全 文 ：第26卷 第8期
2014年8月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 26, No. 8
Aug., 2014
文章编号：1004-0374(2014)08-0858-08
DOI: 10.13376/j.cbls/2014123
收稿日期：2014-01-13； 修回日期：2014-03-14
基金项目：国家自然科学基金项目(81260248, 813602-
47)；国家科技支撑计划项目 (2011BAI15B0121,
2012BAI39B01, 2014BAI01B01)
*通信作者：E-mail: oliverxia2000@aliyun.com
HCV复制子与细胞培养体系研究进展
刘　宁，冯　悦，张阿梅，岳　蕾，夏雪山*
(昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500)
摘　要：丙型肝炎是由丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus, HCV)感染所导致的传染性肝病，呈现世界性流行态
势，严重危害人类健康。由于病毒自身高度突变，以及广泛高效的细胞培养体系和合适的小动物模型缺乏，
目前尚无可有效预防的疫苗。自 1989年丙型肝炎病毒基因组首次被确定以来，Con1(1b)亚基因组复制子和
JFH1(2a)毒株细胞培养体系相继建立。以此为工具，HCV生活周期多个关键环节得以阐明。近年来，研究
者在 Con1亚基因组复制子、JFH1和 J6/JFH1细胞培养体系的基础上，构建出多个基因型和亚型的复制子
和细胞培养体系。不同的体系在 HCV复制与致病机制研究、抗病毒药物筛选方面，具有不同的用途及优
缺点。针对 HCV复制子与细胞培养体系的研究进展进行综述，可为 HCV的相关研究提供参考。
关键词：丙型肝炎病毒；复制子；基因型；嵌合体
中图分类号：Q939.4；R512.63 文献标志码：A
The development of HCV replicon and cell culture system
LIU Ning, FENG Yue, ZHANG A-Mei, YUE Lei, XIA Xue-Shan*
(Faculty of Life Sciences and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)
Abstract: Hepatitis C is an infectious hepatopathy caused by hepatitis C virus (HCV). It is globally prevalent and
seriously harmful to the health of human beings. So far, there are no preventive vaccines due to the lack of efficient
cell culture systems derived from various genotypes and suit small animal models, and also the frequent mutation of
HCV genome. Since the genome of HCV firstly was determined in 1989 using molecular cloning technique, the
replicons of Con1 subgenome and JFH1 (2a) cell culture system were constructed subsequently. Further studies
made great progress in our understanding on the multiple phases of the life cycle of this virus. Recently, based on
the constructing strategies of the Con1 replicon, JFH1 and J6/JFH1 cell culture systems, HCV replicons and cell
culture systems of other genotypes have been generated. Various systems have been selectively used in the research
of HCV replication, pathogenic mechanism and anti-virus drug screening. Here, we review the progress in the
construction of HCV replicons and cell culture systems to provide a helpful reference for the research of HCV.
Key words: hepatitis C virus; replicon; genotype; chimera
丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus, HCV)为单股
正链 RNA病毒，属黄病毒科，丙型肝炎病毒属 [1]。
据统计，全世界约有 1.85亿人感染 HCV，55%~
85%的感染者会发展为慢性肝炎，近 30%的慢性
感染者最终会发展为肝硬化，甚至肝癌 [2]。HCV
的基因组长约 9.6 kb，由一个开放阅读框 (open
reading frames, ORF)和两侧的非编码区组成 (图 1)。
