全 文 ：基因工程创制油菜种子基生物燃油的关键技术*
陈锦清 黄锐之
(浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,杭州 310021)
摘 要: 生物基燃料的开发研究对保证我国能源安全、改善生态环境都有重要意义。通过系统的基因工程
改良创制 能源油菜 ,作为生物柴油主要原料, 是我国可再生能源战略推进的明智选择。分析了油菜作为生物柴
油原料的优势及尚需解决的问题,根据相关领域研究趋势和我国现有基础, 提出了油菜种子基生物能源发展的战
略构想和重点研究方向: 1. 进一步提高产量、含油量以提高单位面积产油量。2. 利用油菜种子作为口服疫苗等高
值蛋白产物生物反应器,提高油菜种子蛋白质部分价值, 降低综合生产成本。3. 基因工程提高油菜抗逆性和生态
适应性,利用海涂、荒坡等非农业用地,解决大规模发展油菜种子质基生物柴油原料种植所需土地问题。4.通过特
种脂肪酸组分定向基因调控技术,培育高品位生物柴油专用油菜品种。
关键词: 生物柴油 油菜 基因工程 含油量 产量
Key Techniques of Genetic Engineering of Rapeseed
Based Biodiesel Fuel
Chen Jinqing Huang Reizhi
( I nsti tute of Vir ology and Biot echn olog y of Zhej iang Aca demy of A g ri cul tur al S ci ences , H angz hou 310021)
Abstract: Biodiesel refer s to a fuel pr oduced by tr ansesterification of oils from plant and anima l sources, is
generally believed to be an ideal replacement of diesel. It has become mo re attractive recently because o f its environ
mental benefits and the fact t hat it is made f rom renewable resour ces. The advantag es and bo ttleneck of use rapeseed
oil as a feedstock for biodiesel product ion had been evaluated. F ina lly, advises for fur ther researches have been g iv
en. And t he development of "energ y rapeseed" by systematical genetic improvement and multigene coordination r eg
ulat ion had been emphasized.
Key words: Biodiesel fuel Rapeseed Genetic eng ineering Oil content Yield
1 生物柴油研发现状
作为现代社会经济发展基本动力之一的能源,
是影响一个国家政治、经济和社会可持续发展的重
要因素。据统计,若按目前的水平开采世界已探明
能源,煤炭资源尚可开采 100年, 石油 30~ 40年,
天然气 50~ 60年。我国人均占有可开采石油资源
十分贫乏,大约只有世界平均水平的 12%。改革开
放以来,国家经济建设发展迅速,对石油的需求日益
增长。自 1993年起,我国已由石油净出口国变成净
进口国, 2003年成为世界第二大能源消费国。我国
石油年自给能力约为 1. 3~ 1. 5亿吨,目前石油进口
