全 文 ：原虫的蛋白质组学研究进展
姜连连 黄兵 韩红玉 董辉 赵其平 陈兆国
(中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海 200232)
摘 要: 随着/ 人类基因组计划0的完成, 包括双向电泳和质谱技术的蛋白质组学作为基因组学研究的补充
和终点,不断增加我们对基因功能的理解, 逐渐成为医学研究的中心。原虫作为医学研究的对象和工具, 研究内容
十分广泛。本文将从原虫生活史、致病机理、潜在疫苗以及抗药性等方面对原虫的蛋白质组学进行综述。
关键词: 蛋白质组学 基因组学 原虫
Research Progress of Protozoan Proteomics
Jiang Lianlian Huang Bing Han Hongyu Dong Hui Zhao Qiping Chen Zhaoguo
( K ey L a borator y f or A nimal Para si tology of M inist ry of A gr ic ul tr y ,
S hanghai Inst itut e of A nimal P arasi tolog y , CA A S , Sh anghai 200232)
Abstract: Proteomics o ffers a new set of to ols fo r inv estg ating pr oto zo a and pro tozoa-associated disease. The
key technolog ies involv e tw o-dimensional g el electropho resis, image analy sis, biolog ical mass spectr oscopy and data-
base sear ching . T his a rticle describes the possible developments o f prot eomics in pr otozoan pathogenesis, drug re-
sistance, vaccine discovery .
Key words: Proteom ics Genomics Pro tozoa
分子生物学在近几十年中经历了革命性的发
展,随着基因组测序的大规模进行,大量的 DNA 序
列在数据库中积累, 目前已有 50多种生物的基因组
序列被测定完毕,但单纯得到基因序列并不是基因
研究的终点, 存在许多局限性 [ 1, 2] , 如: 基因表达与
相应蛋白质表达存在时间上的差异;基因表达的部
位与相应蛋白质执行功能部位有所不同; mRNA 与
蛋白质的相关系数仅为 0. 4~ 0. 5; 蛋白质的修饰
等,这些都揭示对直接参与生命活动的蛋白质研究
的必要性。蛋白质组学( proteomics)是合并双向电
泳分离技术和质谱分析技术, 并应用生物信息学阐
明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式的一个
研究领域。它研究了一定条件下某一时间一个生物
或者生物学部分的全部蛋白质。蛋白质组反映了遗
传信息,并且增加生物学和环境效应,这些生物学和
环境影响通过对最初翻译产物的共同翻译和翻译后
的蛋白质修饰导致蛋白质的多样化。只有研究蛋白
质在特定条件下的表达情况,才能深入地了解蛋白
质的表达、分布、加工修饰以及相互作用。
原虫作为研究对象和工具, 对其蛋白质组的分
析和鉴定也加快了蛋白质组学技术的进步。原虫与
其他寄生虫相比存在着一些显而易见的优势:它是
一种单细胞生物, 结构相对简单, 易于培养和处理,
表面抗原漂移现象相对简单;变异株容易通过人工