非编码区对病毒 RNA的复制和翻译至关重要 [3]，
HCV的开放阅读框编码一个约 3 000个氨基酸的多
聚蛋白前体。在宿主细胞的内质网中，该前体由宿
主和病毒蛋白酶加工成 10个成熟的功能性蛋白 [4]，
分为结构蛋白和非结构蛋白两大类。
HCV基因高度变异，根据核酸序列同源性，
刘　宁，等：HCV复制子与细胞培养体系研究进展第8期 859
HCV可分为 7种基因型和 67个亚型 [6]。不同基因
型 HCV具有明显的地区分布差异，如在欧洲以 1
型为主要流行，3型在印度和泰国非常普遍，4型
主要分布于埃及和中东地区，5型主要分布在南非，
6型主要集中在东南亚地区 [7]。丙型肝炎的临床常
用治疗药物为干扰素 /利巴韦林联合疗法 [8]，其治
疗有效率及病程进展速度很大程度上取决于感染病
毒的基因型 [9]。其中，干扰素对 1型和 4型 HCV
感染的治疗效果差，而基因 3型 HCV感染与脂肪
病变和纤维化高度相关。尽管最近以依赖 RNA的
RNA聚合酶 (RdRp)为靶点的抗病毒药物 sofosbuvir
(也称 PSI-7977)的使用较大程度地提高了患者持续
性病毒学应答率，但由于病毒在此区段自然发生的
基因变异可能产生耐药性突变，该药物使用仍伴有
一定的副作用 [10-12]，亟待开发新型抗病毒药物。由
于不同基因型存在地区差异化，且在药物治疗应答
方面有明显的差异 [13]，因此迫切需要建立针对不同
基因型 HCV的研究工具，为丙型肝炎的预防和治
疗策略的研究提供技术支撑。
1　亚基因组复制子体系
自 1989年 HCV全基因组首次被克隆后，HCV
体外细胞培养体系的缺乏严重制约了 HCV病原学
研究及抗 HCV药物的研发。直到 1999年，属
HCV 1b型的 Con1病毒株亚基因组复制子体系的成
功建立，使得 HCV体外细胞培养体系的建立有了
突破性进展 [14]。Con1亚基因组复制子是在 HCV全
基因组中去除核心蛋白至 p7和非结构蛋白 2 (NS2)
两段基因，相应替换为非病毒成分新霉素磷酸转
移酶 (neo)基因 (用于 G418抗性筛选 )和小核糖
核酸病毒的内部核糖体进入位点 (IRES)。由此获得
的 HCV复制子具有双顺反子，可分别编码 neo基
因和 HCV复制酶 (NS3~NS5B)基因。将该复制子
的转录产物转染人肝癌细胞系 Huh7，经 G418抗性
筛选，可获得具有 HCV RNA高水平复制细胞克
隆 (单个细胞含 1 000~5 000个正链 RNA分子 ) [15]。
HCV亚基因组复制子体系部分模拟 HCV的真实复
制周期但不产生感染性病毒颗粒，通过测定 HCV
正链和负链 RNA及非结构蛋白水平，可评价 HCV
复制的水平 [16]。
Con1亚基因组复制子的构建策略已被用来构
建HCV其他病毒株的亚基因组复制子。李雪黎等 [17]
用 Quick change点突变法删除 pJ6/JFH1BlaRL质
粒上的 core-NS2片段，替换为海肾荧光素酶 (Rluc)
报告基因，构建了 HCV-IRES启动的单顺反子复制
子，通过测定报告基因的表达来检测 HCV的复制。
Date等 [18]按照 Kato等 [19]的 pSGR-JFH1亚基因组
复制子体系的构建策略，构建了 HCV 2a 型 JFH2
毒株的亚基因组复制子，通过插入荧光素酶报告基
因获得含报告子的复制子。Saeed等 [20]用含 NPTII
基因和 EMCV IRES的片段替代 HCV 3a型 S52毒
株的 20 ~ 1 032个氨基酸获得新霉素抗性的亚基因
组复制子 S52/SG-neo，并用编码萤火虫荧光蛋白
(Luc)与 NPTII的融合基因取代 NPTII 基因，获得
表达萤火虫荧光蛋白的亚基因组复制子 S52/SG-
Feo。为提高基因复制效率，引入位于 NS5A蛋白
的 S2210I核酸点突变，使 RNA拷贝达每 µg RNA
1.9 × 107~ 5.5 × 107。进而，Saeed等 [21] 又从一例
肝移植后复发的丙型肝炎患者得到 3a型 HCV毒株
S310，用相同的策略建立了 S310毒株在 Huh7细
胞中稳定复制的亚基因组复制子体系。在此基础上，
Yu等 [22]相继构建了 3a型 S52毒株的用于 neo抗性
筛选、便于检测的 neo-Rluc融合报告子的亚基因组
复制子体系，以及脊髓灰质炎病毒的 IRES与 Rluc
融合报告子的用于瞬时转染的亚基因组复制子体
系，引入位于 NS5A的 S232I突变，极大地增强了
HCV的复制效率和 neo-Rluc抗性克隆的形成率。
在 4a型 HCV亚基因组复制子构建方面，Peng等 [23]
构建了含 NS4A蛋白 Q34R和 NS5A蛋白 S232I适
应突变的亚基因组复制子 ED43-RluNeo，neo和荧
光素酶基因的插入使其具有良好的筛选和检测标
记。Saeed等 [20]用 NPTII和 EMCV IRES的基因片
灰色：HCV的结构蛋白；白色：非结构蛋白。其中core-E2蛋白与HCV的入侵相关，非结构蛋白NS3~NS5B与HCV复制相关[5]。
图1 HCV基因组模式图
生命科学 第26卷860
段替代HCV 4a型 ED43毒株的 20~ 1 026个氨基酸，
获得新霉素抗性筛选的亚基因组复制子 ED43/SG-
neo，并用萤火虫荧光蛋白基因与 NPTII 融合基因
取代 NPTII 基因获得表达萤火虫荧光蛋白的亚基因
组复制子 ED43/SG-Feo。引入位于 NS5A蛋白的
S2204I和 E2163G双重突变后，进一步提高了 HCV
RNA的复制效率。
近年，HCV嵌合型亚基因组复制子的研究也
取得了一些进展。Wang等 [24]用 3a型 HCV 3个毒
株的 NS5A基因，替换 JFH1亚基因组复制子的相
