全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 5期
2008年 10月
Vol. 20, No. 5
Oct., 2008
活性依赖的突触抑制和突触稳态的分子机制
沈华智
（美国麻省理工学院医学研究中心和大脑与认知科学系，美国）
摘　要：常规 RNA干涉或基因敲除的功能缺失手段仅仅只是简单地移除某个基因或蛋白，而这个过程
常常会掩盖磷酸化对某个特定蛋白的调节。在树突发育和突触功能活性依赖的调节过程中，突触后致
密蛋白磷酸化的机制仍然是未知的领域。突触后 Rap GTP酶激活蛋白 SPAR与 PSD95结合，可以促进
树突棘的生长并加强突触。Plk2（polo-like kinase2，也称为 Snk）是一种受突触活性诱导表达的蛋白
激酶，它可以磷酸化 SPAR，磷酸化的 SPAR 通过泛素化 -蛋白酶体途径降解，从而导致树突棘和突
触的减少。Plk2的诱导表达和随后 SPAR的降解是长时间神经活性增强过程中突触强度的稳态抑制（突
触剥落）所必需的。有趣的是，SPAR 需要被另外一种激酶 CDK5 磷酸化后才能被 Plk 2 所降解。这
种机制通过 CDK5对一部分突触进行标记，为由 Plk2-SPAR通路抑制或去除这些突触提供了可能的途
径，但其分子机制在神经退行性疾病突触丢失中的作用仍需进一步探讨。
关键词：突触稳态; Plk2; SPAR; CDK5
中图分类号：R338.1　　文献标识码：A
A molecular mechanism for activity-dependent synaptic suppression and
synaptic homeostasis
SHENG Morgan
(The Picower Institute for Learning and Memory, MIT, Cambridge, USA)
Abstract: Regulation of specific proteins by phosphorylation is usually overlooked by standard loss-of-function
approaches such as RNAi or gene knockout, which simply remove the gene or protein. Phosphorylation of
postsynaptic density proteins remains a largely unexplored mechanism in activity-dependent regulation of
dendrite development and synaptic function. The postsynaptic Rap GTPase activating protein (RapGAP) SPAR
binds to PSD-95 and it promotes spine growth and strengthens synapses. SPAR is phosphorylated by Plk2
(polo-like kinase 2; also known as Snk), a protein kinase whose expression is induced by synaptic activity.
Phosphorylation of SPAR by Plk2 leads to degradation of SPAR by the ubiquitin proteasome pathway, leading
to loss of spines and synapses. Plk2 induction and subsequent SPAR degradation is required for homeostatic
suppression (synaptic scaling) of synaptic strength during chronic heightened activity. Interestingly, SPAR
needs to be phosphorylated (primed) by another kinase (CDK5) to be degraded by Plk2. Such a mechanism
provides a potential means for CDK5 to “tag” a subset of synapses for suppression and elimination via the Plk2-