诱导方式获得,如抗药株的诱导[ 3] ;其基因组相对较
少,编码蛋白的数目比动植物细胞少;许多对人类危
害较大的原虫基因组已完成全部测序工作,如引起
人类疟疾的恶性疟原虫、黑热病的利什曼原虫的全
基因序列测定,其他有致病性的原虫基因测序也取
得了较大的进展, 这些 DNA 序列的信息为进一步
研究蛋白质组奠定了良好的基础。如今对原虫的蛋
白质组学研究主要在以下几个方面。
收稿日期: 2004-12-23
项目基金:上海市自然科学基金项目( 02ZC14111)
作者简介:姜连连( 1978- ) ,女,江苏泗洪人,硕士,主要从事球虫分子生物学研究, E-m ail: h uan gbing232@ 163. com
生物技术通报
# 综述与专论# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 3期
1 对原虫生活史的各阶段研究
原虫的生活史包括了原虫的生长、繁殖和传播。
原虫为了更好地适应环境,完成其生命周期, 必须在
需要的时候变换其生命周期, 原虫在不同的发育阶
段以不同的形态寄生于宿主体内。如疟原虫有 4个
发育阶段:孢子体、裂殖体、滋养体以及配子体;利什
曼原虫是一种双形态生物体, 即位于白蛉肠内具有
鞭毛的前鞭毛体和寄生于哺乳动物宿主细胞内的无
鞭毛体; 原虫在它不同的功能状态、生命周期不同
时、接受不同条件因素的刺激或药物作用下, 其蛋白
质组也会发生相应的变化,正是这种不同的蛋白质
组构成了原虫在这一时刻的特征性生命活动的基
础,人们对这种形态的转变的分子基础却知之甚少。
因此, 对于这种蛋白质组的特有组成及其变化的研
究,即分离鉴定不同时期所表达的特异性蛋白质,是
认识生命活动本质的一个恰当而直接的途径。Flo-
r ens[ 4] 等对恶性疟原虫的整个发育阶段的虫体进行
蛋白质组的研究,每个阶段均分离了 2 400种以上的
功能蛋白, 孢子体阶段大约 49%是孢子体特有的蛋
白,其他阶段的疟原虫所含的特异蛋白也大约占
20% ~ 33%。而 4 个发育阶段都有的蛋白质仅占
6%, 发现了子孢子中大量表达的一种蛋白质, 而这
种蛋白质也大量存在于感染的红细胞表面,这揭示
了控制该蛋白的表达可以有效防止疟原虫的感染。
Fakhr y等 [ 5]利用 2-DE和质谱分析技术对利什曼原
虫的无鞭毛体和前鞭毛体的蛋白质进行研究,发现
无鞭毛体大约含有 60多种特异性蛋白质, 其中参与
能量代谢的异柠檬酸脱氢酶和糖代谢的磷酸丙酮异
构酶要明显高于其他阶段,表明虫体在巨噬细胞内
是一种耗能的过程。M T hiel[ 6] 等也用细胞新陈代
谢标志直接比较利什曼原虫的蛋白质合成模式和蛋
白质水平模式, 显示从前鞭毛体至无鞭毛体, 蛋白质
合成有显著降低。
2 对原虫分类的研究
对原虫的类型进行及时和准确地分析鉴定在原
虫整体研究中十分重要 , 传统的原虫分析鉴定方
法, 包括显微镜微生物形态观察、选择性培养基培
养、纯种分离和生长发育鉴定等 , 存在一定的缺陷。
近年来 , 人们利用不同原虫在 18s 核糖体 RNA
( rRNA)及其基因( rDNA)序列上的差异来进行原虫
种类的鉴定。但也存在局限性和偏差, 例如核酸提
取的效率和 PCR中的问题等。由于蛋白质组微小
电荷的差异在 2-DE 图谱上都可以显示出来, 所以由
蛋白质组分析得到的原虫虫株变异程序比在 DNA
水平要高,以 2-DE图谱上蛋白质的共迁移为基础可
以对原虫进行分类, 这也是原虫分类的一个发展方
向。Babiker 等 [ 7] 在研究恶性疟原虫的遗传多态性
时,利用 2-DE技术对其蛋白质组份进行了分离, 研
究了酶的多态性, 并利用该技术对恶性疟原虫的抗
原进行研究, 比较了不同种属寄生虫之间的抗原差
异。
3 对原虫致病机理的研究
