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Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy and its application in glycobiology and biomolecules

同步辐射圆二色谱及其在糖生物学及生物分子中的应用


:同步辐射圆二色谱与普通圆二色谱相比,特点在于向真空紫外波段(<200 nm)拓展,以及同步辐射所提供的高强度紫外和真空紫外光源。糖的圆二色谱结构主要在200 nm以下。蛋白质和核酸在200 nm以下的真空紫外范围,也具有丰富的光谱结构。因此向真空紫外拓展,伴随新的电子跃迁,对应新的光谱结构,包含更丰富的结构信息,确定的结构种类就越多和越精确。同步辐射高强度的真空紫外光源,是获得高质量真空紫外圆二色谱数据的保证,为糖及糖蛋白、蛋白质和核酸研究,提供了溶液中结构探测新的实验方法。综述了同步辐射圆二色谱特点及其结构生物学中的应用,以及新发展的蛋白质圆二色谱数据库(PCDDB)。此外,还介绍了已对外开放的北京同步辐射实验室同步辐射圆二色谱探测,及其在蛋白质、糖和核酸研究中的应用,以及基于微流控混合芯片的亚毫秒动态探测发展。

    
关键词:同步辐射圆二色谱;蛋白质;糖生物学;核酸;微流控芯片

    
中图分类号:Q657.7; Q53   文献标志码:A

CD is widely used to determine conformation of protein,sugar and the nucleic acid . Commercial CD spectrometers generally measure only down to 200 nm due to the low intensity of lamp sources below 200nm. However, most of structure information is contained below 200nm for proteins,sugars and the nucleic acids. Synchrotron source can provide intensive vacuum ultraviolet light, thus allowing high quality data to be extended below 200 nm. In addition, SRCD measurement is usually carried out in solution phase, requiring very small amount of sample and no limit on macromolecule size. Therefore, synchrotron radiation circular dichroism (SRCD) has emerged as a powerful technique to investigating conformation of biomolecules. In this review, a brief introduction will be presented for SRCD and its application. In addition, the SRCD development at the Beijing Synchrotron Radiation Facility (BSRF) will be described with its applications in proteins, nucleic acids and sugars.

    
Key words: synchrotron radiation circular dichroism; sugar; glycoprotein; nucleic acid; microfluidic mixing chip


全 文 :第23卷 第7期
2011年7月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 7
Jul., 2011
文章编号:1004-0374(2011)07-0714-09
同步辐射圆二色谱及其在糖生物学及生物分子中的应用
张智印,陶 冶*
(中国科学院高能物理研究所,北京 100049)
摘 要:同步辐射圆二色谱与普通圆二色谱相比,特点在于向真空紫外波段 (<200 nm)拓展,以及同步辐
射所提供的高强度紫外和真空紫外光源。糖的圆二色谱结构主要在 200 nm以下。蛋白质和核酸在 200 nm
以下的真空紫外范围,也具有丰富的光谱结构。因此向真空紫外拓展,伴随新的电子跃迁,对应新的光谱
结构,包含更丰富的结构信息,确定的结构种类就越多和越精确。同步辐射高强度的真空紫外光源,是获
得高质量真空紫外圆二色谱数据的保证,为糖及糖蛋白、蛋白质和核酸研究提供了溶液中结构探测新的实
验方法。综述同步辐射圆二色谱特点及其在结构生物学中的应用,以及新发展的蛋白质圆二色谱数据库
(PCDDB)。介绍已对外开放的北京同步辐射实验室同步辐射圆二色谱探测,及其在蛋白质、糖和核酸研究
中的应用,以及基于微流控混合芯片的亚毫秒动态探测发展。
关键词:同步辐射圆二色谱;蛋白质;糖生物学;核酸;微流控芯片
中图分类号:O657.7; Q53Q5-3 文献标志码:A
Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy and its application in
glycobiology and biomolecules
ZHANG Zhi-Yin, TAO Ye*
(Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: CD is widely used to determine conformation of protein, sugar and the nucleic acid. Commercial CD
spectrometers generally measure only down to 200 nm due to the low intensity of lamp sources below 200nm.
