全 文 ：豇豆胰蛋白酶抑制剂( CpTI)基因转化欧美杨的研究
赵强1 赵志文1 张廷婷1 崔德才1* 王斌2*
( 1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018 ; 2中国科学院遗传与发育研究所,北京 100101)
摘 要: 本研究建立了欧美 107 杨的高频再生体系, 用改良的根癌农杆菌介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂
( CpT I)基因导入 107 杨中。经过严格的卡那霉素( Km)筛选,得到了 Km 抗性 ( Km r ) 植株。对部分 Km r 植株进
行 PCR及 PCR-Southern 杂交鉴定, 证实 CpT I基因已整合进杨树基因组中。转基因植株的饲虫实验表明,其中部
分株系的叶片可在一定程度上抑制扁刺蛾幼虫的生长。
关键词: CpT I基因 欧美杨 再生 根癌农杆菌 转基因植株
Transformation of Populus Euramericana with CpTI Gene
Zhao Qiang1 Zhao Zhiw en1 Zhang T ing ting1 Cui Decai1* Wang Bin2*
( 1 Coll eg e of L i f e S ci ence , Sh andong A g ri cul tu ral Univ ersi ty , T aian, S hand ong 271018;
2 I nst itut e of gene ti cs and d ev elomen t , Academy of Sc ienc e( China) , B eij in g 100101)
Abstract: The high frequency regener ation system of Populus eur americana 107 was established in this st udy.
The Cowpea trypsin inhibitor ( CpT I ) g ene was introduced by modified Ag robacter ium tumefaciens mediated method
into 107. Kanamycin resistant ( Km r ) plantlets wer e obtained by str ict scr eening selective condition added kanamy-
cin. PCR and PCR-Southern tests from par t o f Km rplantlets showed that CpT I gene has been integr ated into Popu-
lus euramer icana genome. And some tr ansgenic plants could inhibit the development of larv ae t o some ex tent.
Key words: Cow pea trypsin inhibitor g ene P opulus euramer icana Regener ation A grobacterium tumef a-
ciens T ransgenic plants
杨树不仅是重要的经济树种, 同时在水土保持和维护生态平衡方面也发挥着重要的作用。随着杨树的
广泛栽培,日益严重的虫害已经成为制约杨树丰产的重要因素[ 1, 2]。随着分子生物学的发展和杨树组织培
养技术的日趋成熟, 利用基因工程技术将外源抗虫基因转化杨树选育优良抗虫新种质已成为现实。目前,在
杨树抗虫基因工程中应用最多的是 Bt毒蛋白基因和各种植物来源的蛋白酶抑制剂基因, 前者的应用非常广
泛,已转入白杨 [ 3]和黑杨[ 4~ 6] 的各种品系。后者中的豇豆胰蛋白酶抑制剂( CpT I)基因也在毛白杨[ 7] 和新疆
