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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
依纽小单孢菌接合转移体系的构建
张国华1 洪文荣1 沈剑锋2 樊伟明2
(1福州大学生物科学与工程学院，福州 350108;2浙江震元制药有限公司，绍兴 312000)
摘 要: 以依纽小单孢菌 HP变种基因组 DNA为模板，扩增位于西索米星 3，4-双脱羟基酶基因 sisI 上下游序列的两
端同源交换臂，在两臂之间添加抗性筛选标记 ermE基因，并在该基因上游加入组成型强启动子 ermE* ，以强化筛选标记。将
该外源 DNA序列插入到质粒 pKC1139，构建重组质粒 pFD57。转化大肠杆菌 ET12567 后，经接合转移导入依纽小单孢菌中，
经抗性筛选得到两株阳性菌株，命名为 HP-I-1 和 HP-I-2。经 PCR验证和测序，结果表明，重组质粒已整合到染色体 DNA 上。
依纽小单孢菌接合转移体系的构建达到了预期目的，并实现了对该体系的优化。
关键词: DNA重组 分子遗传学 依纽小单孢菌 sisI基因
Construction of Conjugal Transfer System of
Micromonospora inyoensis
Zhang Guohua1 Hong Wenrong1 Shen Jianfeng2 Fan Weiming2
(1College of Biological Science and Technology，Fuzhou University，Fuzhou 350108;
2Zhejiang Zhenyuan Pharmaceutical Co． Ltd．，Shaoxing 312000)
Abstract: Two exchange arms，which were respectively located upstream and downstream of gene sisI encoding 3，4-double de-
hydroxylase，were amplified by PCR from Micromonospora inyoensis HP mutant genomic DNA． The marker gene ermE and constitutive
promoter ermE* was then inserted between the arms． With these fragments，we constructed pKC1139-derived vector pFD57． The re-
combinant vector was transformed to Escherichia coli ET12567 (pUZ8002) ，and then transfered to Micromonospora inyoensis HP mutant
by conjugation． Two positive transformants were selected from the plate with erythromycin，which were named as HP-I-1 and HP-I-2 re-
spectively． After PCR identification and sequencing，it confirmed that pFD57 was integrated into the chromosome of Micromonospora
inyoensis HP mutant．
Key words: DNA recombination Molecular genetics Micromonospora inyoensis sisI gene
收稿日期:2011-07-12
基金项目:国家自然科学基金项目(31070093 /30801449) ，福建省教育厅科研项目(2007F5070)
作者简介:张国华，女，硕士研究生，研究方向:生物化学和分子生物学;E-mail:guohuazhang0121@ 163． com
通讯作者:洪文荣，男，博士，教授，研究方向:微生物制药;E-mail:hongwr56@ 163． com
氨基糖苷类抗生素，如西索米星、福提米星和庆
大霉素等，抗菌谱广、杀菌完全、与 β-内酰胺等抗生
素具有较好的协同效果，是临床上广泛使用的一线
药物，但其产生菌为小单孢菌［1］。由于小单孢菌遗
传性状比较特殊，导致其分子生物学的研究远远落
后于链霉菌。随着分子生物学的迅猛发展，在基因
水平上对工业化产生菌进行改良，成为当今生物药
物研究的热点［2］。
接合转移作为一种跨属的基因转移方法，步骤
