全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
中国传统酸肉,古称“鮓”,俗称“腌肉”(curedmeat),是有两千多年历史的乳酸细菌型发酵肉制品。目
前主要流行于湖南、广西、贵州、四川等地,是侗、苗等少数民族居民生活中的重要肉食产品,有丰富的饮食
文化内涵。因是自然发酵肉制品,其中含有多种有益微生物[1],是肉类专用发酵剂的重要生物资源,有巨大
的开发潜力。葡萄球菌在西式发酵肉制品中对改善产品的风味发挥了重要的作用,正成为新兴的肉类发酵
剂。葡萄球菌在我国传统发酵肉制品中的分布及作用如何,还未见研究报道。我们对中国传统酸肉中的葡萄
球菌进行研究,目的是要筛选出有自主知识产权的肉类专用发酵剂和食品级克隆的生物载体。
1 材料与方法
1.1 样品的准备
于 2000年 11月分别从湖南通道(A)、新晃(B)、广西三江(C)、贵州黎平(D)等地按当地的加工习惯,
从加工场选购传统酸肉 10kg(1kg/坛)。分别在发酵 0、10、20、30、40、50、60d时,采样进行微生物的分析。
1.2 葡萄球菌的分离与鉴定
称取 25.0g样品,加入 225ml0.1%的无菌蛋白胨溶液中,经组织捣碎机,低速和高速各均质 30s,得到样
品稀释液,采用稀释平板法,于 MSA(MannitalSaltAgar)培养基上 30℃,72h分离培养。每次从最高稀释度
的 MSA平板上,随机挑取 5个菌落,移接斜面,共得到 140(4×5×7)个菌株,纯化后,对具有 G+和 H2O2+特性
中国传统酸肉中葡萄球菌的分离鉴定与应用研究
李宗军
(湖南农业大学食品科技学院,长沙 410128)
摘 要: 对我国传统酸肉中的葡萄球菌进行了首次研究,结果表明:葡萄球菌是中国传统酸肉中的重要微生物类
群之一,在140个MSA培养物中有101株葡萄球菌,微球菌27株,其它杆菌和 H2O2-球菌 12株,所有葡萄球菌中有64%
对新生霉素有抗性,属腐生葡萄球菌群及相关种群。生物培养法测定到腐生型葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌对肌
原纤维蛋白有不同程度的水解能力,可以开发成肉类专用发酵剂。
关键词: 肉 发酵肉制品 肉类发酵剂 腐生型葡萄球菌 木糖葡萄球菌
IsolationandIdentificationofStaphylococciinChinese
TraditionalCuredMeatanditsApplication
LiZongjun
(ColegeofFoodScienceandTechnology,HuhanArgriculturalUniversity,HNAU,Changsha 410128)
Abstract: StaphylococciinChinesetraditionalcuredmeatwerestudiedfirstlyinthispaper.Resultsshowedthat
StaphylococciwereoneoftheimportantmicrobesfloraintheChinesetraditionalmeat.101of140MSAisolateswere
Staphylococci,27Micrococci,12bacilusandH2O2-cocci.64%ofalStaphylococcicouldresistneomycin,sotheywere
Staphylococcussarophyticugroups.ProteolysisactivityofS.sarophyticu,S.xylosusandS.carnosustomyofibrilsweredif-
ferentbymicroorganismculturemethod.Wehopeexploitthemtospecificmeatstarter.