能够从整体水平上研究原虫的蛋白质谱的变化
是蛋白质组研究非常明显的优势。疟原虫致使每年
在全球引起 500多万新增病例, 270多万人死亡。因
此,一直是当今全球危害性极大和最重要的原虫
病[ 8]。疟原虫的黑化包被反应是按蚊抵御疟原虫感
染免疫的最重要免疫机制,寻找引起疟原虫黑化包
被的识别分子是疟原虫研究的一个重要目标。杨松
等[ 9]利用 2-DE和质谱分析分离和鉴定约氏疟原虫
卵囊黑化相关的斯氏按蚊中肠和血淋巴差异表达蛋
白,发现 8 种与抗疟免疫、黑化、结构、糖蛋白、细胞
通讯相关的蛋白质。同时,还以斯氏按蚊-疟原虫为
模型,应用 2-DE 分析比较硝喹处理前后感染约氏疟
原虫的斯氏按蚊血淋巴蛋白差异, 结果发现感染疟
原虫后的斯氏按蚊血淋巴蛋白质明显增强,而硝喹
诱导约氏疟原虫卵囊黑化后, 斯氏按蚊血淋巴蛋白
浓度明显下降。
鸡球虫病是危害养禽业的重要寄生虫病。微线
体和棒状体在球虫侵入和定居宿主小肠上皮细胞的
过程中起重要作用, 但由于对球虫细胞器的蛋白质
研究较少, 因此, 对球虫的入侵机制尚不清楚。
Bromley 等 [ 10]对柔嫩艾美耳球虫的微线体的蛋白质
组进行了研究,鉴定了 37 个蛋白质点,这些蛋白的
鉴定为研究球虫入侵过程提供参考。
4 对原虫检测诊断及潜在疫苗的研究
原虫蛋白质组的比较研究与免疫印迹的方法相
结合已广泛用于原虫的各项研究中, 如优化疫苗制
备、检测诊断、设计用药以及阐明药物对细胞生理的
影响等。1999年, Junyblut等 [ 11]将鼠弓形虫 RH 株
12 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
在人羊毛膜细胞系 FL521传代后, 用 2-DE 技术得
到 300个银染的蛋白质斑点, 进一步分析发现有 9
个斑点可作为弓形虫感染的标志, 其中有 7种标志
可用作区别疾病分不同阶段, 从而为弓形虫的诊断
提供了可能的靶蛋白。
利用蛋白质组学的研究途径 , 可以将抗原分类
为分泌性的、只在特定阶段表达的、与性别限制性有
关的以及在许多种类寄生虫所共有的抗原。通过比
较蛋白质的合成水平可以推测免疫源性因子比如天
然抗体反应率以及在特定时间内的抗原分泌情况即
分泌组。此外, 通过蛋白质组学可以筛选综合性的
寄生虫蛋白质阵列增加发现适合于疫苗应用的新抗
原[ 12]。Lee EG 等[ 13]将免疫印迹技术引入新孢子虫
蛋白质研究中,获得了 64 种有效抗原,主要集中在
65KD左右,对 31个蛋白质斑点进行质谱分析表明:
有 6种蛋白是虫体特异性蛋白质,另外还有 11种与
岗地弓形虫的抗原又很高的同源性。
5 对抗原虫药物的研究
与其他寄生虫一样, 原虫病一般也通过药物预
防和控制。原虫的抗药性一直是临床上很棘手的一
个问题。新药物的开发成为当务之急, 通常对于新
药物的预测相对是比较容易的 , 但要最后证实新药
物就困难得多。随着人和原虫基因序列的逐渐清
楚,大量的数据和信息被提供,这就为发现新的药物
作用靶位创造了条件, 通过比较已用分子敲除技术
或特殊抑制剂去除了公认的药物靶点的细胞蛋白组
来确定。蛋白质组学有助于研究一种新的药物是否
确实影响了选择的蛋白靶点, 这是因为对药物的反
应能导致蛋白靶的上调或者下调[ 14] 。蛋白质组学在
药物研究中的另一个重要应用是调查原虫抗药性。
1995年, Basco 等[ 15] 研究发现疟原虫的抗药性产生
是由药物靶酶- 二氢叶酸还原酶( DFHR)的基因点
突变而导致一种酶改变引起的。通过点突变试验在
DHFR编码区域实验性导入类似于疟原虫抗乙胺嘧
啶抗性的点突变, 使弓形虫对药物产生抗性。利什
曼原虫抗药性也证明是由于点突变而使某一种酶改
变引起的, 以上研究均表明原虫的抗药性最终表现
在蛋白质水平上。蛋白质组学的优势在于能够从整