量已占需求量的 20% ~ 30%, 年缺口近亿吨, 尤其
是近阶段我国汽车工业大规模发展, 矿物燃油的短
缺几成定局[ 1] 。确保液体能源安全已成为保障我国
和全球经济可持续发展的重大课题。
世界各国已开始积极探索石油能源替代品及其
生产技术,以期尽早解决不可避免的石油短缺问题。
目前较为成熟的石油替代品,主要集中在生物柴油
和生物醇类燃料两类上。生物柴油, 即由植物油或
动物油的醇解而制成的脂肪酸酯,是目前国际上发
收稿日期: 20050809
* 基金项目:本研究受国家高技术研究发展计划项目 ( 2003AA211080) ,国家基金重点项目 ( 30430450) 和浙江省自然科学基金重点项目
( Z304430)资助
作者简介:陈锦清( 1953 ) ,男,博士,研究员,研究方向:植物基因工程。Em ail : J. q. chen@ zaas . org
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
展最快的生物质能源之一 [ 2]。
生物柴油具有环境友好特点, 它对环境和生态
的保护作用体现在生产、燃烧过程的各个层面。增
加生物柴油的生产, 可减少石化能源的开采和消耗;
生物柴油燃烧所排放的 CO2远低于植物生长过程所
吸收的 CO2 , 所以可缓解因温室气体积累所造成的
全球气候变暖这一重大环境问题; 生物柴油含硫量
低,且不含对环境造成污染的芳香烃,可使二氧化硫
和硫化物的排放减少约 30% ,其废气排放指标可满
足欧洲 号和 号排放标准。鉴于上述原因, 欧盟
各国为履行京都协议书中减轻温室效应的承诺,
对生物柴油进行差别税收刺激、对菜籽油原料实施
补贴, 致使其价格低于普通柴油, 随着国际石油价
格的飙升,生物柴油的竞争力还会不断提高[ 3] 。
我国著名学者闵恩泽院士在绿色化学与化工
一书中首先明确提出发展清洁燃料生物柴油的课
题[ 4]。近年来,我国海南正和生物能源公司、四川古
杉油脂化工公司和福建卓越新能源发展公司等民营
企业相继开发出拥有自主知识产权的生产技术, 并
建成年产超过一万吨的生产厂。我国政府已高度重
视生物质能源的开发,随着生产工艺的成熟, 目前对
生物柴油产业发展而言, 最重要的是要解决大量、稳
定、低成本的原料供应问题[ 5]。
2 以油菜为主要原料是我国生物柴油发展
的明智之举
用于规模生产生物柴油的原料包括大豆 (美
国)、油菜籽(德、法等欧盟国家)、棕搁油(东南亚国
家)、蓖麻油(巴西)等,均为各国的主要油料作物;日
本因其石油资源贫乏,加之国民喜食油炸食品,所用
食油煎炸一次即弃之,故主要采用工业废油、废煎炸
油为生产原料 [ 6, 7]。对不同原料制备的生物柴油多
个性状的测试结果显示, 以菜籽油, 特别是高油酸双
低菜籽油制备的生物柴油品质较佳 [ 8, 9]。
油菜是我国最主要的油料作物 [ 10] , 连续几年种
植面积和产量均居世界首位。作为生物柴油的理想
原料,油菜具有独特的优势: ( 1)适应范围广, 在我国
广大地区均有种植。( 2)作为长江流域的优势春花
作物, 油菜与小麦等粮食作物相比具有较高的经济
效益。( 3)我国大部分油菜是冬种作物,避免了与粮
食作物争地的矛盾, 仅长江流域和黄淮地区适于冬
季种植油菜的稻田面积就有 3 亿亩以上。( 4)种植
油菜可培肥地力, 增加后茬作物产量; ( 5)随着双
低油菜的大面积推广,榨油后的菜籽粕也可被用作
畜禽饲料,既增加了高蛋白饲料资源,又在一定程度
上提高了油菜的综合经济效益。( 6)油菜具有较大
的单位面积生物量, 在利用油菜籽作为生物柴油开
发的同时, 所产生的大量秸杆尚可通过秸秆生物燃
烧发电、酒精发酵等途径为其它形式的生物质能源
开发提供原料。( 7)油菜作为生物柴油原料, 使产业
链由农业向化工等行业延伸, 同时需要大量的劳动
力投入,不仅为农民提供了一条广阔的增收之路,也
很好地解决了农村剩余劳动力的问题。