However, most of structure information is contained below 200 nm for proteins, sugars and the nucleic acids.
Synchrotron source can provide intensive vacuum ultraviolet light, thus allowing high quality data to be extended
below 200 nm. In addition, SRCD measurement is usually carried out in solution phase, requiring very small
amount of sample and no limit on macromolecule size. Therefore, synchrotron radiation circular dichroism (SRCD)
has emerged as a powerful technique to investigating conformation of biomolecules. In this review, a brief
introduction will be presented for SRCD and its application. In addition, the SRCD development at the Beijing
Synchrotron Radiation Facility (BSRF) will be described with its applications in proteins, nucleic acids and sugars.
Key words: synchrotron radiation circular dichroism; sugar; glycoprotein; nucleic acid; microfluidic mixing chip
收稿日期:2011-06-22
基金项目:国家自然科学基金项目(20871116)
*通信作者:E-mail: taoy@ihep.ac.cn
1 同步辐射圆二色谱特点及在结构生物学中
的作用
圆二色 (circular dichroism,CD)是指样品对左
旋和右旋圆偏振光的吸收差异,CD在生物学中已
得到广泛应用 [1]。 本文所指的同步辐射圆二色谱,
是指短波拓展到真空紫外波段 (200~140 nm)的圆二
色谱探测。圆二色谱向真空紫外波段的拓展,能提
供更多结构信息。同步辐射提供的高强度真空紫
外光源,使得高质量的真空紫外波段圆二色谱探
测成为现实,因此通常将利用同步辐射光源,波
长范围主要在 260~140 nm的深紫外和真空紫外圆
张智印,等:同步辐射圆二色谱及其在糖生物学及生物分子中的应用第7期 715
二色谱探测,命名为同步辐射圆二色谱 (synchrotron
radiation circular dichroism, SRCD)。
CD在糖的结构研究中得到广泛应用 [2-3],但糖
的 CD分析较蛋白质复杂。一是糖的种类、连接方
式和空间取向的多样性决定了糖结构的复杂,导致
CD分析困难;二是糖的吸收主要在 200 nm以下,
而未取代糖的吸收都在 190 nm以下。多数功能团
对应高能电子跃迁,如 n→σ*、σ→σ*跃迁,前者
对应 ~175 nm,后者对应 ~150 nm。而普通 CD探
测基本在 200 nm以上,极大限制了 CD提供的结
构信息含量,因此向真空紫外拓展的 SRCD在糖的
结构研究中意义重大。利用糖在真空紫外波段新的
谱带,根据其位置、方向和幅度可以指示糖的种
类和构型 [4-6],区分复杂糖样品的成分。糖基化对