简单、操作方便且耗时短，可在一定程度上降低宿主
的限制性修饰作用，在单基因操作方面优势明
显［3］，且已在多种链霉菌中成功应用［4 － 6］，但由于缺
乏通用的基因操作系统，小单孢菌遗传操作困难，国
内外鲜有此类报道。因此，以小单孢作为研究对象
的分子遗传学研究，特别是应用性研究，少见报道，
且不易突破。
卡那霉素 B 是合成抗耐药菌药物———地贝卡
星的原料［2］，但以卡那霉素 B 为底物，需经化学法
脱去 3，4-羟基等复杂过程，才能得到地贝卡星，整
个流程污染严重、成本高、收率低。若 3，4-脱羟基
2011 年第 11 期 张国华等:依纽小单孢菌接合转移体系的构建
的关键步骤能引入生物法，则在环保、节能、效率和
降低成本等方面，无疑会得到极大的提高［7，8］。因
此，对该关键基因的研究，将地贝卡星合成关键步骤
生物化，显然具有重要的意义。
因此，本研究拟以 3，4-脱羟基酶基因为靶基
因，尝试并建立依纽小单孢菌结合转移操作体系，为
后续基因功能研究及产业化菌株改良等具有重要
意义。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株与质粒 大肠杆菌 TOP10 为基因克
隆受体菌，大肠杆菌 ET12567(pUZ8002)为接合转
移供体菌，依纽小单孢菌(Micromonospora inyoen-
sis)HP变种为接合转移受体菌;质粒 pKC1139 和
pET-30a为本实验室保存，这些菌株和质粒均为本
实验室保存。质粒 pAGe(含红霉素抗性基因 ermE
及其启动子 ermE* )由上海医药工业研究院邵雷
博士惠赠。
1. 1. 2 限制性内切酶和试剂 限制性核酸内切酶，
连接酶、Taq 酶和 DNA Marker 等均购自 TaKaRa 公
司;DNA回收试剂盒购于上海生工;其它常规试剂
参见文献［9］。
1. 1. 3 培养基和抗生素 依纽小单孢菌 HP 变
种固体培养基:麸皮 1. 2% － 1. 6%，可溶性淀粉
0. 75%，天冬素 0. 002%，MgSO4·6H2O 0. 05%，
KNO3 0. 1%，K2 HPO4 0. 03%，NaCl 0. 05%，Ca-
CO3 0. 1%，琼脂 1. 8%，pH7. 5。孢子预萌发培
养基:Difco 酵母粉 1%，Difco 酪蛋白氨基酸 1%，
CaCl2 0. 1 mol /L(需配制 5 mol /L 的原液，分开灭
菌后加到酵母膏 /酪蛋白氨基酸溶液中去)。培
养细菌的 LB 培养基、接合转移使用的 MS 固体培
养基参见文献［9］。LB 培养基中抗生素终浓度:
氨苄青霉素 100 μg /mL，安普霉素 50 μg /mL，卡
那霉素 25 μg /mL;接合转移培养基中抗生素终
浓度:红霉素 25 μg /mL，安普霉素 25 μg /mL，萘
啶酸 25 μg /mL。
1. 2 方法
1. 2. 1 抗生素敏感性试验 融化已灭菌的培养基，
待其温度降至约 45℃时，分别加入适当梯度的抗生
素。凝固后涂布依纽小单孢菌单孢子菌悬液，37℃
培养 6 d，以生长情况来确定依纽小单孢菌对各种抗
生素的敏感性。
1. 2. 2 引物设计 根据推测的小单孢菌 3，4-双
脱羟基酶基因 sisI 两端序列设计两端交换臂引物
JH1、JH2，JH3、JH4;以质粒 pAGe 的红霉素抗性基
因 ermE及 ermE* 和 pET-30a 的 T7 启动子序列为
模板，设计引物 E1 和 E2。为方便基因克隆，引物上
分别引入相应的酶切位点:
JH1:5-GAATTCTCTACCGACTGAGCCTGCG-3
(下划线为 EcoRⅠ酶切位点)
JH2:5-GGTACCTTCCTCTGAGCTGATCCGG-3
(下划线为 KpnⅠ酶切位点)
JH3:5-TCTAGAATCTCCTCGCCGGTCGTCA-3
(下划线为 XbaⅠ酶切位点)
JH4:5-AAGCTTAATTTCCGCCTTCCGAACG-3
(下划线为 Hind Ш酶切位点)
E1:5-ACTAGT TATAGTGAGTCGTATTA CAGA-
AGGTCGAACTCGCACCG-3(下划线为 SpeⅠ，方框
为 T7 启动子序列)
E2:5-TCTAGA TATAGTGAGTCGTATTA GTAC-
CAGCCCGACCCGAG-3(下划线为 XbaⅠ酶切位点，
方框为 T7 启动子序列)
1. 2. 3 外源 DNA的接合转移 大肠杆菌感受态的
制备和转化采用 CaCl2法
［9］。重组质粒需在 pUZ8002
的协助下，通过接合转移［8］从大肠杆菌 ET12567 导
入依纽小单孢菌。接合子的初筛，采用抗性筛选和
孢子 PCR［10］，复筛采用提取染色体 DNA［9］进行
PCR，并对 PCR产物的 DNA进行测序测定。
2 结果