杨[ 8]中转化成功,而在黑杨特别是欧美杨中的转化还未见报道。本研究选用的欧美 107杨是国家攻关诞生
的杨树优良纸浆材和生态防护林新品种,其速生性突出,树干通直,材性优良。同时在抗旱、御风能力方面也
表现良好[ 9] ,非常适于作为外源基因转化的承载体。此外,由于杨树生长周期短,离体操作容易,基因组相对
较小。因此,作为林木研究中的模式植物,杨树在植物基因工程的研究中有着不可替代的地位。
目前, 在杨树上应用的遗传转化方法主要有农杆菌介导法、PEG法、电激法和基因枪法。其中农杆菌介
导法最为常用, 然而不同的杨树无性系间在农杆菌转化效果上存在差异[ 10] ,其中影响因素很多。本研究在
提高外植体再生率的同时,对常用的叶盘转化法作了适当的改良,并在抗生素选择压的施加上针对不同外植
体采用分级分步的筛选方法, 以期建立一套适用于欧美 107杨的高效的基因转化体系。
收稿日期: 2005-03-05
作者简介:赵强( 1979- ) ,男,汉族,生物化学与分子生物学专业在读硕士
* 通讯作者:崔德才( 0538- 8242656-8308) ,王斌
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
1 材料与方法
1. 1 材料、质粒和菌种
研究所用植物材料为欧美杨 107号( Pop ulus @ eur americana CL , -74/ 76. )。CpTI 基因表达载体为
pRCL27质粒(结构见图 1) , 已被转移入农杆菌 LBA4404中,由中科院遗传所提供。昆虫材料为 7月下旬至
8月中旬在野外捕获的扁刺蛾( T hosea sinensi s )幼虫。
图 1 pRCL27 质粒
P- 35S: CaMV35S启动子 cpt i:豇豆胰蛋白酶抑制剂
基因 nos : nopal ine 合成酶基因终止子 npt-Ⅱ:新
霉素磷酸转移酶基因,作为植物选择标记 km:卡那
霉素抗性基因,作为细菌选择标记 RB, LB: T-DNA
右边界及左边界
1. 2 方法步骤
1. 2. 1 杨树无菌苗的获得 以 MS 为基本培养基,附加蔗糖及
不同配比的激素构成叶分化, 壮苗, 扩繁等不同培养基。将处于
休眠期的一年生杨树枝条置于植物组织培养室内水培促其萌发,
待芽萌生出 2~ 3片展开的嫩叶时取材最佳,而夏季间自然状态
下生长的叶片不适于培养 [ 11]。
取叶片和茎尖作组织培养的外植体, 按常规消毒接种方法处
理后, 将幼叶切割成 0. 5 cm2的小块,背面向下接种于叶片培养诱
导芽分化培养基上; 切取 1 cm 左右的茎尖以基部接种于壮苗, 扩
繁培养基上。置于 25 ? 3 e 的培养室中诱导产生愈伤组织和不定
芽,培养室光照为 1 500~ 2 000lx, 12h光/暗周期, 4~ 5周后调查
叶片上再生芽的数量及茎尖的生长情况。获得一定量组培苗后,
取 1~ 2 cm 并带有 2~ 3 片叶的茎尖接种于生根培养基上 2~ 3
周观察生根情况。不同激素配比见表 1。
1. 2. 2 卡那霉素( Km )临界筛选浓度的确定 将生长健壮的幼
嫩叶片及高约 1~ 2 cm 的茎尖分别接种于含 0, 10, 20, 30, 40, 50
mg/ L Km 的叶分化、扩繁和生根培养基上, 进行了叶片、茎尖分
化及茎尖诱导生根的抗生素临界浓度试验, 30天观察分化及生根情况。
1. 2. 3 含 CpTI 基因的农杆菌的活化与培养 取超低温保存的 LBA4404(内含 CpTI 基因)菌种,按常规方
法进行培养扩增,待 OD600nm值= 0. 6~ 1. 0时,作为转基因用的菌液备用。
表 1 不同培养基配方
基本培养基 6BA( mg/ L) KT ( mg/ L) IBA( mg/ L) NAA( m g/ L)
叶分化 ( 1号) MS 0. 5~ 0. 75 ) 0. 1~ 0. 2 )