应区段，得到以 2a型为骨架嵌合 3a型 NS5A基因
的亚基因组复制子。Kylefjord等 [25]则用 3a型病毒
的NS5A-5B替代pFK/I389Luc 3-3ET中的相应区段，
得到以 1b型为骨架嵌合 3a型病毒 NS5A-5B区段
的亚基因组复制子。鉴于 NS5B对 HCV复制的重
要作用，Wong等 [26]将 2b、3a、4a、5a和 6a型 HCV
的 NS5B序列嵌合到 1b-Con1亚基因组复制子，获
得以 1b型为骨架，分别含有多个基因型 NS5B区
段的嵌合型亚基因组复制子。不同基因型、亚型及
不同形式嵌合型亚基因组复制子体系的构建，为研
究 HCV非结构蛋白的功能，筛选靶向抗病毒药物
提供了必要的技术支持。部分举例见表 1。
2　HCV细胞培养体系
亚基因组复制子不含结构蛋白基因，没有完整
的病毒生活周期，无法进行病毒感染机制及结构蛋
白对宿主细胞影响的研究 [27]。用 HCV Con1毒株的
全长基因组替换其亚基因组复制子中的非结构蛋
白，获得含 HCV全基因组的质粒，体外转染宿主
细胞，获得能够在宿主细胞中高效复制和表达蛋白
的 HCV全基因组复制子体系 [28]，使得对 HCV结
构蛋白的研究成为可能。由于缺乏支持 HCV组装
和释放的宿主因子，该体系无法释放出感染性病毒
颗粒，无法进行 HCV组装和释放的研究 [28-29]。
2005年，Wakita等 [30]成功构建了 2a型 HCV毒株
JFH1感染性克隆的细胞培养体系。在不引入适应
性突变的情况下，HCV基因组可在 Huh7细胞和其
衍生的肝癌细胞系，如Huh7.5细胞中稳定高效复制，
产生的病毒颗粒可感染黑猩猩 [31]。HCV病毒培养
体系的成功构建极大地推动了 HCV的研究进展。
部分举例见表 1。
Li等 [32]对 J6全长克隆 (J6CF)的 3′UTR 可变
区 (VR)的核苷酸进行突变并缩短多聚 poly (U/UC)
序列，引入 F1468L、A1676S、D3001G、F776S、P1100L
和 N1931S/T多氨基酸位点突变，使 J6全基因组
J6-LSGΔ33U能在 Huh7.5细胞中高效复制，病毒滴
度达 104.2 FFU/mL。在 2b型的 HCV J8毒株基因组
中引入与 J6同样的突变位点 (F1468L、A1676S和
D3001G)，有效启动了 J8毒株在转染细胞中的复制；
引入 F772C/W864R/A1208T和 I1968V/ E2263V/H2922R
两种形式的联合突变，可有效提高其感染和病毒颗
粒的产生。感染后 6~10 d，超过 80%的细胞被感染，
上清病毒滴度最高达 102.7~102.9 FFU/mL，连续传代
后病毒滴度达 103.2~103.4 FFU/mL。之后，Li等 [33]
表1 部分毒株HCV复制子和细胞培养体系的复制、感染能力及适应性突变引入
HCV培养体系 基因型 适应突变 细胞系 感染滴度Log(FFU/mL)
亚基因组复制子
S52/SG-neo[20] 3a S2210I Huh7.5 -
S52-neo[22] 3a P89L/K583E 1C -
S52-Pi-Rluc[22] 3a P89L/K583E 1C -
ED43/SG-neo[20] 4a S2204I/E2163G Huh7.5 -
ED43-neo[23] 4a Q34R/S232I 1C -
ED43-RluNeo[23] 4a Q34R/S232I 1C -
细胞培养体系
TNcc[33] 1a F1464L/A1672S/D2979GY2981F/ Huh7.5 4.9
A1226G/Q1773H/N1927T/F2994S
J6cc[32] 2a F1468L/A1676S/D3001G/F776S/P1100L/N1931S/T Huh7.5 4.2
J8cc[32]
PR63cc[34] 2b F1468L/A1676S/D3001G/F772C/W864R/A1208T/ Huh7.5 3.4
I1968V/E2263V/H2922R
2a n.r Huh7.5.1 5
注：-，该复制子只能在细胞中复制，不具备感染细胞的能力；n.r，未查到参考文献中的相关报道；感染滴度，指该体系在
转染和传代中能达到的最高感染性滴度。
刘　宁，等：HCV复制子与细胞培养体系研究进展第8期 861
通过引入 HCV 2a(J6)和 2b(J8)型全长细胞培养体系
构建必要的 F1464L/A1672S/D2979G (LSG)突变 (位
于非结构蛋白区 )获得 HCV 1a型 TN全长毒株的
细胞培养体系。病毒感染滴度达 104.6~104.9 FFU/mL，
与 阳 性 对 照 病 毒 J6 5′UTR-NS2/JFH1(104.7~104.9
FFU/mL)感染力相当。Date等 [18]用 JFH2的 5′UTR-
NS2区段替代 pJ6/JFH2 T7启动子下游 J6的相应序
列获得 HCV 2a型的 JFH2毒株的细胞培养体系，
该复制子能在 Huh7.5.1细胞中复制，释放出的病毒
颗粒能够感染培养的细胞。Lu等 [34]以 JFH1为骨架，
用一例 2a型 HCV临床分离株 (PR63)样本的序列
依次取代 JFH1的相应序列，通过功能性克隆筛选、
拼接及引入细胞适应性突变，构建了它的全长感染
性 cDNA克隆 (PR63cc)，进而建立了基于 PR63cc
的 HCV细胞感染模型。PR63cc在 Huh7.5.1细胞
中能高效产生病毒，最高感染滴度达 1.6 × 105
FFU/mL。该病毒对现有抗丙肝药物的敏感性与
JFH1病毒不同，其中 PR63cc病毒对 NS5A的抑制
剂高度不敏感。PR63cc是第一例来源于中国丙肝
患者样本的全长感染性克隆，也是世界上首例不通
过共有序列，而直接从临床样本来源构建的能感染