于蛋白质功能、折叠具有重要意义,但目前糖蛋白
中糖结构的研究尚待深入,主要原因是在许多糖蛋
白的 X射线衍射和 NMR研究中,一般将糖组分去
除,而 SRCD提供了一个研究溶液中糖蛋白糖结构
的简便方法 [7]。
向真空紫外波段拓展,除了糖类,蛋白质及核
酸研究也同样受益。PDB中 X射线晶体学和 NMR
测定的生物大分子结构数据呈指数级增长,但晶体
学必须有蛋白质晶体,而 NMR虽然可以探测溶液
状态下的结构,但对样品相对分子质量有限制,且
样品制备复杂。CD主要在溶液状态下测试样品,
同时对样品的相对分子质量也没有限制。但 CD只
能提供有限的结构信息,如能提高 CD的结构信息
含量,对 CD在蛋白质结构研究应用方面具有重要
意义。蛋白质 CD谱通常分三个区域:<250 nm的
远紫外和真空紫外区、250~300 nm的近紫外区、
300~700 nm的近紫外可见区,不同区域对应不同
的生色基团。在远紫外和真空紫外区,构成肽链的
酰胺基是最主要的生色基团,蛋白质的骨架是肽链,
因此拓展到真空紫外波段的 SRCD为了解蛋白质折
叠提供了直接探测的方法 [7]。结构信息和波长范围
紧密相关,CD到 200 nm,可以准确分辨的二级结
构数量是 2个;而到 178 nm,数量将增加为 6,可
以区分 α-螺旋、反平行 β-折叠、平行 β-折叠、β-
转角和无规卷曲 [8]。
CD对于核酸构象的判别一直起到非常重要的
作用,由于核酸的主链是糖 -磷酸基团,而糖在
190 nm有吸收,磷酸基团吸收在 175 nm[9],因此
200 nm以下有多个 CD谱峰。近年来的核苷和核苷
酸研究表明碱基在真空紫外区域比糖对谱峰贡献更
多,而且 pH和温度效应表明,真空紫外谱峰对结
构和化学环境的改变十分敏感 [10], 因此 SRCD在核
酸研究中的重要性持续受到关注。
对于真空紫外波段的光谱探测,商用 CD谱仪
采用的灯光源在其强度 200 nm以下衰减很快,因
此对于高质量的真空紫外 CD测试,商用谱仪难以
实现。同步辐射装置可以提供高强度的真空紫外光
源,从而可以获得高质量的真空紫外圆二色谱。
SRCD在蛋白质组学中已经发挥重要作用,并在糖
及糖蛋白和核酸的研究中引起关注。
2 SRCD在糖生物学及生物分子中的应用
2.1 糖及糖蛋白
单糖和寡糖 CD研究是 CD糖生物学中应用的
基础。利用 SRCD获得了 5个单糖和 5个双糖水
溶液中达 160 nm的 CD谱 (图 1)[5],多数糖在 170
左,D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、D-来苏糖都是正峰,D-半乳糖是负峰;右,麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、龙肝二糖
都是正峰,乳糖是负峰。
图1 单糖和双糖的SRCD谱[5]
生命科学 第23卷716
nm附近有强的正峰,D-半乳糖和乳糖在 ~165 nm
和 177 nm为负峰。通过去卷积进行了构型和构象
分析,获得异头 (α、β)和交叉构象 (GG、GT、TG)
的不同平衡态构象的贡献 (α-GG、α-GT、α-TG、
β-GG、β-GT和 β-TG),从而对糖的平衡态构象理
解 更 加 深 入。 糖 胺 聚 糖 (glycosaminoglycans,
GAGs)是一类具有多种生理功能的多糖,其在水溶
液中的结构和残基相关。通过 SRCD获得了水溶液
中 6个 GAGs及其单元糖的 160~240 nm CD谱 [11],
主要谱带 <200 nm (图 2),系列谱图揭示了不同功能
基团的贡献 (硫酸根、羧基、 羟甲基、乙酰胺基等 ),
为了解GAGs在溶液中的详细结构提供了重要信息。