扩 繁( 2号) MS 0. 3~ 0. 4 0. 1~ 0. 2 0. 05~ 0. 1 )
壮 苗 ( 3号) MS 0. 15~ 0. 3 0. 1~ 0. 15 0. 1~ 0. 15 )
生 根 ( 4号) 1/ 2MS ) ) ) 0. 05~ 0. 1
1. 2. 4 农杆菌介导法转基因及 Km 筛选 改良的农杆菌介导转基因程序参照刘斌等 [ 12]的方法进行,共培
养三天后, 用无菌蒸馏水洗 3~ 5遍,最后用液体叶分化( 1号)培养基冲洗 1~ 2遍。置无菌滤纸上吸干多余
液体后,采用延迟筛选的方法,将共培养后的叶片转入仅含头孢霉素( 400mg/ L)的固体叶分化培养基上培养
两周后,转移至含 20mg/ L Km叶分化培养基上至再生芽从叶片上长出,而后在含 20~ 30 mg/ L Km 的扩繁
及生根培养基上进行分级筛选,在整个筛选过程中严格设立两种对照,将未转化植株分别接种于附加Km 和
无 Km 的相应的培养基上培养, 以排除培养基及外部环境的影响。最后将 Km 抗性植株扩繁作为分子检测
的材料。
1. 2. 5 PCR鉴定( 1)引物设计与合成 选用 CpT I基因中的序列作为模板,设计合成 2个引物。
552005年第 4期 赵强等: 豇豆胰蛋白酶抑制剂( CpTI)基因转化欧美杨的研究
引物 1: 5c-GAT GAT GGT GCT AAA GGT G-3c
引物 2: 5c-CT T ACT CA T CA T CT T CAT CC-3c
( 2)杨树核基因组 DNA 提取 按 CT AB法提取转基因杨树和未转基因杨树基因组 DNA, 同时提取农杆
菌质粒 DNA(含 CpTI 基因)作为阳性对照。
( 3) PCR扩增 依据《植物基因工程原理与技术》一书中的方法[ 13] , 采用 50Ll反应体系, 94 e 预变性
10m in后,按 94 e 10min, 50 e 1min, 72 e 2m in 进行 30个循环, 72 e 后延伸 10min。检测分为转基因植株,空
白对照,阴性对照(未转基因植株)和阳性对照(质粒)。
1. 2. 6 PCR-Southern 杂交检测 将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。按照《分子克隆》一书中介绍的
Southern印迹法[ 14] ,用毛细管转移法转移到 Hybond-N + 尼龙膜上,预杂交后加入32 P 标记的 CpT I基因探
针进行杂交,然后进行放射自显影。探针以质粒双酶切( PstⅠ/ EcoRⅠ)产物 CpT I基因为模板, 采用 Pro-
mega公司的 Primer-a- Gene Labeling System, 用随机引物法合成。
1. 2. 7 抗虫生物活性测试 将转化植株和未转基因的对照植株于壮苗培养基中培养,四周后取宽大深绿色
叶片连同整个植株放入透明塑料培养桶,底部放置两层蒸馏水润湿的滤纸,培养桶的两端留有若干小孔。选
取体重 0. 5 ? 0. 1 g 的扁刺蛾幼虫,饥饿处理 12 h后, 称其体重。每桶中放入 10 只,重复 3 次。饲喂过程中
保持滤纸湿润和叶片的充足供应。7 天后再次称量幼虫体重, 并计算生物总量增长率; 14天后统计死活虫
数,计算死亡率。生物总量增长率= (饲喂后昆虫总质量- 饲喂前昆虫总质量) /饲喂前昆虫总质量 @ 100%;
死亡率= 死亡数/接虫总数@ 100%。
2 结果与分析
2. 1 欧美杨高频再生体系的建立
高频再生体系的建立是农杆菌介导的转基因方法的基础,被侵染外植体的选择更是关键。在本实验中,
叶片在叶分化培养基中的再生率可达 90%以上, 每个叶片可分化出 10~ 20个再生芽。同时配合扩繁和壮
苗培养基进行继代培养, 可得到大量用于农杆菌侵染的叶片。在激素的选用上借鉴前人经验,采用常见的细
胞分裂素 6-BA、KT 和生长素 NAA、IBA,控制其各类分化。我们发现, 6-BA 和 NAA 对本实验材料的作用