SPAR pathway. The implications for this molecular pathway in synapse loss of neurodegenerative disease will
be discussed.
Key words：synaptic homeostasis; Plk2; SPAR; CDK5
文章编号 ：1004-0374(2008)05-0676-04
收稿日期：2008-07-21
通讯作者：E-mail: msheng@mit.edu
677第5期 沈华智：活性依赖的突触抑制和突触稳态的分子机制
什么是突触稳态？突触稳态发生在几小时到几
天不等的时间段内，当神经元活性长时间持续变化
时，它们的突触强度和细胞膜兴奋性会表现出一种
补偿式的变化，从而使得放电的频率回复到最适宜
的工作范围。例如，当神经元长时间处于静息状态
时，它们的突触强度和膜兴奋性会持续增长直到放
电频率重新达到正常。当神经环路长期处于高活性
状态时，它们的突触强度和膜兴奋性则会降低至放
电频率回到正常工作范围。因此，人们普遍认为突
触稳态的可塑性保证了神经元的电活动维持在正常
范围内，从而促进了大脑回路的稳定。目前，有
关突触稳态可塑性分子机制的研究都是基于体外分
离培养的神经元，而且大量的工作都集中在神经元
静息状态时突触强度和膜的兴奋性是如何增加的。
在本文中，我们着眼于探索在更为完整的在体条件
下，神经元的高活性状态是怎样向负向补偿变化
的。显而易见，那些受神经元的电活动诱导表达的
基因和蛋白，特别是那些在抑制突触和膜兴奋性中
起作用的蛋白是合理的候选分子。
1 Plk2能够磷酸化SPAR并使其降解
Polo-like kinase 2(Plk2，也称为 serine-inducible
kinase，Snk)是一个受活性诱导产生的丝氨酸 /苏氨
酸蛋白激酶，前人原位杂交的实验结果表明，化学
诱导使得大鼠脑内 Plk2的 RNA水平增加，而在蛋
白免疫印迹实验中发现用GABAA 受体拮抗剂处理后
有明显的 Plk2蛋白被诱导产生。Plk2之所以被称为
Polo-like 激酶 2是因为其 C末端含有 polo box功能
域，这是激酶功能域并且是Plk2与其底物相互作用
的元件。其中一个可以与Plk2结合的蛋白是SPAR，
一个突触后分子，也是一种Rap/GAP(Rap GTP酶激
活蛋白)。它含有 GAP功能域以及 Actin结合功能
域，因而能与突触后骨架蛋白PSD95结合使得SPAR
进入突触后致密斑。
我们发现，Plk2可以通过它的 polo box区域与
SPAR的Actin结合域Act2结合，磷酸化SPAR并通
过泛素化 -蛋白酶体途径导致 SPAR的降解。研究
人员发现增加 Plk2的诱导表达水平时，SPAR逐渐
降解消失。介导这个过程并且可以与磷酸化的
SPAR结合的是一种 E3连接酶 β-TRCP，它是 SCF
复合体的一部分，这是一类含有 F-box 基序的蛋
白，它是参与泛素化降解过程的 SCF蛋白复合体的
经典结构，它能够特异识别磷酸化底物。通过对
F-box蛋白的筛选，最终发现 β-TRCP1和 β-TRCP2
只能在 Plk2被激活的条件下与 SPAR结合。
首先将 Plk2整合到 Sindbis病毒当中，并用这
个 Plk2-Sinbis病毒感染神经元，得到可以表达 Plk2
的神经元。可以看到在表达Plk2的神经元中看不到
任何 SPAR的免疫染色，而邻近无 Plk2表达的神经
元中则可以看到正常的 SPAR染色。显性失活的 β-
TRCP1可以阻断这种作用，所以在表达这种显性失
活蛋白的神经元中看不到 SPAR的降解，转染空载
体的阴性对照则不能抑制 SPAR的降解，所以我们
认为 TRCP是 Plk2介导的通过泛素化降解 SPAR的
E3 连接酶。
2 Plk2表达能够改变突触结构
RapGTP被认为参与了突触抑制并导致兴奋性
突触后的树突棘皱缩。Rap/GAP，可以将 RapGTP
结合形式转变为 RapGDP结合形式，或者加速这个
过程，从而抑制 Rap的功能发挥，即 Rap/GAP会
抑制 Rap，从而强化突触并促进突触生长。
SPAR使得树突棘变大，突触变强，我们的结
果还表明 SPAR还能增加突触的强度。免疫组化染
色实验表明，正常情况下，看不到任何 Plk2的表
达，这是因为电活动很低，蛋白的表达就很低，但
是用GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculine)和木
