000000
001011000011?0100000?100001110110100001000100000000?101100110011011?01分 析 此 结 果 htp:/imprh.
toulouse.inra.fr/[5]。
2 结果及讨论
2.1 猪 VDAC1基因 cDNA序列分析
通过电子拼接将文库的测序结果与所查的猪 EST序列拼接成一 1810bp的片段,并包含起始密码子
ATG、终止密码子 TAA、PolyA加尾信号及 polyA尾巴。其 cds与人的 VDAC1基因 cds(GI:4507878)具有 92%
的同源性,与小鼠 (GI:6755962)的有 89%的同源性。根据人的 VDAC1基因的基因组序列可预测猪的
VDAC1基因基因组是由 9个外显子组成的。应用 ORFfinder将其 cDNA翻译成蛋白质(htp:/www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/gorf.html),结果显示此蛋白是由 283个氨基酸组成的,其分子量为 30.73Kda,PI值为 8.62(htp:
/kr.expasy.org/tools/protparam.html)。此蛋白在 225~247位置包含一真核线粒体外膜蛋白信号。在蛋白质水
平与人和小鼠分别具有 99%和 98%的同源性。
2.2 猪 VDAC1基因的定位
以猪基因组 DNA为模板扩增获得的片段测序后发现该片段有 595bp。RH定位结果显示 VDAC1基因
定位在猪 2号染色体长臂,与 IL4紧密连锁,其 LOD值为 10.93。1994年 Blachly-Dyson等[6]用人/鼠体细胞克
隆板将此基因定位到 Xq13-q21,后来在扫描人 X染色体 cosmid库时发现所定位的这个基因是一假基因,
并重新将此基因定位到 5q31[7],比较基因组显示我们的定位结果与人 VDAC1定位结果(5q31)是一致的
(htp:/www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/compare/compare.htm)。
参 考 文 献
1 ShimizuS,NaritaM,TsujimotoYNature.Nature,1999,399(6735):483~7.
2 RahmaniZ,HuhKW,LasherR,SiddiquiA.JVirol,2000,74:2840~2846.
3 Okada,etal.JGenPhysiol,2004,124:513~526.
4 BakerMA,LaneDJ,LyJD,DePintoV,LawenA.JBiolChem,2004,279(6):4811~9.
5 YerleM,PintonP,RobicA,etal.CytogenetCelGenet,1998,82:182~188.
6 Blachly-DysonE,BaldiniA,LitM,McCabeER,ForteM.Genomics,1994,20:62~67.
7 MessinaA,OlivaM,RosatoC,etal.BiochemBiophysResCommun,1999,255(3):707~10.
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