较 KT 和 IBA 大, 但 KT 能促进叶的生长,同时 6-BA 与 IBA配合使用较之与 NAA 配合使用更利于再生芽
的形成。单独使用低浓度的生长素可诱导根的形成, NAA 诱导生成的根多而粗壮而 IBA 诱导生根能力则
相对较弱。在细胞分裂素与生长素按一定比例配合使用的前提下,较高的激素水平有利于再生芽的形成,较
低浓度的激素则有利于芽发育成形态正常的植株。通常情况下,当细胞分裂素与生长素浓度比值在 5~ 7之
间,可诱导再生芽的大量产生,随着这一比值的减小,分化作用减弱, 当比值为 1~ 2 时, 利于壮苗, 而当比值
小于 1时,会有根的形成。通过大量的激素配比实验, 总结出了适合欧美杨 107号的激素配比(表 1) ,从而
建立了从叶分化到生根这一完整的再生体系。
2. 2 农杆菌侵染和 Km 抗性植株的获得
农杆菌介导法转基因是双子叶植物转化最常用的的方法,本实验室对常见的侵染方法做了改进:用添加
表面活性剂( Silw et L-77或 T w een-40/ 80)的 5%~ 8 % 的蔗糖溶液替代常用乙酰丁香酮, 同时共培养在由
再生液体培养基浸润的滤纸上进行,这样既可有效的抑制农杆菌的过度生长, 又不影响叶片在培养基上生
长,使整个侵染试验变得简便易行。通过针对大量毛白杨, 美洲黑杨及欧美黑杨的基因转化实验 [ 15~ 17] , 均得
到了较满意的转化效率。由此证明,这是一种对杨树行之有效的农杆菌侵染方法。
由于所构建的植物表达载体携带有新霉素磷酸转移酶( nptⅡ)基因, 因此以 Km 为筛选试剂选择转化植
株,同时也注意到,不同的外植体在不同的诱导状态下对 Km 的抗性也是有差别的。为了确定 107杨对 Km
的本底抗性,将均匀一致的叶切块及生长状态一致的茎尖接种在附加 Km 浓度 0~ 50 mg/ L 的系列培养基
上,培养 30 天后,结果如表 2所示。我们发现, 在 Km 的作用下, 叶片再生芽的诱导与根的诱导在 20mg / L
56 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
的情况下便受到了明显的抑制。以此为根据,设定了初步的 Km 临界筛选浓度: ( 1)叶片再生芽的诱导时为
20 mg/ L( 2)茎尖或芽的扩大繁殖培养时为 30mg/ L( 3)诱导生根时为 20 mg/ L。然而将共培养后的叶片直
接接种于附加 Km 叶分化培养基上, 发现 10 mg/ L 时所有材料即无任何分化,而在 20 mg/ L 时很快褐化,无
法得到再生芽。分析原因,可能是由于叶片在受到机械和细菌侵害的损伤后,其再生能力和细胞活力大大受
损,因此采用延迟筛选的方法。将共培养后的叶片转入仅含头孢霉素( 400mg/ L )的固体叶分化培养基上,培
养两周后再转入含 20mg/ L Km 叶分化培养基上, 培养至有较大再生芽长出。随后取存活的再生芽转入附
含 30mg/ L Km 的 2号扩繁培养基上, 继代培养 2~ 3次, 剔除黄化和基部不分化的植株。最后将得到的 10
个生长较好的株系接种于附含 20mg / L Km 的生根培养基上诱导其生根,三周后发现其中 8株可以生根,但
与对照相比根分化普遍较弱。
表 2 不同 Km含量对外植体分化的影响
培养基
外植体 (附加 Km mg/ L) 0 10 20 30 40 50
叶片 1号 分化出大量 仅少量叶片 无分化 无分化 褐化 褐化
(叶分化) 再生芽 出现芽点 褐化 坏死 坏死
茎尖 2 号 基部分化 分化明显 仅有少量 基部膨大 基部萎缩 植株白化
(扩繁) 良好 减弱 分化 茎部黄化 植株黄化
茎尖 4 号 分化出大量 分化出少量 基部膨大 基部萎缩 植株白化 植株白化
(生根) 粉红色主根 细根且褐化 无根分化 植株黄化
图 2 转 CpTI基因杨树基因组 PCR检测
1. marker DL2000 2.质粒作为阳性对照 3. 非转基因植株作为阴性对照