目前利用油菜制造生物柴油技术已有较为成熟
的生产工艺, 特别是我国运用具有自主知识产权的
底物竞争基因调控技术, 育成反义 PEP 超油油
菜,大幅度提高了油菜含油量 [ 11] , 在此基础上,以油
菜为主要原料不失为我国生物柴油发展的明智之
举。
3 植物基因工程可为油菜种子基生物柴油
发展作出重要贡献
然而,目前国内的油菜生产成本和规模尚不能
完全适应生物柴油发展战略的需要。油菜种子基生
物柴油开发所迫切需要解决的主要问题是:
( 1)与石化基燃油价值等同问题。
( 2)大面积种植生物柴油专用油菜所需土地问
题。
( 3)生产高品位生物柴油所需特定成分油脂的
高效积累。
国内外生物技术取得的一系列突破性进展, 显
示了运用基因工程技术是完全有可能解决限制油菜
种子基生物柴油发展的瓶颈问题的。目前, 作为
双子叶模式植物的拟南芥, 全基因组近 2 万个基因
中,约 70%基因编码产物的功能已被初步确定,其发
育、代谢等生理过程和生化机理在分子水平上取得
前了所未有的认识[ 12, 13] 。油菜与拟南芥同属十字花
科芸薹属,亲缘关系非常相近, 在编码区, 基因平均
相似性达 85%左右, 拟南芥功能基因可直接应用于
油菜的表达调控。同时随着大量结构基因、调控基
因(转录因子 )和时空特异表达启动子的相继克
隆[ 14] , 大片段基因表达载体 [ 15]、诱导型表达载体的
472005年第 6期 陈锦清等:基因工程创制油菜种子基生物燃油的关键技术
开发[ 16] ,为人们对植物基因的表达调控提供了更多
的手段,按照人类的需要对植物代谢途径和基因表
达调控进行人工设计和功能基因聚合, 创造具有所
需特性的油菜新品种,正逐渐成为现实。
经过多年努力, 国内已有多个研究机构建立了
成熟的油菜转化体系[ 11, 17] , 并在植物功能基因研究
领域取得了一系列令人瞩目的进展。张洪霞将拟南
芥 Na+ / H + 交换蛋白基因导入番茄和油菜后, 使转
基因植株获得了抗盐性[ 18] 。赵军等从玉米中克隆了
分属于 bZIP 和 bHLH 基因家族的两类共 7 种与
CA T1基因 ABRE 顺式元件特异结合的转录因子基
因,其中一个与 ABA 的响应元件 A BRE 相结合的
调控因子基因转入模式植物拟南芥后, 能明显提高
拟南芥对干旱、低温及盐渍等非生物逆境的抵抗能
力[ 19]。田吉林等把 HAL1基因转入番茄, 转化植株
根系对 K+ / Na+ 离子的选择吸收和运输能力加强,
耐盐性显著提高[ 20]。武维华等克隆了拟南芥耐低
钾/耐低磷基因 [ 21]。康国斌等克隆了低温协迫相关
基因[ 22] 。薛红卫等开展了油菜种子发育的基因表达
谱分析,并运用 EMS 诱变技术构建了油菜突变群
体。
2003年初,浙江省农科院培育出世界上含油量
最高的油菜品系入选 2002年度中国十大科技进展
新闻, 徐匡迪院长在点评其意义时指出了该成果对
我国生物质燃油开发的重要意义。在此基础上, 又
按照当前油菜育种和生物质能源开发的主要目标,
利用植物基因组学最新研究成果, 克隆了一批重要
性状相关的功能基因, 开展了基因工程创制油菜种
子基生物柴油关键技术的系统研究, 并提出了通过
代谢工程途径进一步提高含油量、通过功能基因聚
合育种培育具有高油、高产、广适、多抗、适应轻型栽
培等多种优异特性的超级油菜等一系列重要研究
课题,均取得实质性进展。
我国在油菜基因工程和植物功能基因研究领域
取得的一系列研究成果, 为油菜基因工程系统改良、
培育作为大规模生产生物柴油原料的能源油菜奠
定了坚实基础。另一方面,作为能源作物的油菜,可
充分利用其不涉及食用安全的优势,探索人工设计、
基因聚合的育种模式,并辐射至其它作物, 这也有助
于实现油菜育种理论和品种的综合创新, 使相关领
域的研究和产业化水平均获得跨越式的提高, 带动
我国油菜品种的更新换代。
4 油菜种子基生物能源发展战略构想