2. 1 依纽小单孢菌对抗生素的敏感性试验
为确定接合转移系统的筛选标记，选择合适的
载体，考察了依纽小单孢菌对安普霉素、红霉素和氨
苄青霉素的敏感性。另外，为保证萘啶酸在不会杀
死依纽小单孢菌的前提下，抑制大肠杆菌的生长，获
得抗性菌株，也考察了依纽小单孢菌对萘啶酸的敏
感性，结果见表 1。
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表 1 伊纽小单孢菌 HP变种对抗生素的抗性能力
抗生素种类
浓度(μg /mL)
0 20 40 60
Ampicillin + + + + + +
Apramycin + + — — —
Erythromycin + + — — —
Nalidixicacid + + + + + + + + + + +
+ +表示大量生长;+表示少量生长;—表示不生长
2. 2 接合转移质粒 pFD57 的构建
以依纽小单孢菌染色体 DNA 为模板，JH1 和
JH2，JH3 和 JH14 为引物，分别进行 PCR，扩增得到
两端同源交换臂 sisI-jhb1 和 sisI-jhb2(图 1) ，长度分
别为 2 032 bp 和 2 047 bp。以质粒 pAGe 为模板，
E1 与 E2 为引物，扩增抗性筛选标记基因 ermE(图
1)。 sisI-jhb1、sisI-jhb2 和 ermE 分别经 pMD19-T
(TA)克隆，得到阳性质粒，依次命名为 pFD51、
pFD52 和 pFD53。pFD51 经 EcoRⅠ和 Kpn I 双酶
切，得到 sisI-jhb1 基因片段，同时与经相同酶切的
pUC19 进行酶连，得到重组子 pFD54。阳性克隆子
pFD54 再经 XbaⅠ、Hind III 进行双切，与经相同酶
切的 pFD52 进行酶连，构建得到重组子 pFD55。再
分别用 EcoRⅠ、Hind III 双酶切 pFD55，回收 sisI-
jhb1-jhb2 基因片段，该片段与经相同酶切的穿梭载
体 pKC1139 进行酶连，得到相关重组子 pFD56。Spe
Ⅰ /XbaⅠ酶切 pFD53，回收 1 711 bp片段，并将其插
入 pFD56 的 XbaⅠ位点，经筛选，最终得到穿梭载体
pFD57。pFD57 的质粒图谱见图 2，酶切验证见图 3。
M． DL50001;1． ermE;2． sisI-jhb2;3． sisI-jhb1
图 1 交换臂及抗性基因的 PCR产物电泳检测图
图 2 质粒 pFD57 图谱
M． λ-EcoT14 I digest DNA Marker;1． pFD57 /EcoR I-Hind III;
2． pFD57 /Hind III;3． pFD57 /EcoR I
图 3 重组质粒 pFD57 的酶切鉴定
2． 3 依纽小单孢菌接合转移体系的建立与优化
以经热激与预萌发的依纽小单孢菌孢子和未经
处理的成熟菌丝体分别作为接合转移的受体，选取
依纽小单孢菌固体培养基和 MS 培养基分别作为接
合转移培养基。结果显示，菌丝体未在任何一种培
养基上长出接合子，而预萌发孢子可在依纽小单孢
菌的固体培养基上长出接合子。
接合转移需建立在受体和供体接触的基础上。
依纽小单孢菌的生长速度远低于大肠杆菌
ET12567，故在两者混合接触之前，需对依纽小单孢
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2011 年第 11 期 张国华等:依纽小单孢菌接合转移体系的构建
菌进行预萌发，以缩短萌发时间，从而在细菌生长最
旺盛时进行高效接合转移。将经过 50℃热激 12
min的依纽小单孢菌菌悬液置于 37℃下分别震荡培
养 0、4、8、12 和 16 h，再与大肠杆菌混合，结果显示
受体为预萌发的孢子悬液均可获得接合子，而以 12
h获得的接合子数最多。
供体大肠杆菌 ET12567 和受体依纽小单孢菌，
混合涂布后，由于在同一平板上，会相互竞争生存资
源，故供受体比会影响接合转移的效率。本试验选
取细胞量为 108的大肠杆菌 ET12567 分别与孢子浓
度为 106 － 109的依纽小单孢菌混合。结果显示大肠
杆菌与依纽小单孢菌浓度比为 108 ∶ 108时获得的接
合子数最多。
抗生素的覆盖时间应选择在质粒转移进入依纽
小单孢菌，且抗性基因充分表达之后。若覆盖时间
太早，则质粒转移不完全。而覆盖时间太迟，由于小
单孢菌长出的幼芽已经形成比较老的菌丝，对抗生
素的敏感性显著降低，会导致假阳性菌落的出现，给
阳性筛选带来困难。试验结果证明，20 － 22 h 为抗
生素覆盖的最佳时机。
经优化，获得接合子数高的依纽小单孢菌接合
转移体系为:过夜培养的供体大肠杆菌 ET12567(带
pUZ8002 与重组质粒)转接到含相应抗生素的 LB