肝细胞系的感染性克隆。这种新开发的方法可以应
用于其他临床分离株，对丙型肝炎患者的个性化治
疗以及药物测试开发等领域均有重要意义。
3　嵌合体HCV细胞培养体系
由于未知原因，对于细胞培养体系中 HCV的
感染与感染性病毒颗粒的产生，JFH1非结构蛋白
似乎必不可少，现有的细胞培养体系多以 JFH1毒
株为骨架进行构建。另外，非结构蛋白氨基酸突变
可使 HCV RNA在 Huh7细胞复制更为高效，产生
感染性病毒粒子的能力更强。鉴于此，研究者通过
构建 JFH1毒株与其他基因型或亚型的嵌合体 HCV
细胞培养体系，以弥补其他基因型、亚型 HCV细
胞培养体系难以建立的不足。
为了进行 1b型 HCV结构蛋白的研究，Chan
等 [35]用 1b型 Con1毒株的 core-NS2蛋白前 33个
氨基酸的编码基因片段替换 JFH1的相应部分，并
将人源化的海肾荧光素酶基因插入到 1b型 HCV的
5′UTR和 core之间，获得带有报告基因的 1b/2a嵌
合体 HCV (1b/2a hRluc)。在此嵌合体中引入 6个适
应性氨基酸突变，分别为位于 core的 A150V，NS2
的 L839S，NS3 的 V1065G 和 I1312V，NS5A 的
M2388I和 NS5B的 V2937A，极大增强了病毒对
Lunet细胞的感染效率和感染性病毒颗粒的产生能
力。用不同的 HCV抑制剂处理插入和未插入海肾
荧光素酶的病毒，证明海肾荧光素酶的插入没有改
变病毒对药物的敏感性。Lu等 [36]用临床样本来源
的 1b 型 (GT1b) HCV core-NS2 的第一个跨膜域
(TMD)(aa 1~842)的序列替代 JFH1对应的序列，构
建了嵌合型 HCV GT1b core-1st TMD/JFH1。1b型
是中国、日本和欧洲等地流行的主要 HCV基因型，
临床来源的 1b型毒株与 2a型嵌合体 HCV细胞培
养体系的构建对 1b和 2a型混合感染患者的抗病
毒治疗具有重要意义。该临床毒株嵌合体的构建
策略为其他临床分离株的细胞培养体系的构建提
供了参考。
适应性突变可显著提高病毒的感染与复制效
率，Galli等 [37]用基因型 1a、1b、3a、4a、5a、6a
和 7a的 core-NS2和 NS5A取代 JFH1的相应序列，
通过反向遗传学分析，引入适应性突变 Y1644H和
E2267G，最终得到可用于检测 core与 NS5A共定
位的基因型 1~7的 core-NS2/NS5A的嵌合体病毒
H77C/JFH1(1a)和 TN/JFH1(1a)，以及 J4/JFH1(1b)、
S52/JFH1(3a)、ED43/ JFH1(4a)、SA13/JFH1(5a)、
HK6a/JFH1(6a)和 QC69/JFH1(7a)。在 Huh7.5细胞
传代后，HCV的RNA载量最高约 107 IU/mL。S52(3a)、
SA13(5a)和 QC69(7a)感染滴度最高达 104 FFU/mL，
H77C(1a) 和 HK6a(6a)的达 103.5 FFU/mL，而 TN(1a)、
J4(1b)和 ED43(4a)的低于 103 FFU/mL。Li等 [38]在
HCV 1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a和 6a的 5′UTR-NS2
与 JFH1的嵌合型细胞培养体系中，进行HCV 5′UTR
区的删除或定点突变，经功能验证发现 5′UTR的茎
环结构 I (1~43个核苷酸 )是基因型 1~6病毒感染
所必需的。
HCV的非结构蛋白尤其是 NS5A、NS5B对病
毒的复制、增殖具有重要作用。通过用不同基因型
的重要功能蛋白的基因区段替换 J6/JFH1的相应序
列，构建的嵌合型病毒的细胞培养体系将是研究这
些蛋白相关功能的重要工具 [39-42]。
Gottwein等 [43]分别将基因型 1a(H77和 TN)、
1b(J4)、2a(J6)、3a(S52)、4a(ED43)、5a(SA13)、
6a(HK6a)和 7a(QC69)的 NS3 N末端 1/3的蛋白酶
域 (NS3P)与 NS4A替代 J6/JFH1的相关序列，得
到表达特定基因型 NS3P/4A的嵌合体 HCV，并建
立了这些体外重组病毒的细胞培养体系。在这些
培养体系中引入位于 E1、p7、NS2、NS3P、NS4A、
NS4B和 NS5A的相关适应性突变，培养体系上清
生命科学 第26卷862
中的病毒感染滴度达 103.5~104.0 FFU/mL。此外，Gott-
wein等 [44]用相应基因型 1a (H77和 TN)、1b(J4)、
2a (J6)、3a (S52)、4a (ED43)、5a (SA13)、6a (HK6a)
和 7a (QC69)的NS4A取代 pJ6/JFH1的NS4A序列，
建立能表达多种基因型 NS4A蛋白的病毒培养体
系。引入位于 P7和 NS4A的适应性突变 F772S(P7)
和 V1663A(NS4A)，显著提高了嵌合型病毒的感染
与增殖效率，感染滴度不低于 103.5 FFU/mL。Scheel
等 [45]用 HCV 7个基因型 H77C(1a)、TN(1a)、J4(1b)、
J6(2a)、 S52(3a)、ED43(4a)、SA13(5a)、HK6a(6a)
和 QC69(7a)病毒株的 NS5A替换 J6/JFH1完整的
NS5A序列，得到表达特定基因型 NS5A蛋白的嵌
合型病毒的细胞培养体系。引入适应性突变使得重
组病毒产生效率及感染滴度明显增高。
含报告基因的嵌合体 HCV细胞培养体系的构
建提高了HCV相关研究的易操作性。Gottwein等 [46]
在 2a型的 J6/JFH1 基因组的 NS5A区段插入 EGFP
报告基因，经在 Huh7.5细胞适应性培养，NS5A蛋