4~ 7. 转基因植株,有与质粒相同的 326bp的特异带,说明 CpT I 基因已经整合
到杨树基因组中 8.空白对照
2. 3 Km 抗性植株的分子生物学鉴定
将通过 Km 严格筛选的抗性植株分别
进行扩繁培养, 2~ 3 周后取其叶片和嫩茎
用作核基因组总 DNA 提取的材料。根据
PCR分析(图 2)和 PCR-Southern 杂交检测
(图 3)的结果,筛选出真正的转基因苗。
按照通常的转基因鉴定方法, 在 PCR
和 Southern 基础上还应进行 Western 和
Northern 杂交, 而后作饲虫实验。我们觉
得从应用角度 考虑, 省 略 Western 和
图 3 转 CpTI基因 PCR-Southern检测
3~ 6. 为转基因植株,说明PCR 扩增是真实的 1. 质粒DNA作为阳
性对照
Northern 杂交步骤既可以缩短从实验室到田间
的时间,加快应用的步伐, 又可以节约经费, 降低
成本。因为抗虫的最直观鉴定就是看害虫吃食后
的直接反应,实验室内的工作再完美,最后还是要
看抗虫效果, 所以本研究省略了实验室内的一些
步骤,而直接进行了饲虫实验。
2. 4 转基因植株的饲虫试验
7天和 14天的抗虫生物活性测试(图 4)表
明:与对照相比,饲喂转基因植株( A 1、A2、A3、A4)的扁刺蛾幼虫的体重增长受到了一定的抑制,其中 A2株
饲喂下的幼虫体重增长率比对照要低 45. 2%,差距最小的 A 3也要低 17. 1%。在前 10天的饲喂时间内,幼
虫的活动能力逐渐减弱, 第 11天开始出现死亡的幼虫,在随后的 5天里,死虫数没有大的增加。同时发现,
在对照组也有 13. 3%的死亡率,分析原因可能是由于野外来源的扁刺蛾幼虫不适应本实验的饲喂环境所
572005年第 4期 赵强等: 豇豆胰蛋白酶抑制剂( CpTI)基因转化欧美杨的研究
致。由于扁刺蛾幼虫生活周期较长,体态较大,所以较长的饲喂时间才对其起作用。另外, 扁刺蛾幼虫只咬
食叶肉,并且组培苗的也非常幼嫩,被咬食后很快萎缩,很难统计叶片损伤的情况, 因此, 转基因植株的叶片
和非转基因植株的叶片被危害的程度之间无法比较。但总的看来,转基因植株与非转基因植株相比,在抑制
扁刺蛾幼虫体重增加和致死率这两个方面,都表现除了一定的抗虫活性, 同时也说明了 CpTI 对昆虫的作用
并不是短时间内致死,而在于抑制其消化道内酶的活性,使昆虫厌食而减少食物的摄入量, 最终导致其营养
不良,发育受抑制或者死亡。
图 4 转 CpTI基因欧美杨植株室内抗虫性鉴定
3 讨论
基因转化的基础在于建立良好的组织培
养再生体系,而不同基因型的植株以及同一植
株上的不同器官,其再生能力均有所不同[18]。
我们认为外植体的再生能力在很大程度上取
决于培养条件,特别是激素种类和水平。在本
实验中,在1号叶分化培养基上, 107杨的叶片
分化效率很高,非常适于作基因转化的材料。
这与国内的某些研究结果[ 19]不同。目前,本实
验室已经建立起了三倍体毛白杨,美洲黑杨和
欧美黑杨部分品种的组织培养再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系,发现不同品种间叶片和茎尖的再生及分化
能力差别不大,而基因转化效率却有较大的差别。这与国内外的某些研究是一致的[2, 20] ,可能是由于不同基因型的
植株对侵染菌株的敏感度不同所致[ 18]。与此同时,如何提高转化效率,也是人们在利用农杆菌转化各种植物时所
关心和研究的一个热点。本研究中用于基因转化的植物材料欧美 107杨是目前在我国特别是北方地区重点推广
的优良品系之一,通过基因工程手段对其进行外源基因的转化可以提高其各种抗性。我们准备将目前获得的转基
因株系进行酶活抑制和进一步的大田抗虫实验,筛选出抗虫性优良的株系,再用同样的方法将几丁质酶基因转入
其中,以期最终获得既抗虫又抗真菌病害能力的杨树植株。
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