全 文 ：血痕 Chelex 100 抽提 DNA用于人类 TNF-A基因
启动子区 SNP分型
庾蕾 庄志雄 叶小明 甘永霞 杨学艳
(深圳市疾病预防控制中心食品(毒理)科,深圳 518020)
摘 要: 建立快速、简便的血样本采集及 DNA 抽提方法, 可用于大规模的分子流行病学调查及群体遗传学
研究。采用无菌纱布为载体取血, Chelex100 快速抽提 DNA, 用 TaqM an M GB 探针对人类 TNF-A基因启动子区-
857( C/ T )位点进行 SNP 分型。344 份血样均得到明确的分型结果,获得的荧光信号强, 本底低。深圳地区汉族群
体-857 位点基因型频率分别为: cc为 0. 78, ct为 0. 21, tt为 0. 01。血痕 Chelex100 抽提 DNA 为大规模血样本的采
集, DNA 的抽提提供了有效的手段。
关键词: 鳌合剂 DNA 基因分型 实时定量 PCR 单核苷酸多态性
Chelex 100 as a Medium for Extraction of DNA from Bloodstains
for the SNPs Genotyping of Human TNF-AGene Promoter
Yu lei Zhuang Zhix iong Ye Xiaoming Gan Yongx ia Yang Xueyan
( Dep ar tment of T ox ic ology , S henz hen cen ter f or di sease con tr ol and pr ev ent ion , Sh enz hen 518020)
Abstract: To establish r apid and simple blood co llect ion and DNA ext raction methods fo r the larg e scale stud-
ies o f molecular epidemio lo gy and population genetics. Bloodstains were made using steril bandage as carr ier. Che-l
ex100 resin w as utilized for ex tr act ing DNA. The SNP at the site-857( C/ T ) in the human TNF-Agene promoter w as
genotyped by using TaqMan MGB probs. The exact g eno typing results of 344 Bloodstains w ere obtained , having
st rong fluor escent signal and low backg round. The genotype frequencies o f SNP at the site-857( C/ T ) wer e 0. 78, 0.
21 and 0. 01 fo r cc, ct and t t r espectiv ely fr om the H an population in Shenzhen. P rocedures utilizing Chelex100 resin
ex tr act ing DNA from bloodstains were useful in larg e scale blood collection and DNA ex traction.
Key words: Chelating agents DNA Genot ype t he r ea-l time PCR SNP
在分子流行病学及群体遗传学研究中常遇到大规模人群血样本的采集, DN A的抽提。常规多采用抽取
静脉血 4~ 5ml, EDT A或肝素抗凝,酚-氯仿抽提 DNA。虽然该法抽提的 DNA 质量好, 但低温长期保存,
也存在一些缺点:取血量大,不易获得配合;血样品运输困难, 操作复杂等。Chelex100是一种碱性金属离子
鳌合树脂,在煮沸条件下裂解细胞并沉淀蛋白质以分离 DNA,主要用于法医学的痕迹检验 [ 1, 2]。作者采用无
菌纱布为载体取血, Chelex100快速抽提 DNA 用于人类 TNF-A基因启动子区 SNP 分型, 避免上述传统方
法的缺陷。现报道如下:
1 材料与方法
1. 1 血样的采集
准备 4层 3cm @ 3 cm 大小无菌纱布,取 0. 2ml静脉血涂抹在纱布上, 室温晾干, 制成血痕标本。344份
血样本取自深圳地区健康体检的汉族群体。
收稿日期: 2005-02-11
基金项目:广东省医学科学技术研究基金资助项目( A710)
作者简介:庾蕾( 1964- ) ,女,安徽马鞍山人,博士,主要从事人类 DNA 多态性研究。T el: 0755-25505530; E- mail : lily8423@ sin a. com
通讯作者: E-mail: zxzhu ang@ szcdc. n et ; Tel: 0755-25639066
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
1. 2 DNA 抽提
采用 Chelex 100法快速抽提 DNA。剪取血纱约 5 mm @ 5mm, 置于 0. 5ml离心管中, 加超纯水浸泡 10
~ 15min至血纱颜色变淡, 10 000r pm 离心 5m in,弃上清, 保留 20Ll左右液体和载体; 加 5% Chelex 100约
200Ll, 轻轻倒转、混匀, 56 e 孵化 0. 5h以上,高速振荡 5~ 10s; 98 e 孵化 8~ 10min, 高速振荡 5~ 10s;瞬间