白产生一个 40或 25个氨基酸的结构缺失 (△ 40
或△ 25)，来修复 EGFP报告基因的插入导致的病
毒粒子装配功能损伤。用该报告基因插入表达的方
法，进一步构建了 1~7基因型的 core-NS2与 JFH1
嵌合并可具有 EGFP或 RLuc等报告基因的多种形
式的嵌合体全基因组细胞培养体系。这些带报告基
因的嵌合型细胞培养体系，使得进行高通量抗病毒
药物筛选和 HCV中和抗体评价成为可能。目前抗
病毒药物研究中最常用的药物筛选体系是 J6/JFH1
嵌合体病毒的细胞培养体系。Kamada等 [27]为了便
于检测药物对 HCV复制的抑制作用，对 J6/JFH1
进行改造。用 pFL J6/JFH1中的 J6/JFH1全基因组
替换 pFGR JFH1/Luc中的 JFH1全长，得到含单顺
反子荧光素酶报告基因的 pFGR J6/JFH1/Luc病毒。
该报告子病毒可以作为 HCV的替代模型，用于研
究 HCV的各个生活阶段，包括入侵、复制和子代
病毒的产生等。由于该病毒便于检测，已应用于抗
HCV化合物库的筛选。
多种基因型 HCV中重要功能蛋白的嵌合型病
毒细胞培养体系的建立 (复制子的结构、感染能力
和引入的适应性突变见表 2)，为针对相应基因型
HCV生活周期中的特定靶点及其相关功能研究提
供了技术保障。
4　复制子和细胞培养体系的应用和优缺点
HCV亚基因组复制子体系含有的主要药物靶
点是 NS3/4A丝氨酸蛋白酶和 NS5B RNA依赖的
RNA聚合酶。目前，HCV亚基因组复制子涵盖了
范围更广的基因型和分离株 (表 1)。因为亚基因组
复制子的基因比全长病毒基因组更易于改造，通过
用特定基因型或毒株的相应基因替代复制子中的蛋
白酶或聚合酶基因，获得针对特定基因型相关靶点
的嵌合体亚基因组复制子，更有利于开展针对特定
靶点的相关功能或药物研究。而含报告基因的亚基
因组复制子，如荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶和氯
霉素转移酶等，进一步促进了 HCV感染的研究，
可以在不影响 HCV复制的情况下，追踪观察活细
胞中的 HCV复制复合物 [47-48]。此外，复制子系统
不会导致生物危害，这使得该系统可以在低级别的
生物安全水平进行以筛选为目的的实验。因此，
HCV复制子系统的存在对于开发新的抗 HCV药物
具有重要意义。HCV亚基因组复制子对抗病毒药
物耐药株的筛选也很重要。在大多数情况下，筛选
使用的是可选择的复制子系统，该系统利用选择标
记 (如 G418对含有新霉素基因的复制子 )来保护
抗病毒药物选择压力作用下的复制子，进而筛选出
含有 RNA变异的细胞克隆。当使用 HCV细胞培养
体系时，具有高基因屏障的强效抗病毒药物可迅速
消除培养基中的病毒，无法达到筛选耐药株的目的。
然而，该体系也有自身的缺点。因为 HCV
RNA的复制与宿主细胞的增殖相偶联，抑制宿主
细胞生长的药物也会降低病毒 RNA的复制水平，
无法真实地反映该药物对 HCV复制的影响。细胞
培养的适应性突变也可能改变病毒蛋白的生化性
质，从而对抗病毒药物的敏感性发生变化。此外，
使用亚基因组复制子模型进行抗病毒药物的筛选，
实际上忽略了结构蛋白对化合物抗病毒活性的影
响。由于目前大部分复制子系统是双顺反子，对
EMCV IRES有抑制作用的药物也能抑制病毒 RNA
的复制。然而，随着不含外源 IRES的单顺反子复
制子的成功构建，这种假阳性的复合物将逐渐被
排除。
HCV细胞培养体系能够在实验室中产生重组
的感染性 HCV病毒颗粒，可以用于研究 HCV完整
的生活周期，尤其是对生活周期的晚期阶段即组装
与释放的研究。此外，HCV细胞培养体系是研究
该病毒与宿主细胞相互作用的模型，可以通过构建
不同基因型、亚型之间的嵌合体 HCV细胞培养体
系，观察不同嵌合体病毒的复制效率和感染率，来
研究 HCV不同基因区域之间的相互作用。
刘　宁，等：HCV复制子与细胞培养体系研究进展第8期 863
表2 部分转染Huh7.5细胞的嵌合体病毒细胞培养体系的特性
嵌合毒株 基因型 嵌合片段 适应突变 感染滴度Log(FFU/mL)
JFH1骨架
H77[46] 1a Core-NS2 T2701C/A4081T 3.7
TN[46] 1a Core-NS2 T2701C/A4081T 4.3
J4[46] 1b Core-NS2 T2701C/A4081T 3.7
J6[46] 2a Core-NS2 None 4.7
J8[46] 2b Core-NS2 None 4.0
S52[46] 3a Core-NS2 T2701G/ A4533C 4.4
ED43[46] 4a Core-NS2 A2820G/A3270T 3.8
SA13[46] 5a Core-NS2 C3403G/ A3694G 5.3
HK6a[46] 6a Core-NS2 T1387C/ A1591C 4.4
QC69[46] 7a Core-NS2 T2975C/ C8356T 4.1
H77[37] 1a Core-NS2/NS5A V787A/C1185S/ Q1247L 3.5
TN[37] 1a Core-NS2/NS5A I1312V/ R1408W 2.7
J4[37] 1b Core-NS2/NS5A F886L/C1185S/Q1496L 2.5
J6[37] 2a Core-NS2/NS5A None 5.0
S52[37] 3a Core-NS2/NS5A I787S/ K1398Q/C2419R 3.8
ED43[37] 4a Core-NS2/NS5A T827A/T977S/ Y1644H/E2267G 2.6
SA13[37] 5a Core-NS2/NS5A A1021G/K1118R/ R1978G/C2419R 4.5