近阶段,随着我国政府对生物质能源开发的高
度重视,国内各研究机构纷纷开展该领域的相关研
究,在此形势下, 如何进行合理的资源配置, 科学地
选择研究方向, 对油菜质基生物质能源的开发利用
顺利推进,具有攸关重要的作用。根据我国生物质
能源发展所迫切需要解决的问题和生命科学现阶段
的发展水平,可着重开展几个方面的研究。
4. 1 进一步提高产量、含油量 提高单位面积产
油量
产量和含油量的提高是油料作物育种始终的追
求目标,也是降低生物柴油生产成本、有效利用国土
资源生产生物质能源原料的重要途径。据测算, 如
平均亩产达到 200公斤, 含油量达到 50%左右或含
油量> 40%、小面积突破 300公斤/亩、大面积突破
250公斤/亩,以油菜籽为原料生产生物柴油,其价格
可与普通柴油的现行价格基本持平。
在模式植物拟南芥上最近已克隆了一些与产量
性状相关的功能基因, 显示了单株产量提高的巨大
空间。这些基因的获得, 为油菜产量的提高提供了
多个可供选择的基因调控位点和调控途径,但迄今
为止,通过基因工程技术来大幅度提高作物产量,仍
是广大研究者所面临的挑战。
目前较为成功的基因工程提高油菜种子含油量
的技术途径包括: ( 1)增加脂肪酸合成底物来提高油
脂合成水平。较为成功的有陈锦清等[ 11]提出的反义
PEP 技术途径,即通过抑制蛋白质合成关键酶 PEP
Case 基因表达以增加脂肪酸生物合成底物 PEP 的
供应(含油量提高可达 25%)。( 2)增强油脂合成途
径关键酶基因表达。包括: 超量表达脂肪酸合成关
键酶基因 ACC以提高脂肪酸合成能力(含油量提高
5%; Roesler, 1997) [ 23]和基因工程技术提高溶血磷
酯酸酰基转移酶( LPAAT)活性以增强脂肪酸与甘
油骨架结合成油脂的能力 (含油量提高 13. 5%;
Zou, 1997) [ 24] 。通过上述多个功能基因的聚合以及
利用转录因子来提高油脂合成整体代谢水平的研究
也已在国内展开, 获国家基金重点项目资助, 正向
60%含油量目标努力。
48 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
4. 2 利用油菜种子作为口服疫苗等高值蛋白产物
生物反应器 提高油菜种子蛋白质部分价
值, 降低综合生产成本
以往的油菜品质育种, 主要着重于其油脂的利
用,包括提高含油量、改良脂肪酸组成等。植物基因
工程的运用, 使运用油菜种子生产特种工业用脂肪
酸成为可能。然而对油菜种子中另一重要组分
蛋白质的利用却未有根本性的突破。双低油菜的
育成,使菜籽饼可用作饲料, 并已有从菜籽饼提取植
物蛋白的研究, 但这些产品价值均不高。
从商业角度来看, 植物是生产药用蛋白质最具
诱惑力的系统之一, 特别是油菜种子含有油体,由单
层磷脂蛋白膜包围。Oleosin是油体膜上的主要蛋
白,在种子中高水平表达。根据油体蛋白 Oleo sin的
特点,可建立以油菜主要贮藏蛋白 Oleosin 为载
体的高表达水平、易于下游分离的蛋白产物表达系
统,使油菜种子成为畜禽用口服疫苗、生长素、干扰
素等生物活性蛋白和多肽的生物反应器, 重点研究
利用转基因油菜生产饲用疫苗, 以期在规模上与生
物燃油原料相匹配, 大幅度提升油菜蛋白质组份的
价值, 降低作为生物燃油原料专用油料作物的综合
成本。
4. 3 基因工程提高油菜抗逆性和生态适应性
利用海涂、荒坡等非农业用地, 解决大规模发
展油菜种子质基生物柴油原料种植所需土地
问题
大规模发展油菜种子基生物柴油所需解决的一
大难题是种植所需土地问题。我国虽然疆域辽阔,
但现有耕地却不多, 仅占国土面积的 14% ,若按人均
耕地计算,则我国有 666个县低于联合国粮农组织
规定的 0. 8 亩的警戒线。油菜由于是冬种作物, 除
了现有的冬闲田可用于生物柴油专用油菜生产, 我
国还有广大的土地资源可供开发: ( 1)我国的山地丘