糖蛋白也是 SRCD应用的重要领域。电压门控
钠通道 (voltage-gated sodium channel)是神经和肌肉
电信号传导的基础。钠通道干重 30%是碳水化合物,
在研究去糖基化对钠通道结构和功能影响中 [12],
SRCD表明对于有糖或无糖的通道,在 CD谱上的
差异主要是由糖的信号引起,肽链二级结构实际上
没有变化 (图 3);热变性的 SRCD研究也表明去糖
基化对通道的稳定性没有大的影响。虽然糖对于钠
通道的功能和结构不是必需的成分,但糖对通道传
导性质有调制效应。
组织损伤、炎症和感染会导致一些蛋白质的浓
度发生瞬时变化,这类蛋白称为急性期蛋白。α1-
acid glycoprotein (AGP)是主要的急性期蛋白。AGP
含有 5个多糖链,多糖占 AGP干重 40%,其结构
难以通过 X射线晶体学和 NMR获得。通过 AGP
和多糖的 SRCD,扣除 AGP中多糖的贡献,获得
肽链二级结构的准确信息,发现生物膜存在会诱导
AGP构象从富 β结构向富 α结构的转变 [13]。
2.2 蛋白质
图 4是蛋白质主要二级结构 CD特征谱,>190
左,软骨素(chondroitin)及其硫酸盐、透明质酸(hyaluronic acid)、肝素(Heparin)的SRCD谱;右,单元糖N-乙酰葡糖胺
(N-acetylglucosamine)、N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐(N-acetylgalactosamine-4-sulfate)、
葡糖醛酸(glucuronic acid)、N-乙酰乳糖胺(N-acetyllactosamine)的SRCD谱。
图2 糖胺聚糖的SRCD谱[11]
(a)原生钠离子通道(蓝)和去糖基化钠通道(红);(b)多聚乙酰神经氨酸 (colominic acid,红)和壳戊糖 (chitopentose,蓝)。
图3 钠离子通道及糖的SRCD谱[12]
张智印,等:同步辐射圆二色谱及其在糖生物学及生物分子中的应用第7期 717
nm条件下 α螺旋具有较强的谱峰,而 β片折叠具
有峰位相似但较弱的谱峰,因此 β片折叠信号常被
α螺旋所覆盖,导致 β折叠解析的准确度比 α螺旋
要低很多。但在 175 nm,β片折叠具有特征的负峰,
在光谱解析上有利于 β片折叠分析,提高分析的准
确度。PPII结构是蛋白质折叠二级结构的重要方式,
以前多被认为是无规卷曲的结构,实际是 PPII结构。
同样对于 PPII结构,200 nm以上只有一个很弱的
正峰,而在 ~195 nm有很强的负峰, 而相近波长的
α螺旋和 β片折叠是正峰。因此 SRCD对于 β类和
αβ类折叠蛋白以及富含 PPII蛋白的结构解析,具
有明显的优势 [7]。原生无规蛋白 (natively disordered
or intrinsically unfolded)日益受到关注 [14],因为这
种蛋白在信号转导、分子间作用和分子识别等方面
发挥重要作用,这类蛋白难以用晶体学或 NMR探
测。而无规结构在 CD谱结构上和 PPII结构相近,
除了没有 200 nm上的正峰,也是在 ~195 nm处有强
的负峰,因此 SRCD对于这类无规结构蛋白的解析
具有重要意义。
SRCD除了拓展到真空紫外,同时由于高强度
光源,使得 SRCD数据具有极高信噪比,能够探测
商用谱仪难以探测的细微结构变化,如蛋白质和药
物结合引起的结构变化 [15];一个典型例子是研究钠
离子通道膜外域构象 [16],利用高质量和真空紫外波
段的 SRCD数据,可以探测到二级结构 1%的变化,
阐明了膜外域结构的细微变化对通道结构和性能的
影响。
膜蛋白难以结晶,SRCD对膜蛋白研究也有独
到之处 [17]。膜蛋白体系含有脂质和去垢剂,对光强