离心,取上清液作 PCR扩增反应。
1. 3 荧光定量 PCR
采用 T aqMan MGB 探针进行 TN F-A启动子区-857( C/ T )位点 SNP 分型。用 Primer Express 软件设
计引物和探针, 序列如下: 引物 A: 5cCACAGCAATGGGT AGGAGAAT GT 3c; 引物 B: 5c AGGT CCT G-
GAGGCT CTT TCACT 3c。探针 1: FCCCTGTCT TCGTT AAGP; 探针 2: 6CCCT GT CTT CA TT AAGP( F
代表 FAM, 6代表 HEX, P 代表 MGB 基团)。PCR反应体系为 10Ll含 T aqM an M aster M ix 5Ll( ABI ) ,引
物、探针浓度分别为 900nM 和 250 nM。在 Mx4000( st ratagene)荧光定量 PCR仪上反应: 50 e 2 min , 95 e
10 min ,继而 95 e 30sec , 60 e 30 sec进行 45循环。仪器自动收集荧光信号,软件分析给出 SNP 分型结
果。
2 结果分析
以无菌纱布为载体取血, Chelex 100法快速抽提 DNA, 用 T aqMan MGB 探针对 TNF-A基因启动子
区-857( C/ T )位点进行 SNP 分型, 344份血样均获得分型结果,见表 1及图 1、图 2。
表 1 深圳地区汉族群体 TNF-A基因启动子区-857 位点基因型及等位基因频率
人数 基因型(例数/频率) 等位基因(例数/频率)
CC CT T T C T
344 268( 0. 78) 71( 0. 21) 5(0. 01) 607( 0. 88) 81( 0. 12)
图 1 SNP分型荧光定量 PCR扩增曲线
s 代表 cc基因型, u 代表 ct 基因型, p 代表 t t基因型 ,横坐标为循环数,纵坐标为荧光值
3 讨 论
Chelex 100为介质提取 DNA 进行 PCR扩增,主要用于法医学的痕迹检验。Walsh PS[ 1] 等报道精液及
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少量血痕样品用Chelex 100法提取 DNA 与常规的酚- 氯仿抽提 DNA 同样或更有效,且血痕用Chelex 100
法提取 DNA 不易含PCR抑制物。本文以血痕 Chelex 100 抽提 DNA 进行实时荧光定量 PCR扩增,获得的
荧光信号强,本底低(图 1) , 得到明确的分型结果(表 1和图 2)。Chelex 100法抽提 DNA 所需样本量少,仅
5mm @ 5 mm 血纱;操作步骤简单,省时且不易污染;以无菌纱布作为载体, 只需常温下保存,标本可邮寄且
需样品量少,便于取得合作。操作时需注意: 超纯水浸泡时尽可能使血纱颜色变淡;在加入 Chelex 100 时需
充分混匀。
图 2 SNP分型双荧光分布图
s 代表 cc基因型, u 代表 ct基因型, p 代表 t t 基因型, w代表阴性对照,横坐标为 FAM 荧光值,纵坐标为HEX 荧光值
目前报道的T NF-A基因 SNP 分型方法包括ARMS( the amplif ication refr actory mutat ion) [ 3] , PCR-SS-
CP[ 4] , PCR-RFLP[ 5] , SSOP[ 6]及序列分析。前 3种方法均需电泳分析 PCR扩增产物, 难于自动化,而序列分
析成本高,尤其对于杂合子分析需要经验。我们采用 TaqM an MGB探针技术进行 SNP 分型,其反应体系中
引物及探针双重特异性, 确保分型的准确,在荧光定量 PCR仪上反应,实时收集荧光信号, 软件自动处理给
出结果,无须后 PCR处理, 减少污染,为 SNP 分型提供了简便、快速、准确和自动化方法。
Chelex100法可用于多种样品的 DNA抽提如全血、血痕、精液、口腔拭子及石蜡包埋组织[ 7] 等。以无菌
纱布为载体取血, Chelex100快速抽提 DNA, 采用 T aqMan MGB探针技术进行 SNP 分型不仅为大规模基
因组 SNP 分析提供了有效手段, 也为分子流行病学及群体遗传学研究中大量样本的采集, DNA的抽提提供
了快速、简便的手段,可节省大量人力、物力和财力。
参 考 文 献
1 Walsh PS, Metzger DA, H iguchi R. Biotechn iqu es, 1991, 10( 4) : 506~ 513.
2 刘开会,李兆隆,常彩琴.中国法医学杂志, 2001, 2: 84~ 86.
3 Rich ards on A, Sisay- Joof F, Ackerman H , et al. Genes and Immun ity, 2001, 2( 6) : 343~ 348.
4 Park YJ, Park H , Park M H. T issue Antigens, 2004, 63( 1) : 75~ 79.
5 S oga Y, Nishimura F, Ohyama H , et al. J Clin Perio- don tol , 2003, 30( 6) : 524~ 531.
6 H iguchi T, Seki N, Kamizono S, et al. Ti ssue An tigens, 1998, 51( 6) : 605~ 612.
7 S epp R, Sz abo I, U da H, et al. J Cl in Pathol, 1994, 47( 4) : 318~ 323.
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