陵多,山地资源丰富。据统计,山地、高原和丘陵约
占国土总面积的 69%, 但由于山地土层薄、肥力差、
缺水等因素不宜现有油料作物品种生长。( 2)我国
也是水资源缺乏的国家,同时冀、鲁、豫的冬、春、夏
油菜兼种区因冬季低温, 难以高产、稳产, 旱、寒等逆
境条件制约了油菜产业的发展。( 3)我国广大的沿
海滩涂也具有发展油菜生产的潜力。
在我国现有的高油、高产油菜品种中导入抗
(耐)旱、耐低温协迫、耐盐碱等抗逆基因, 利用基因
工程技术增强油菜对 N、P 等营养元素的吸收能力,
培育可在恶劣生态条件下生长的能源油菜, 这不
仅有助于解决大面积营造生物柴油原料耕地资源缺
乏的困难, 有益于缓解土壤沙化、改善我国生态环
境,同时也将带动我国油菜品种的更新换代。在拟
南芥等模式植物上已成功地通过功能基因的表达调
控, 提高了植株对非生物协迫的抗性。但利用
CaMV35S 启动子驱动的抗性基因的组成型表达,常
常会导致植株矮化等生理异常, 如何利用逆境诱导
表达启动子来实现这些基因的时空特异表达, 是油
菜抗逆基因工程育种所需要解决的问题。
4. 4 作为生物燃油原料的特种脂肪酸组分定向调
控技术 高品位生物柴油专用油菜品种的
培育
长碳链植物油粘度大,直接影响油的喷射、影响
柴油机使用寿命。发达国家在运用生物技术降低生
物柴油的粘度、提高十六烷值、增加低碳脂肪酸含量
以获得高品位燃油等方面进行了长期的探索。油料
作物油脂中、短链甘油三酸脂含量很低, Dehesh
( 1996)等在油菜 ( Cano la) 中转入萼距花 ( Cuphea
hookeriana)的硫酯酶基因 Ch FatB2,使转基因油菜
种子中短链脂肪酸( 8 0 和 10 0)大幅度提高[ 25]。
此外, 利用代谢工程技术实现芥酸等超长链脂肪酸
在油菜中的超量积累,通过后续双键位置裂解工艺,
产生 13C 和 9C脂肪酸,也是培育高品位生物柴油生
产专用品种的值得探索的重要途径。该研究方向技
术体系的建立, 也可为利用油菜生产其它生物基产
品原料提供相应的技术平台。
利用基因工程技术培育能源油菜, 是能源战
略顺利实施所提出的重大战略性课题, 我国对该领
域的研究和产业发展有必要进行精心布局和政策引
导,对功能基因组学、基因表达调控、功能基因聚合
育种、植物代谢工程、植物生物反应器等各个层面的
研究进行系统集成, 这也将增强我国在农业生物技
术和作物育种领域的科技自主创新能力和核心竞争
力,进而促进科学和经济的全面发展。
492005年第 6期 陈锦清等:基因工程创制油菜种子基生物燃油的关键技术
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国外动态
Arcadia公司推出转基因耐盐育种技术
AgBio tech 2004年 21卷 4期 4页报道: Arcadia生物科学公司已将其转基因耐盐育种技术转让给 Cal/
w est种子公司,允许这家公司利用这一技术培育耐盐苜蓿。根据双方签订的协议, Cal/ w est公司独家拥有
在世界范围内培育和销售含有 A rcadia 公司的耐盐基因的苜蓿种子的权利。目前, Cal/ West 公司已将这种
耐盐的苜蓿种子销售至世界上的主要苜蓿种植国,包括美国、加拿大、墨西哥、阿根廷、澳大利亚和中东国家。
已知土壤的盐害是由天然和人为两方面的原因造成的。人为的原因是长期和过度的灌溉。据统计,目
前全世界已有 77百万余公顷的耕地遭受盐害的威胁。Ar cadia 公司的转基因耐盐育种技术,可使农作物能
在盐害土壤中生长, 并提高其单产和收益。据悉, 除耐盐苜蓿外, Arcadia公司还培育出耐盐的番茄, 并拟将
耐盐育种研究推广到其他农作物, 包括水稻和小麦。 汪开治
50 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期