体水平上分析不同条件下蛋白的变化, 而过去的抗
药性研究仅仅是专注于个别酶的变化 , 而不是整体
的反应。这一点对于原虫尤其重要 , 因为原虫在其
不同发育阶段、不同时期 (比如入侵机体或细胞与
入侵前后 )均可能有很大的差异。差异蛋白质组学
则是着重于寻求和筛选任何有意义的因素引起的 2
个样本之间的差异蛋白质谱, 揭示细胞生理和病理
状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径,以
及细胞调控机制, 同时获得对某些关键蛋白的定性
和功能分析。刘文江等[ 16 ]利用 2-DE 比较了柔嫩艾
美耳球虫抗药株与敏感株第二代裂殖子的蛋白质
组,笔者也利用 2-DE 比较了柔嫩艾美耳球虫抗药株
与敏感株孢子化卵囊的蛋白质组, 均发现了一些差
异表达蛋白斑点, 为柔嫩艾美耳球虫的抗药性产生
机理和抗药株的分之标志物提供了研究方向。
蛋白质组学研究技术在原虫学中应用还仅处于
起步阶段。相信不久的将来, 随着电泳和质谱技术
的不断改进和发展, 原虫数据库的不断完善和健全,
将有助于人们查明诸如原虫生长、发育机理, 免疫逃
避机制,原虫与宿主的识别和信号递送、抗药机理等
一系列问题。总之, 蛋白质组学研究技术在原虫学
中的应用将会揭开人们认识原虫和原虫病的新篇
章,将为研制防治原虫病的新疫苗、新药物开拓新途
径。
参 考 文 献
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132005年第 3期 姜连连等:原虫的蛋白质组学研究进展
神经原纤维缠结的分子基础 [ 15]。AGEs及其受体的
相互作用,可造成不可逆性神经毒性作用。在肾脏
病变中,晚期糖基化终产物( A GEs)是蛋白质的氨基
与糖的醛基发生非酶性糖基化反应的终产物,在慢
性肾功能衰竭和糖尿病肾病并发症的发生和发展中
起重要作用。研究表明, AGEs 能通过刺激小鼠肾
小管上皮细胞株的有丝分裂原, 活化蛋白激酶的活
力而影响细胞的代谢 [ 16]。
3 展望
糖链合成代谢及功能的阐明, 不仅有助于理解
微生物感染机制、为抗感染药物开发提供靶位,而且
微生物来源的糖基转移酶、糖苷酶和其它糖链代谢
辅助酶将会成为糖工程研究、应用的工具酶。基因
组学和生物芯片技术被引入糖链的结构功能研究、
糖链的生物合成与化学合成方法的建立等方面, 使
得糖链的结构与功能研究也更深入、更详细。糖链
的结构与功能关系的阐明是后基因组时代生命科学
研究的核心内容之一, 将对人类的健康产生巨大的
影响。同时,由于糖基化工程的研究主要集中于糖
蛋白糖链功能的分析和糖基化表达体系的构建。可
以预见,它在理论上可阐明糖链的功能,在实践上则
可为解决基因工程药物的免疫原性、生物活性及药
物设计等问题提供指导。随着糖基化工程已成为继
基因工程和蛋白质工程之后在生物化学及分子生物
学领域很有前景的学科, 我们有理由相信, 糖链及其
糖基化的研究将会在 21世纪取得长足发展。
参 考 文 献
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#国外动态 #
巴西疫苗销售额猛增
Pharmaceutical Business New s 2003年 442期 10~ 11页报道: 据统计, 2003年上半年巴西疫苗销售额
已猛增至 18. 3百万美元(相当于 11. 2百万英镑或 16. 2百万欧元)。其中,肝炎疫苗占据了约 1/ 3的份额。
GlaxoSmithKline公司是巴西的最大疫苗生产厂商, 其销售额达 7. 4百万美元。其次 Arent is Pasteur
公司,其销售额达 2. 7百万美元。 汪开治
172005年第 3期 侯温甫等: 糖链及其蛋白质糖基化