要求很高。普通 CD探测的膜蛋白数据常有假象,
一是由于膜蛋白样品具有高散射效应,而商用 CD
谱仪探测接收角通常很小,易发生差散射,导致幅
度降低;二是由于普通 CD的光强弱,脂质和蛋白
质分子的比例 (lipid to protein ratio)较低,会导致吸
收抑制 (absorption flattening)的假象。而 SRCD可
以方便的改变探测器位置,增大收集角度,消除散
射效应;同时 lipid to protein ratio可达 2000:1以上,
避免了吸收抑制效应 [7]。除了膜蛋白,对于其他高
散射体系,如蜘蛛丝溶液到纤维变化研究 [18],
SRCD也发挥重要作用。
对于蛋白质相互作用,SRCD也能提供有价值
的信息。如羧肽酶 A与其抑制剂 Latexin抗体发生
刚性相互作用,形成复合物,虽然蛋白质的二级结
构并没有发生改变,在 190 nm以上 CD谱与各自
蛋白 CD谱加合谱没有区别,但在 190 nm以下则
有明显不同,这个不同反映了蛋白质之间相互作用
的影响,可能是复合物形成后导致的电荷传递引起 [19]。
不同方法相互补充是实验方法发展的方向。
SRCD与 X射线小角散射 (SAXS)结合,两者均是
探测溶液体系,SAXS可以提供蛋白质分子或复合
物的形状信息,而 SRCD提供折叠变化的信息,
SRCD和 SAXS联合已用于单个蛋白或复合物的二
级和三级结构的探测 [20]。
2.3 核酸
鸟嘌呤相互作用形成的四链 DNA结构 (G-
quadruaplex,G4),由于与端粒区缺陷导致的疾病
相关,近年来受到重视 [21]。G4结构是 4个鸟嘌呤
通过氢键形成的平面四边形结构。利用紫外 CD对
G4进行了广泛研究,但难以将 CD特征和 G4构象
相联系。通过 SRCD[22]发现,4链 DNA形成的平
行 G4构象在 182 nm有一个负峰,双链反平行 G4
在 190 nm有强的正峰,双链平行 G4在 189 nm有
强的正峰;而单链 DNA形成的 G4构象,则在 187
nm有特征的正峰,因而 SRCD把真空紫外 CD谱
带和 G4的结构联系起来,为分析判断 G4结构提
供了直接方法。另外对 DNA辐照损伤机理研究中,
利用 SRCD发现 190 nm激发导致 8个腺嘌呤发生
电子耦合 [23]。碱基间电子耦合对非辐射去激发过程
很重要,能将有害的激发能量分散到大的空间区域,
降低辐照损伤。
2.4 蛋白质CD分析标准数据集和蛋白质CD数据库
蛋白质 CD分析基于标准蛋白质 CD数据集,
为了发挥 SRCD短波长特点,必须有相应的短波长
红,α螺旋;蓝,β片折叠;橙,PPII螺旋。
图4 三种蛋白质主要二级结构的CD特征谱[7]
生命科学 第23卷718
标准数据集。目前已有的 SP175数据集是由 70个
可溶性蛋白 SRCD组成,波长到 175 nm [24],但可
溶蛋白的标准数据不适合膜蛋白的结构分析。最新
推出的膜蛋白标准数据集MP180 [25]含 30个膜蛋白
数据,包含了所有已知结构膜蛋白的信息;同时也
发展了可溶蛋白和膜蛋白混合的标准数据集
SMP180,包含 98个可溶蛋白和 MP180。 MP180
和 SMP180对蛋白质的结构分析将发挥重要作用。
利用 SRCD也发展了针对特殊蛋白的专门数据集,
如白内障相关蛋白组成的 CRYST175数据库由 9个
属于眼晶状体 β、γ-crystallin族蛋白的数据组成 [26]。
PDB对推动蛋白质研究起到了很大作用。参
照 PDB,一个国际合作项目——蛋白质圆二色谱数
据库 (the Protein Circular Dichroism Data Bank,PCDDB)
于 2010年正式开通 [27]。PCDDB目标是建立广泛、
系统和可靠的蛋白质圆二色谱数据库,为结构生物