Keywords:MeatFermentedmeatproductsMeatstarter Staphylococcussarophyticu Staphylococcusxylosus
收稿日期:2005-09-02
基金项目:国家863项目(2002AA248041),湖南省重大研究专项(04NK1102)
作者简介:李宗军,男,博士,副教授,研究方向:食品微生物生物技术,E-mail:lizongjun@yahoo.com.cn
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
的菌株进行鉴定[2~4]。
1.3急性毒理实验
按霍恩氏法分别对腐生型葡萄球菌、木糖葡萄球菌的纯培养物和分别以腐生型葡萄球菌+米酒乳杆菌+
乳酸片球菌(1:2:2)、木糖葡萄球菌+米酒乳杆菌+乳酸片球菌(1:2:2)为发酵剂(接种量为 1.0%)生产的发酵
香肠进行大白鼠口服毒理实验。
1.4 生物培养法测定葡萄球菌等对肌原纤维的降解[5,6]
培养基配方:1.5%琼脂,0.5%蛋白胨,0.25%酵母膏,1.0%葡萄糖,1.0%冻干肌原纤维粉 (Sigma公司),
0.25%柠檬酸三钠,2.0%1M CaCl2.2H2O,pH6.9。培养基装入三角瓶,121℃,灭菌 15min。边旋转,边倒平板,
尽量使肌原纤维在平板上分布均匀。待培养基凝固后,用直径为 0.6cm 无菌塑料管在培养基上打孔(3孔/
平板),每个孔内准确加入 20μl微生物培养液(乳酸细菌在液体 MRS中 30℃,培养 48h;其它细菌用营养肉
汤 37℃,培养 24h)。用 1.0%酪蛋白代替肌原纤维作对比。所有培养皿置于培养箱中 30℃,48h;从培养皿中
取下琼脂块,在考马斯亮蓝 R-250(0.05%w/v考马斯亮兰,50%v/v甲醇,9.0%v/v乙酸)中染色 5min,之
后脱色(25%v/v乙醇,5%v/v乙酸)过夜,用水解圈的大小评价蛋白质的水解程度。
2 结果与分析
2.1 G+,H2O2+球菌
从 MSA最高稀释度平板上分离的 140个菌株中,有 72.14%为葡萄球菌,微球菌占 19.28%,其它杆菌或
H2O2-球菌占 8.58%(表 1)。发酵肉制品中出现高浓度葡萄球菌,国外也有报道[7,8]。
表 1 传统酸肉中 MSA培养物的特性
+阳性;-阴性;(+)弱阳性;10/27 阳性菌株/菌株总数
从葡萄球菌在我国传统酸肉中的地域分布来看,来源于不同地方的产品,在实验期内并没有明显的差
别,这说明中国传统酸肉中的葡萄球菌是发酵过程中通过微生物类群间的有效竞争成活下来的,是传统酸
肉中的重要微生物之一,这为葡萄球菌应用于发酵肉制品的生产提供了可能性。
人们习惯将葡萄球菌与食物中毒联系在一起,为此,我们对分离自中国传统酸肉中 101株葡萄球菌的
特征 组Ⅰ 组Ⅱ
菌落颜色
红紫色 10/27 -
黄/浅黄 17/27 +
厌气发酵D-葡萄糖产酸 -/(+) +/(+)
有氧发酵产酸
D-葡萄糖 +/(+) +
D-甘露糖 - 80/101
溶葡萄球菌酶生长 + -
红霉素生长 - +/(+)
37℃生长 + +
10%NaCl生长 -/(+) 69/101
硝酸盐还原 24/27 56/101
微生物菌系 微球菌 葡萄球菌
总数 27 101
微生物分布
A 6 24
B 6 26
C 8 25
D 7 26
总数 27 101
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表2 中国传统酸肉中葡萄球菌的特性
生理生化特性进行了进一步的研究,结果如表 2。所有葡萄球菌菌落为白色到淡黄色,凝固酶均为阴性,其
中有 64%对新生霉素有抗性,属腐生葡萄球菌群及相关种群[9]。从发酵的全过程来看,91%的表皮葡萄球菌
出现在发酵期的前 30d;62%肉葡萄球菌出现在发酵 40d以内的样品中;而腐生葡萄球菌和木糖葡萄球菌在
发酵到 30~60d时有较高的出现频率(72.1%)。
据国外大量研究发现,从自然发酵香肠中分离的肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌不仅安全无毒,而且它们
具有蛋白酶、脂酶和硝酸盐还原酶活性,对保持发酵肉制品的色泽有重要作用[10],并具有一定的耐盐力,是
目前欧洲干发酵香肠常用的发酵剂。为了开发有自主知识产权的肉类专用发酵剂,我们对分离自中国传统
酸肉中的葡萄球菌的毒性及对蛋白质的水解能力进行了实验。
2.2 急性毒理试验结果
大白鼠口服急性毒理实验结果表明:来自于中国传统酸肉中的腐生型葡萄球菌和木糖葡萄球菌的纯培
养物,食用安全无毒。以腐生型葡萄球菌、木糖葡萄球菌与米酒乳杆菌,乳酸片球菌组成的混合发酵剂生产
的发酵香肠,参照香肠的国家标准对产品的蛋白质、脂肪、水分、盐浓度、过氧化值、亚硝酸盐、铅、砷等理化
指标进行了分析,产品符合国家标准。且发酵组产品中亚硝酸盐残留量较未发酵对照组下降了 21.2%。
2.3 微生物对蛋白质水解活性的测定结果