培养基中，37℃振荡培养。当 OD600为 0. 6 时收集菌
体，并用新鲜 LB 培养基洗涤 2 次备用。将依纽小
单孢菌孢子悬浮于 5 mL 0. 05 mol /L pH8. 0 的 TES
缓冲液中，50℃水浴热激 12 min，待其冷却至室温后
加入等体积预萌发培养基，37℃振荡培养 12 h。离
心收集孢子并重悬于适量的无菌水中，在混合器上
振荡打散孢子，按 108 ∶ 108与大肠杆菌细胞等量混
合，涂布在依纽小单孢菌平板培养基上，于 37℃培
养 20 － 22 h后，用 1 mL的无菌水(含红霉素和萘啶
酸)覆盖，使两种抗生素的终浓度分别为 25 μg /mL，
置 37℃继续培养 5 d后即可看到接合子。
2. 4 接合子的获得及验证
由于穿梭质粒 pFD57 带温敏型复制启动子，当
培养温度超过 34℃时，该游离质粒在链霉菌中不能
自我复制。因此，转化后直接置于 37℃下培养，在
平板上培养 20 h 后，覆盖红霉素和萘啶酸，长出的
菌落可能为穿梭质粒 pFD57 插入到染色体上的重
组工程菌。将筛选得到的两株阳性工程菌命名为
HP-I-1 和 HP-I-2，在含萘啶酸和红霉素的平板培养
基上经 3 次传代，彻底清除大肠杆菌 ET12567
(pUZ8002 /pFD57)。然后进行孢子 PCR初检，均可
扩增出 ermE抗性片段(图 4，第 2，3 泳道) ，而出发
菌株则无此条带(第 4 泳道) ，因此初步判定 pFD57
已整合到染色体上。而后以提取染色体 DNA 为模
板，分别以 E1 和 E2(预测扩增得到 1 711 bp 的条
带) ，JH1 和 E2(预测扩增得到 3 733 bp 的条带) ，
E1 和 JH4(预测扩增得到 3 758 bp的条带)为引物，
均可扩增到预测大小的片段(图 5，第 1，2，5，6，
9，10 泳道) ，而出发菌株在上述 3 种情况下都未扩
增出相对应片段(第 3 /7 /11 泳道)。
1． DL5000 DNA Marker;2，3．接合子的孢子 PCR;
4． M． inyoensis亲本株 PCR
图 4 亲本株和接合子的孢子 PCR验证
1 － 3． E1 /E2 为引物扩增 HP 染色体 DNA 以及重组菌
pFD57 /HP-I染色体 DNA;5 － 7． JH1 /E2 为引物扩增
HP 染色体 DNA 以及重组菌 pFD57 /HP-I 染色体
DNA;9 － 11． E2 /JH4 为引物扩增 HP 染色体 DNA 以
及重组菌 pFD57 /HP-I染色体 DNA;4，8． DL5000 DNA
Marker
图 5 接合子 HP-I-1 和 HP-I-2 的 PCR验证
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2. 5 接合子中抗性基因的表达
质粒 pFD57 整合进依纽小单孢菌的染色体后，
单交换菌株 HP-I-1 和 HP-I-2 对红霉素和安普霉素
敏感抗性均达 200 μg /mL 以上，进一步证实了筛选
标记的有效性。质粒上 aac(3)IV和 ermE基因在依
纽小单孢菌中发生了表达，赋予该菌对红霉素和安
普霉素的高抗性。
3 讨论
建立依纽小单孢菌遗传操作体系，是在分子水
平上对西索霉素产生菌的生物合成及其功能基因进
行人工控制研究的必要前提。目前对小单孢菌的遗
传操作主要基于原生质体的制备与再生，其操作步
骤繁琐，耗时耗力，且成功率低。本研究也曾尝试过
原生质体转化、原生质体融合等均未获得成功。
接合转移作为一种跨属的基因转移方法，已
广泛应用于链霉菌基因功能的研究和菌种的改
造。但国内外未见应用此法成功改造依纽小单孢
菌的报道。接合转移的成败很大程度上取决于筛
选标记是否在受体菌中实现表达［11］。合适的抗性
标记，可大大减少筛选工作量，直接影响试验效
果。鉴于安普霉素抗性基因及红霉素抗性基因普
遍应用于多种链霉菌质粒，因此本研究选择安普
霉素抗性和红霉素抗性作为筛选标记，且在红霉
素抗性基因上游引入组成型启动子 ermE* ，以增
强该基因的表达。
质粒 pFD57，以链霉菌温敏型质粒 pKC1139
为基础构建得到，既避免了整合型质粒在基因敲
除方面的不足，又克服了自杀型质粒接合转移效
率低的缺点［12，13］。pFD57 携带了来自链霉菌温和
噬菌体 ΦC31 的整合位点 attP，以及接合转移起始
位点 oriT。质粒 pUZ8002 为 RP4 衍生的，携带了
接合转移所需的转移基因 tra，可以绕开宿主的甲
基化修饰［14］。由于染色体上含同源序列，在无抗
生素选择压力的情况下，经传代培养后，部分菌株
将发生同源重组，经定向筛选，可获得敲除目的基
因的工程菌［15］。
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