学服务。数据库由 SRCD和商用 CD的数据组成,
将促进数据共享,为生物信息学和结构生物学的研
究提供基础。为保证数据的可靠性,数据上传必须
遵循一系列的规范。另外,已发展了不同 SRCD和
商用 CD数据的校正和标准化的方法 [28]。
3 北京同步辐射实验室同步辐射圆二色谱探
测及应用
3.1 北京同步辐射实验室同步辐射圆二色谱发展
同步辐射是一种高性能光源,是带电粒子加速
运动发出的电磁辐射 [29]。相对于实验室仪器的普通
光源 (如灯光源、X光管 ),同步辐射强度数量级
提高;相对于激光波长调谐范围小和不连续,同步
辐射波长调谐范围从远红外连续覆盖到硬 X射线。
因此利用同步辐射光源发展的红外到 X射线的多种
探测方法,在结构生物学研究中发挥了巨大作用,
如同步辐射 X射线蛋白质晶体学和溶液 X射线散
射。目前多个 SRCD实验站运行或在建,如英国
DIAMOND、法国 SOLEIL、美国 NSLS、丹麦
ISA、台湾 NSRRC等同步光源 SRCD实验站。
北京同步辐射实验室 4B8真空紫外光谱实验
站提供 125~360 nm的真空紫外和紫外光,强度
>1010 光子数 /秒,全年为用户提供机时。利用 4B8
的真空紫外光源,发展了先进的 SRCD探测 [30],
可以进行 140~360 nm的 SRCD探测,变温范围
4~85℃。
刀豆蛋白 (ConA)以 β折叠为主,CD信号弱。
图 5为刀豆蛋白 CD谱,表明对弱 CD信号探测有
很好的信噪比。图 6为肌红蛋白的熔化曲线,选择
192 nm监测,而普通CD通常只能选择 222 nm探测。
CD测试比较便捷,但获得可靠的高质量
SRCD数据需要在样品制备、样品测试上注意以下
几点 [8,31-32]。(1)真空紫外光通常要求真空环境,但
也可以在样品室光路中充氮气,因为氮气在这个波
段吸收很小,而且大气压环境下也方便样品装卸。(2)
虽然同步辐射提供高强度真空紫外光,为了拓展到
更短波长,降低缓冲液和样品池的吸收仍然非常重
要。SRCD所用的样品池光程通常是几个到 100微
米。随着光程缩短,蛋白质浓度随之增高。而由于
光程非常短,样品量仅需几到十余微升。样品池采
用真空紫外透过性好的石英或氟化钙 (CaF2)材料。
(3)缓冲液体系的选择要避开在深紫外和真空紫外
检测条件为7 mg/mL,0.01 mm光程,CaF2样品池,重水溶
剂。
图5 刀豆蛋白SRCD谱[30]
熔化曲线监测条件为192 nm,CD谱检测条件为7 mg/mL,0.01
mm光程,48~84℃变温。
图6 肌红蛋白的熔化曲线(大图)及SRCD谱(小图)[30]
张智印,等:同步辐射圆二色谱及其在糖生物学及生物分子中的应用第7期 719
有强吸收的成分,比如氯离子;而重水作为溶剂,
有利于更短波长拓展。
CD的数据处理 (平均、扣空白、光滑、error
bar等 )通常采用数据处理软件 CDtools,其提供
方便的前期数据处理功能 [33]。数据分析主要利用
在线 CD分析程序 DICHROWEB[34],其不仅提供
CONTIN、SELCON3、CDSSTR、K2D 等常用 CD
分析程序,还包含多种分析标准数据集,包括
SP175, 新的 MP180和 SMP180标准数据集也将
提供。
3.2 北京同步辐射实验室SRCD应用
在 4B8真空紫外光谱测试了单糖和二糖 SRCD
圆二色谱 (图 7),最短到 165 nm,结果与文献中一
致,信噪比好,表明可以开展糖和糖蛋白的 SRCD
测试。
利用变温 SRCD,研究 ATP结合蛋清溶菌酶的
淀粉样纤维化过程 (图 8)。发现在 50℃左右产生了
一个 α螺旋相对丰富和 β-片结构较少的部分展开
中间体,这个中间体更倾向于发生聚集 [35]。
原发性痛风病人体内磷酸核糖焦磷酸合成酶