用生物培养法测定了微球菌、葡萄球菌和乳酸细菌等微生物对肌原纤维的降解效应(表 3)。微球菌和
葡萄球菌对肌原纤维有水解作用,乳酸球菌和干酪乳杆菌仅对酪蛋白有弱水解作用,其它微生物对肌原纤
维和酪蛋白均无降解作用。
特征 腐生葡萄球菌 木糖葡萄球菌 肉葡萄球菌 表皮葡萄球菌
菌落颜色 白/灰白 浅黄 白/灰白 白/灰白
厌氧生长 + (+)/- + +
NaCl琼脂
10%生长 + + + -
15%生长 + + + -
脲酶 32/41 + - +
半乳糖苷酶 28/41 + + -
硝酸还原酶 26/41 + + (+)/-
凝固酶试验 - - - -
发酵糖产酸
木糖 - 16/20 - -
阿拉伯糖 - + - -
纤维二糖 - - - -
棉子糖 - - - -
蔗糖 33/41 7/20 - +
甘露糖 15/41 + + (+)
海藻糖 + 8/20 21/29 (+)
甘露醇 17/41 15/20 + +
乳糖 16/41 15/20 19/29 (+)
麦芽糖 + + - +
新霉素敏感 R R S S
微生物分布
A 13 6 4 1
B 8 9 5 4
C 14 2 7 2
D 6 6 13 1
总数 41 23 29 8
+阳性;-阴性;(+)弱阳性;32/41阳性菌株/菌株总数;R不敏感;S敏感
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注:+++,水解圈直径d>1.5cm;++,d=0.5-1.5cm;+,d<0.5cm;—,无水解
表3 平板法测定微生物对蛋白质水解活性
由此看来,在中国传统酸肉的发酵过程中,乳酸细菌主要是降低了环境中的 pH值,抑制了部分腐败和
病原微生物,提高了产品的安全,延长了货架期。而葡萄球菌则能分泌蛋白酶,在一定程度上对蛋白质有水
解作用,有助于提高发酵肉制品中可溶性蛋白质和游离氨基酸的含量,对发酵肉制品风味的形成有重要意义。
3 讨论
140个 MSA的分离物中,通过生理生化和形态鉴定,其中 101个是葡萄球菌,27个是微球菌,MSA用于
分离肉品中的微球菌具有良好的选择性,其中的指示剂酚红颜色的变化,可以使菌落周围出现不同的颜色,
据此可以对葡萄球菌和微球菌进行初步鉴定。
食盐和硝是有效的微生物抑制剂,许多病原微生物在腌熏肉食中都不能生长。此外,选择性的环境条件
有利于乳酸菌的生长而成为微生态环境中的有力竞争者。乳酸细菌的生长通常伴随着酸性物质的形成,降
低了产品的 pH值,进一步抑制了食物病原微生物的生长。葡萄球菌在与乳酸细菌的生存竞争中,不会因为
pH值的降低而受到影响,在发酵 30~60d期间,MSA和 MRS培养物的结果表明,乳酸细菌和葡萄球菌均达
到了最高值。
凝固酶阴性的葡萄球菌常存在于腌制型的发酵肉制品中,特别是发酵香肠,由于它们能耐受高浓度的
盐,与其他微生物相比它们对亚硝酸盐、烟熏和干制等有较强的抗性。表 2的结果显示腐生型的葡萄球菌能
耐受 10%~15%的食盐,并且因为具有一定的蛋白酶活性而成为肉品发酵剂的研究对象。它们也能还原硝酸
盐,许多菌株还能还原亚硝酸盐。在发酵期间,亚硝酸盐参与的酸催化不可逆化学反应是非常重要的,其产
物是一氧化氮(NO)。一氧化氮与肌红蛋白结合形成一氧化氮肌红蛋白复合物,赋予腌制肉特有的红色。葡萄
球菌存在于发酵剂中,它们具有的过氧化氢酶、脂酶和蛋白酶活性,可确保产品良好的风味。过氧化氢酶主
要是清除产品中因乳酸菌代谢所产生的过氧化氢,过氧化氢作为强氧化剂对香肠颜色、芳香和货架期都会
产生影响。
4 结论
葡萄球菌是中国传统酸肉中的重要微生物类群之一,分离得到的 101株葡萄球菌中有 64株对新生霉
素有抗性,属腐生葡萄球菌群及相关种群。生物培养法测定到腐生型葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌
对肌原纤维蛋白有不同程度的水解能力,且经毒性实验表明其安全无毒,无致病性,可以作为肉类发酵剂的
微生物资源。来源于中国传统酸肉中的葡萄球菌蛋白酶的酶学特性和作为食品级克隆载体的分子生物学特
性还有待进一步深入研究。 (下转第 92页)
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
随后构建植物表达载体,有利于进一步揭示小叶杨抗旱分子机理,通过花粉管通道与落叶松杂交育种方法,
成功导入杂种落叶松中,通过分子检测证实 P5CS基因整合进落叶松基因组中,基因表达和功能检测证明
落叶松的抗旱能力得到了明显的提高(见另文)。从而能有效的提高树木的抗旱性,并有利于进一步揭示小
叶杨抗旱分子机理和培育树木抗旱新品种,提高树木对逆境的抵抗力,用于西部大开发,改善生态环境。
参 考 文 献
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(上接第 80页)
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