防己毒素(picrotoxin)处理 1d后，电活动增加，Plk2
被诱导表达，进入树突，并进而进入树突棘，另
外从突触后标记蛋白PSD95的免疫组化染色结果可
以看出，突触也有明显地减少，这意味着当 Plk2被
诱导表达后会影响突触的结构。有意思的是诱导出
的Plk2与它的靶蛋白SPAR和突触后标记蛋白PSD95
的分布是互补的。经过 24h的处理，Plk2被诱导表
达并且布满了整个树突，但是它的表达由近端至远
端呈梯度分布，而 SPAR的分布则正好相反，近树
突端没有表达而远端表达高，突触后标记蛋白
PSD95的分布与 SPAR类似，需要强调是 Plk2这种
由近至远的梯度分布在体外培养的神经元中至少是
在 24d后方才出现的。
3 Plk2能够调节突触强度成比例缩减
突触稳态也被称为突触成比例变化。我们记录
了体外分离培养的海马神经元的兴奋性突触后小电
流(miniature EPSC，mEPSC)的平均振幅，同时发
现如果用GABAA的拮抗剂荷包牡丹碱处理1－2d缓
慢的增加电活动，记录到的mEPSC振幅将会下降，
得到的累积频率曲线和振幅会向左偏移。当用TTX
来降低电活动时，会得到相反的结果，振幅增加。
678 生命科学 第20卷
那么Plk2是否能在振幅的这种负向变化中起作用？
首先构建 Plk2的显性失活突变体来验证这一
点，使用两个不同的隐性突变体：一个突变体的激
酶功能域失活；另外一个突变体的激酶功能域被绿
色荧光蛋白(GFP)替代。因为这两个突变体有 polo
box功能域，所以它们可以与底物相互作用，但是
不能磷酸化底物，将起到显性失活的作用。用木防
己毒素处理 48h，可以看到经过 2d的活性增加后，
对照细胞的小电流振幅左移，单独转染GFP的细胞
和对照细胞的结果类似，然而转染 PIK2 显性失活
质粒的细胞，其小电流振幅在 48h的处理后没有发
生变化，相反在累积频率分布图中还有一点右移，
但是平均值并没有显著的变化。也就是说显性失活
突变的 Plk2阻止了小电流振幅的成比例缩减。
我们还设计了针对PIK2的RNA干扰(RNAi)作为
引起其缺失功能的另一种方法。转染 Plk2 RNAi的
细胞在木防己毒素处理后，其突触强度不会变化；
但是对照的细胞突触强度则会下降。同时研究人员
还发现过量表达 Plk2能够引起细胞突触强度变弱，
转染 24h后，过量表达 Plk2细胞的小电流振幅相比
对照组下降了 35%。
4 SPAR磷酸化在 Plk2对突触强度调节中的作用
Polo box 功能域是一个蛋白质相互作用的模块，
它识别磷酸化的基序 SpSP或者是 SpTP。SPAR的
Act2功能域里有三个 SSP或者 STP的序列。简单的
说，SPAR的 1328位的丝氨酸必须被磷酸化才能被
PIK2所识别。如果将这个丝氨酸突变，SPAR不能
被磷酸化，PIK2就不能降解 SPAR。
用强力霉素(doxycycline)系统诱导表达 Plk2，
野生型的 SPAR蛋白被降解，但是 SPAR 1328位丝
氨酸突变为甘氨酸的单点突变体S1328A则不能被降
解。这个突变体除了不能被 P l k 2 降解外，拥有
SPAR其他的所有功能，因此将这个突变体转入神
经元并观测突触强度的变化。以野生型的 SPAR作
为对照，发现野生型的 SPAR 可以增加突触的强
度，但是经过木防己毒素处理 24－ 48h后，突触
强度仍然下降。然而，转染突变体 S1328A的细胞
经过木防己毒素处理后不再表现出突触强度的下降。
综上所述，Plk2和能被 Plk2降解的 SPAR蛋白
对长时间高活性状态引起的突触强度成比例缩减是
必需的。因此我们提出这样一个突触强度长时间过
活化状态下突触稳态的下调模型：神经元活性增
加，SPAR蛋白的 1328位丝氨酸被磷酸化，Plk2蛋
白感应到此变化与之结合，并磷酸化它的另一些未
知的、可被 E3连接酶组分 βTRCP识别的磷酸化位
点，从而使得 SPAR蛋白通过泛素化 -蛋白酶体途
径降解。这种蛋白的存在对于突触的功能非常有
益，因为 SPAR的降解似乎让突触下调伴随着过度
活化同步发生了。
5 CDK5参与SPAR 1328位丝氨酸的磷酸化
那么是哪一种蛋白激酶磷酸化了SPAR的1328
位的丝氨酸？细胞周期依赖性激酶 5 (cycling depen-
dent kinase 5，CDK5)被认为与此有关。CDK5和
Plk2要同时作用于 SPAR，这需要长时间的活化状
态来诱导，而且这种调节可能更多的是局部的，它
可以来自于 CDK5，也可能是 Plk2的局部调节。