HK6a[37] 6a Core-NS2/NS5A F349S/ N417T/I2268N 3.3
QC69[37] 7a Core-NS2/NS5A L878P 4.1
J6/JFH1骨架
S52[43] 3a NS3P/4A G868S/L1663A/E2267G/T270A/F772S/F842V 4.0
SA13[43] 5a NS3P/4A F880S/I1682L/I1859M/N2077D/M2275V 3.4
HK6a[43] 6a NS3P/4A F772S/V1040L/V1663A 3.9
H77[44] 1a NS4A F772S/ V1663A 3.8
TN[44] 1a NS4A F772S/ V1663A 3.8
J4[44] 1b NS4A F772S/ V1663A 4.3
ED43[44] 4a NS4A I879T/V1663A 4.3
SA13[44] 5a NS4A F772S/ 1663A/V1683F 3.7
HK6a[44] 6a NS4A F772S/ E1105A/V1663A/V1677A 3.6
QC69[44] 7a NS4A F772S/ I1061V/V1663A/S1679C 3.8
H77[45] 1a NS5A None 4.2
TN[45] 1a NS5A None 4.1
J4[45] 1b NS5A R867H/C1185S 4.3
JFH1[45] 2a NS5A None 5.0
J6[45] 2a NS5A F772S 4.5
S52[45] 3a NS5A D1975G 4.4
ED43[45] 4a NS5A F772S/Y1644H/E2267G 4.4
SA13[45] 5a NS5A R1978G/S2416G 3.8
HK6a[45] 6a NS5A I2268N 4.2
QC69[45] 7a NS5A None 4.2
注：感染滴度，指该体系在转染和传代中能达到的最高感染性滴度。
HCV细胞培养体系或嵌合体细胞培养体系的
构建大多需要引入相应的适应性突变以增加 HCV
的复制能力和感染力。然而，在 HCV细胞培养体
系中引入的相关适应性突变也可能改变病毒蛋白的
生化性质，使抗病毒药物的敏感性发生变化，从而
无法真实地反映药物的抗病毒效果 [49]。另外大部分
HCV细胞培养体系是以 2a型的 JFH1为基础进行
构建的。该基因克隆源自于一位罕见的暴发型的肝
炎患者，不属于全球流行的主要基因型。此外，
HCV细胞培养体系的高通量筛选还需要大规模感
生命科学 第26卷864
染性病毒颗粒的生产，会产生生物危害，不能在低
生物安全水平的实验室中进行操作，在一定程度上
限制了该系统的使用。
5　总结与展望
目前 HCV亚基因组复制子体系从 1b、2a型扩
展到 3a、4a等其他基因型，HCV细胞培养体系也
由最初单一的 2a型 JFH1毒株，逐渐构建出 1a型
TN毒株、2a型 J6毒株和 2b型 J8毒株的细胞培养
体系 (表 1)。由 JFH1非结构蛋白编码区段与 HCV
基因型 1~7的结构蛋白基因嵌合而成的 HCV嵌合
体病毒 (表 2)，进一步拓宽了 HCV细胞培养体系
的范围，尤其在抗病毒药物筛选和中和抗体评价方
面具有重要意义 [25, 30]。含报告子的 HCV亚基因组
复制子和感染性病毒克隆使得对于 HCV的相关研
究更加容易操作，功能性克隆筛选和拼接技术可
用于临床毒株细胞培养体系的构建；在 HCV 细
胞培养体系中引入适应性突变 (如 F1468L/A1676S/
D3001G)，则增加了 HCV在宿主细胞中的复制和
感染性病毒粒子产生的效率，提高了 HCV的感染
滴度。鉴于不同基因型 HCV生物学特性以及对抗
病毒治疗反应性的差异，有必要建立真正的各基因
型或亚型 HCV的亚基因组复制子和细胞培养体系，
为 HCV 病原学研究及药物、疫苗开发提供技术
保障。
[参　考　文　献]
[1] Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA
clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral
hepatitis genome. Science, 1989, 244(4902): 359-62
[2] Thomas DL. Global control of hepatitis C: where chal-
lenge meets opportunity. Nat Med, 2013, 19(7): 850-8
[3] Penin F, Dubuisson J, Rey FA, et al. Structural biology of
hepatitis C virus. Hepatology, 2004, 39(1): 5-19
[4] Dubuisson J, World J. Hepatitis C virus proteins. World J
Gastroenterol, 2007, 13(17): 2406-15
[5] Lindenbach BD, Rice CM. Unravelling hepatitis C virus
replication from genome to function. Nature, 2005,
436(7053): 933-8
[6] Smith DB, Bukh J, Kuiken C, et al. Expanded classifica-
tion of hepatitis C virus into 7 genotypes and 67 subtypes:
Updated criteria and genotype assignment web resource.