1(PRS1)点突变导致其活性提高 50%,生成过量的
尿酸。通过高信噪比的 SRCD,发现点突变导致在 图9 PRS1酶野生(wt)和突变(N114S)的SRCD谱
[36]
左为重水溶液,7 µm光程,2.5 µL样品,样品分别为D-葡萄糖(紫)、D-Cellobiose(蓝)、D-乳糖(黑)、D-半乳糖(浅蓝);右为水
溶液,~2 µm光程,1.3 µL样品,样品分别为D-葡萄糖 (红)、D-麦芽糖 (绿)。样品均经24小时平衡。
图7 4B8测试的单糖及双糖SRCD谱
图8 蛋清溶菌酶(A)和ATP-蛋清溶菌酶(B)的变温SRCD谱(25~70℃)[35]
生命科学 第23卷720
190 nm和 220 nm发生很小但重要的构象变化 (图
9),结合野生型的结晶学数据,在此基础上解释了突
变导致活性增加的原因,将结晶学和 SRCD有机结
合 [36]。
为满足膜蛋白 SRCD探测的需要,4B8的探测
器和样品池距离可调节,最大接收角 ~90度。图 10
是百日咳杆菌膜蛋白 (BrKA)在探测器和样品不同
距离下探测的对比,有明显差别。
利用 SRCD还开展了 DNA和碳纳米管作用的
研究。DNA缠绕碳纳米管诱导的 CD效应,当汞离
子加入时,导致 DNA解缠绕,引起 CD信号的变
化 (图 11),以此来探测痕量 (nmol/L)重金属 Hg离
子,有望成为一种生物传感器 [37]。 利用 DNA和碳
纳米管发展的纳米探针,实现了活细胞中微量 As
离子的探测 [38]。
绿色,普通探测器设置;蓝色,大接受角探测器设置。检
测条件为0.007 mm光程,2 µL样品,27.5 mg/mL
图10 BrKA的SRCD谱
DNA缠绕单壁碳纳米管,诱导的CD效应用于Hg离子探测。
图11 DNA的SRCD谱[37]
3.3 动态SRCD发展
生物大分子结构动态探测是一直受关注的领
域。圆二色谱通常采用停流和连续流技术实现动态
探测,但死时间通常毫秒量级,且溶液消耗量大。
微流控芯片技术的发展使得快速、低消耗的动态探
测实验成为现实。微流芯片将整个生物化学实验集
成到几个平方厘米的芯片上 [39],溶液流动的微通道
是微米量级。由于微通道是微米尺度,通过水动力
聚焦混合方式或低雷诺数下的层流扩散机制,使得
溶液混合的死时间降低到 10 μs以下,而微米尺寸
的微通道,极大减少了样品的消耗。
微流控混合芯片结合同步辐射,为反应动力学
研究提供了强有力的工具。SRCD结合微流控芯片,
死时间可达 180 μs,样品消耗 <300 μL/min[40]。基
于石英微流混合芯片技术的连续流探测方法,北京
同步辐射正在发展亚毫秒的时间分辨圆二色谱探测
(图 12),将开展蛋白质折叠动力学探测,以及蛋白
质和糖相互作用的动态研究。
真空紫外波段丰富的结构信息,同步辐射高强
度的真空紫外光源,使得 SRCD在糖及糖蛋白、蛋
白质和核酸等生物分子的结构研究中发挥重要作
用。SRCD动态探测新技术的发展将提供更加丰富
张智印,等:同步辐射圆二色谱及其在糖生物学及生物分子中的应用第7期 721
的结构信息。
致谢:北京同步辐射实验室SRCD设备硬件和软
件主要由黄艳和高振华完成。感谢Prof. Wallace、
Prof. Gekko和高学云研究员同意使用他们发表的内
容。
[参 考 文 献]
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分混合,探测区不同位置对应反应过程各个瞬间。图下方为混合区细节,溶液在蛇形通道内发生充分混合。
图12 4B8 SRCD微流混合芯片设计示意图[40]
生命科学 第23卷722
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