为了说明 CDK5的作用，采用过量表达显性失
活的 CDK5突变体的方法，结果观察到与转染野生
型CDK5和GFP的对照组相比，表达这种突变体的
细胞拥有更大更多的树突棘，SPAR没有降解，同
时也没有观察到突触稳态的下调。
6 Plk2对于体内突触强度的稳态调节是重要的
以上所有的实验都基于组织原代分离培养，并
在标准的程序下检测到了突触稳态下调，但这显然
还不够理想，这种稳态调节在体内的生理意义，比
如在神经环路功能方面仍需了解。研究人员在实验
中采用半体内的海马脑片培养，并用药物诱导出长
时间的活化状态，即通常所说的体外癫痫模型。用
木防己毒素处理培养的海马脑片，可获得同步癫痫
样活化，说明细胞胞体在发放棘波后爆发，这一过
程可持续数小时。那么 CA1区神经元mEPSC在这
种癫痫样活化状态下会发生怎样的变化？
在整个木防己毒素处理过程中，细胞状态看起
来并未受影响，逐个分析单独的没 EPSC时，发现
突触强度在最初的6h内是增长的，但接下来它们并
没有持续增长，而是相反地回落到基线附近，说明
这种稳态调节机制需要几个小时的时间才可以被激
活。Plk2参与到这种稳态调节的另一个证据是 Plk2
的表达在木防己毒素处理时有一个随时间的累积，
这和mEPSC的时程特征是相应的。因此，在这一
过程中Plk2蛋白可能被诱导以阻止这些突触过度兴
奋。
用基因枪在培养的海马脑片CA1区的神经元上转
染显性失活的 Plk2突变体GFP-PBD，然后电生理记
录被转染上的细胞，并同时记录紧邻的未转染上的细
胞作为对照。结果发现在用木防己处理的 12－ 18h
679第5期 沈华智：活性依赖的突触抑制和突触稳态的分子机制
内，对照细胞的mEPSC幅度会有一个上升然后回
到基线的转折，但是表达GFP-PBD细胞的突触强度
则始终是在增加的，在 12－ 18h的时候它显示出与
对照组有显著性的差异。因此，Plk2对于突触强度
的下调是非常重要的。
7 体内 Plk2稳态调节的生理意义
我们认为Plk2对突触强度的下调可能与突触可
塑性有关。对照组未转染的细胞，在历经 12－ 18h
癫痫样活化之后，稳态机制保证突触强度仍在基线
水平，因此很容易诱导出突触传递的长时程增强
(LTP)，这也说明 12－ 18h的木防己毒素孵育并未
影响或削弱普通细胞 LTP的可诱导性，但是那些被
转染了显性失活突变Plk2突变体质粒的细胞则不能
诱导出 LTP。
另外一个可塑性稳态调节研究中的有趣现象是
固有膜兴奋性的改变。在对照情况下，注入一定量
的电流会产生一定数目的棘波，当用荷包牡丹碱处
理增加它的活性达一定时间，比如 24h后，会发现
注入同样量的电流只能产生很少数目的棘波，膜变
得不易兴奋了。如果阻断突触传递则会出现相反的
情况。因此，伴随突触微电流的变化，膜的兴奋
性也会随之摆动，那么 Plk2是否在此过程发挥作
用？研究人员在培养的海马脑片上发现了这种膜兴
奋性的变化。与对照组相比，1－ 18h木防己毒素
的孵育使得膜的兴奋性降低。因此，如果在细胞中
转染显性失活的 Plk2突变体时，研究人员希望看到
这种膜兴奋性的降低可以被抑制。事实也确实如
此，可以看到只用木防己毒素处理的神经元的膜兴
奋性比不加任何处理的神经元的膜兴奋性低，而转
染了显性失活Plk2突变体的神经元用木防己毒素处
理 12－ 18h，则没有显示出膜兴奋性的降低。
有趣的是，如果单纯过表达这种突变体本身而
不用药物处理的话，实验只测量到了基本的膜兴奋
性，而没有其他的作用，因此需要有细胞活性的参
与来展现Plk2的作用。最容易的解释是Plk2在没有
木防己毒素激活的状态下是不表达的。目前还不清
楚 Plk2是通过哪一种底物下调膜的兴奋性的，但我
们猜测可能是 SPAR，它是一种突触定位的蛋白，
似乎一些树突部位的离子通道更有可能，现在已有
了一些候选对象。
综上所述，Plk2通过一种极为简单的途径使
SPAR 降解，这对于分离培养神经元活性增加时
mEPSC幅度的突触稳态调节是非常重要的。在更完
整更体内的环境下，在癫痫样活化过程中，Plk2和
在分离培养的神经元时一样，可在几个小时内被诱
导表达。它对于膜兴奋性的降低是必需的，它对于
阻止突触增强的逐步上升非常关键，这与突触强度
的下调不同，但这也是一种有效的突触稳态机制，
它的意义在于可以维持突触可塑性，保证LTP及其
他形式的可塑性得以正常进行。下一步，我们将在
体内更生理的条件下来研究Plk2在各种生理活动下
是否仍然是可诱导的，并检测Plk2对于动物体环路
以及行为功能的重要性。
王　佳　李　森　侯雨华　整理