Hepatology, 2014, 59(1): 318-27
[7] Simmonds P, Bukh J, Combet C, et al. Consensus
proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis
C virus genotypes. Hepatology, 2005, 42(4): 962-73
[8] Poynard T, Yuen MF, Ratzin V, et al. Viral hepatitis C.
Lancet, 2003, 362(9401): 2095-100
[9] Bisceglie AM Di, Hoofnagle JH. Optimal therapy of hepa-
titis C. Hepatology, 2002, 36(5 Suppl 1): S121-7
[10] Gentile I, Borgia F, Buonomo AR, et al. A novel promis-
ing therapeutic option against hepatitis C virus: an oral
nucleotide NS5B polymerase inhibitor sofosbuvir. Curr
Med Chem, 2013, 20(30): 3733-42
[11] Herbst DA Jr, Reddy KR. Sofosbuvir, a nucleotide poly-
merase inhibitor, for the treatment of chronic hepatitis C
virus infection. Expert Opin Investig Drugs, 2013, 22(4):
527-36
[12] Lam AM, Espiritu C, Bansal S, et al. Genotype and sub-
type profiling of PSI-7977 as a nucleotide inhibitor of
hepatitis C virus. Antimicrob Agents Chemother, 2013,
56: 3359-68
[13] Doerrbecker J, Meuleman P, Kang J, et al. Thermostability
of seven hepatitis C virus genotypes in vitro and in vivo. J
Viral Hepat, 2013, 20(7): 478-85
[14] del Canho R, Grosheide PM, Mazel JA, et al. Ten-year
neonatal hepatitis B vaccination program, The Nether-
lands, 1982-1992: protective efficacy and long-term
immunogenicity. Vaccine, 1997, 15(15): 1624-30
[15] Woerz I, Lohmann V, Bartenschlager R. Hepatitis C virus
replicons: dinosaurs still in business? J Viral Hepat, 2009,
16(1): 1-9
[16] Lohmann V, Körner F, Koch J, et al. Replication of subge-
nomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.
Science, 1999, 285(5424): 110-3
[17] 李雪黎, 雷宇, 钟珊. 基于2a基因型丙型肝炎病毒自身启
动子的单顺反子复制子的构建和功能测定. 中华肝脏
病杂志, 2012, 20(2): 103-7
[18] Date T, Kato T, Kato J, et al. Novel cell culture-adapted
genotype 2a hepatitis C virus infectious clone. J Virol,
2012, 86(19): 10805-20
[19] Kato T, Date T, Miyamoto M, et al. Efficient replication of
the genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon.
Gastroenterology, 2003, 125(6): 1808-17
[20] Saeed M, Scheel TK, Gottwein JM, et al. Efficient
replication of genotype 3a and 4a hepatitis C virus
replicons in human hepatoma cells. Antimicrob Agents
Chemother, 2012, 56(10): 5365-73
[21] Saeed M, Gondeau C, Hmwe S, et al. Replication of
hepati t is C virus genotype 3a in cultured cells .
Gastroenterology, 2013, 144(1): 56-58.e7
[22] Yu M, Corsa AC, Xu S, et al. In vitro efficacy of approved
and experimental antivirals against novel genotype 3
hepatitis C virus subgenomic replicons. Antiviral Res,
2013, 100(2): 439-45
[23] Peng B, Yu M, Xu S, et al. Development of robust
hepatitis C virus genotype 4 subgenomic replicons.
Gastroenterology, 2013, 144(1): 59-61.e6
[24] Wang C, Valera L, Jia L, et al. In vitro activity of
daclatasvir on hepatitis C virus genotype 3 NS5A.
Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(1): 611-3
[25] Kylefjord H, Danielsson A, Sedig S, et al. Transient
replication of a hepatitis C virus genotype 1b replicon
chimera encoding NS5A-5B from genotype 3a. J Virol
Methods, 2014, 195: 156-63
[26] Wong KA, Xu S, Martin R, et al. Tegobuvir (GS-9190)
刘　宁，等：HCV复制子与细胞培养体系研究进展第8期 865
potency against HCV chimeric replicons derived from
consensus NS5B sequences from genotypes 2b, 3a, 4a, 5a,
and 6a. Virology, 2012, 429(1): 57-62
[27] Kamada K, Shoji I, Deng L, et al. Generation of a recom-
binant reporter hepatitis C virus useful for the analyses of
virus entry, intra-cellular replication and virion produc-
tion. Microbes Infect, 2012, 14(1): 69-78
[28] Pietschmann T, Lohmann V, Kaul A, et al. Persistent and
transient replication of full-length hepatitis C virus ge-
nomes in cell culture. J Virol, 2002, 76(8): 4008-21
[29] Ikeda M, Yi M, Li K, et al. Selectable subgenomic and
genome-length dicistronic RNAs derived from an
infectious molecular clone of the HCV-N strain of
hepatitis C virus replicate efficiently in cultured Huh7
cells. J Virol, 2002, 76(6): 2997-3006
[30] Wakita T, Pietschmann T, Kato T, et al. Production of
infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned
viral genome. Nat Med, 2005, 11(7): 791-6
[31] Lindenbach BD1, Evans MJ, Syder AJ, et al. Complete
replication of hepatitis C virus in cell culture. Science,
2005, 309(5734): 623-6
[32] Li YP, Ramirez S, Gottwein JM, et al. Robust full-length
hepatitis C virus genotype 2a and 2b infectious cultures
using mutations identified by a systematic approach
applicable to patient strains. Proc Natl Acad Sci USA,
2012, 109(18): E1101-10
[33] Li YP, Ramirez S, Jensen SB, et al. Highly efficient full-
length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious
culture system. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(48):
19757-626
[34] Lu J, Xiang Y, Tao W, et al. A novel strategy to develop a
robust infectious hepatitis C virus cell culture system
directly from a clinical isolate. J Virol, 2014, 88(3): 1484-
91
[35] Chan K, Robinson M, Yang H, et al. Development of a
robust luciferase reporter 1b/2a hepatitis C virus (HCV)
for characterization of early stage HCV life cycle inhibi-
tors. Antiviral Res, 2013, 98(1): 85-92
[36] Lu J, Tao W, Li R, et al. Construction and characterization
of infectious hepatitis C virus chimera containing
structural proteins directly from genotype 1b clinical
isolates. Virology, 2013, 443(1): 80-8
[37] Galli A, Scheel TK, Prentoe JC, et al. Analysis of hepatitis
C virus core/NS5A protein co-localization using novel cell
culture systems expressing core-NS2 and NS5A of
genotypes 1-7. J Gen Virol, 2013, 94(Pt 10): 2221-35
[38] Li YP, Gottwein JM, Scheel TK, et al. MicroRNA-122
antagonism against hepatitis C virus genotypes 1-6 and
reduced efficacy by host RNA insertion or mutations in
the HCV 5 UTR. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(12):
4991-6
[39] Kaul A, Woerz I, Meuleman P, et al. Cell culture
adaptation of hepatitis C virus and in vivo viability of an
adapted variant. J Virol, 2007, 81(23): 13168-79
[40] Appel N, Zayas M, Miller S, et al. Essential role of
domain III of nonstructural protein 5A for hepatitis C
virus infectious particle assembly. PLoS Pathog, 2008,
4(3): e1000035
[41] Masaki T, Suzuki R, Murakami K, et al. Interaction of
hepatitis C virus nonstructural protein 5A with core
protein is critical for the production of infectious virus
particles. J Virol, 2008, 82(16): 7964-76
[42] Tellinghuisen TL, Foss KL, Treadaway J. Regulation of
hepatitis C virion production via phosphorylation of the
NS5A protein. PLoS Pathog, 2008, 4(3): e1000032
[43] Gottwein JM, Scheel TK, Jensen TB, et al. Differential
efficacy of protease inhibitors against HCV genotypes 2a,
3a, 5a and 6a NS3/4A protease recombinant viruses.
Gastroenterology, 2011, 141(3): 1067-79
[44] Gottwein JM, Jensen SB, Serre SB, et al. Adapted J6/
JFH1-based hepatitis C virus recombinants with genotype-
specific NS4A show similar efficacies against lead
protease inhibitors, α interferon, and a putative NS4A
inhibitor. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(12):
6034-49
[45] Scheel TK, Gottwein JM, Mikkelsen LS, e t a l .
Recombinant HCV variants with NS5A from genotypes
1-7 have different sensitivities to an NS5A inhibitor but
not interferon-α. Gastroenterology, 2011, 140(3): 1032-42
[46] Gottwein JM, Jensen TB, Mathiesen CK, et a l .
Development and application of hepatitis C reporter
viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2
(NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in
modified JFH1 NS5A. J Virol, 2011, 85(17): 8913-28
[47] Yi M, Lemon SM. Replication of subgenomic hepatitis A
virus RNAs expressing firefly luciferase is enhanced by
mutations associated with adaptation of virus to growth in
cultured cells. J Virol, 2002, 76(3): 1171-80
[48] Murray EM, Grobler JA, Markel EJ, et al. Persistent
replication of hepatitis C virus replicons expressing the
β-lactamase reporter in subpopulations of highly
permissive Huh7 cells. J Virol, 2003, 77(5): 2928-35
[49] Tariq H, Manzoor S, Parvaiz F, et al. An overview: in vitro
models of HCV replication in different cell cultures. Infect
Genet Evol, 2012, 12(1): 13-20