全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 1期
2008年 2月
Vol. 20, No. 1
Feb., 2008
分子生物光子学的进展
王桂英*，付 国， 徐至展
(中国科学院上海光学精密机械研究所 强场激光物理国家重点实验室，上海 201800)
摘 要：随着分子生物学和标记技术的进步，光学成像和分析有了很快的发展，无论是从理论上还是
应用上都有所突破，展现了良好的前景。本文综述了近年来在分子生物探测中光子学的情况，简介了
几种突破光学衍射极限的探测方法，着重阐明了与生化技术密切相关的荧光共振能量转移和荧光相关光
谱显微术及其在分子生物学中的应用。
关键词：光学成像和分析；生物光子学；单分子探测
中图分类号：Q63；Q7 文献标识码：A
An advance in molecular biophotonics
WANG Gui-ying*, FU Guo, XU Zhi-zhan
(State Key Laboratory of High Field Laser Physics, Shanghai Institute of Optics and Fine Mechanics, Chinese
Academy of Sciences, Shanghai 201800, China)
Abstract: Whether on theory or in applications, optical imaging and analysis have gained great progresses with
the developments of biological studies and labeling techniques and which exhibits a good prospect. Recently,
the biophotonics advances and several new ways of breaking diffraction limit on the optical imaging are
described in this paper. In particular, the progresses on the fluorescence resonance energy transfer microscopy
and fluorescence correlation spectroscopy, as well as their applications for resolving molecular biologic prob-
lem are discussed in detail.
Key words: optical imaging and analysis; biophotonics; single molecule detection
文章编号 ：1004-0374(2008)01-0014-08
收稿日期：2007-10-29； 修回日期：2007-12-09
基金项目：“973”项目 (2002BC713808) ；国家自
然科学基金委员会仪器专项(60527004)以及面上基金
(60408007)
* 通讯作者：Email：gywsiofm@mail.shcnc.ac.cn
近十年来光子作为信息的载体在生命科学发展
中发挥出它的潜力并取得迅速的进展，尤其是在活
细胞内单分子相互作用的探测中，更是发挥了光探
针无毒、无害、无损伤，甚至是非侵入的优势。
光既具有波动性也具有粒子性，人们借助于光的这
两种特性对活细胞内生物分子进行探测。利用其波
动性探测其三维结构，在空间探测精度上达到了纳
米量级；对于动力学过程的探测，在时间分辨精度
上达到了皮秒量级。这使我们能够从空间和时间上
展现生物分子活动的精彩图像。同时，通过对荧光
光谱的探测，可以得到分子结构的变化信息以及揭
示化学反应的动力学过程。光作为粒子，当其穿透
生物组织时会发生散射，通过对散射光的探测，可
以得到生物组织的结构信息。在单分子探测中光学
技术的进步不仅体现在与生物化学相结合的技术工
艺上的进步，而且在成像概念上也突破了传统Abbe
衍射极限的Raleigh标准。这个新的分辨率概念是建
立在统计光子学基础上的，它更依赖于探测到的光子
数目，同时也与物镜的数值孔径和探测波长有关[1,2] 。
随着捕获光子数目的增加，其探测分辨率可以被改
善。这种改进特别体现在荧光相关光谱( f l u or e -
1 5第 1期 王桂英，等：分子生物光子学的进展
scence correlation spertroscopy, FCS)的探测中，它
不仅具有一切高灵敏度的微光取像特点，而且充分
利用了光子统计学，提高了微弱光信息处理数据的
可靠性[3]。现在，利用下述一系列方法均可以获得
突破衍射极限的图像分辨率：(1) 利用近场光学方法
和负折射率透镜方法 [4,5]，这些方法仅局限于样品的
局部表面探测，而且相对成本很高；(2)利用已有
的点扩散知识对于数据进行去卷积运算[6] ；(3) 对于
光源进行编码整形或利用掩模制作结构光束照明[7];
(4)利用荧光的非线性相互作用[8,9] ；(5)多种超短脉冲
激光交叉激发和时间分辨取样，增加了常规方法的
自由度，因此增加了分辨率和反衬度[10] ；(6)利用
多种探测方法的组合都可以获得超分辨的图像[11] 。
除此之外，利用荧光蛋白分子之间相互作用所引
起的光谱特性的变化，例如荧光共振能量转移
(fluorescence resonace energy transfer，FRET)，可
以实现超分辨的距离估算[12]，对于相互作用分子间
距离的估算可达到 10 nm以下的精度。我们对于上
述一切超高灵敏度和高分辨率的显微术及其应用都
归结于分子生物光子学范畴。这是一个新的研究领
域，内容很多，具体到这些技术细节都是很复杂
的，而且通常是对耐光照的样品进行多次采样，为
了提高分辨率，需要尽量收集更多的光子。为了达
到单分子或单粒子的微光探测目的，光学探测显微
术的开拓不仅依赖于光学、数学、精密机械、电
子学、计算机软硬件的进步，而且也依赖于化学和
生物技术的发展，例如荧光标记物的新设计和生物
标记技术的进步。
近年来，光学成像和分析发展得很快，尤其
是在图象分析方面出现了很多成果。图 1 展示了
Moerner[13]对单分子生物光子学方面所发表文章的统
计数据，结果显示发表文章数量平均 2.2年增加一
倍。同时，相关会议也在逐年增加，这个领域正
在吸引着更多的新人参加。由于这个领域涉及的面
很广，不能一一赘述，下面仅重点介绍 FRET和
FCS这两种与生物化学技术相关、进步最快且应用
最广的光学技术的进展情况。这两种光学技术都是
分子生物学家所熟悉的技术。
1 荧光共振能量转移(FRET)
FRET和 FCS显微术都是基于荧光团的特性发
展起来的。荧光团被激发光的量子产率可以用
Jablonski图来表征，实际上它是光子在各个不同能
级跃迁时相对应的转换速率[14]。激发态的寿命是所
有辐射或非辐射弛豫速率的倒数：
τ= (1)
其中 kr 是辐射弛豫的速率；kISC系间跃迁的速
率；kbl 是光漂白的速率；kFRET 是 FRET发生时能量
转移速率。在 FRET现象中非辐射偶极矩相互作用
时产生的跃迁速率为：
kFRET=
6
0
0
1 R
Rτ
⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠ (2)
其中 τ0表示在不存在受体时供体的寿命，R0 是
Förster半径，即在发生FRET时供体发射荧光的50%
能量转移至受体时，在供体和受体之间的距离。或
许严格的讲应该是供体激发荧光能量的 5 0 % 被
FRET消耗掉时的供受体之间的距离。这个距离正
比与两者偶极矩的方向因子、供体发射光谱和受体被
激发荧光光谱的重叠程度，以及供体的量子产率。
在上述各种速率常数和激发速率了解的基础
上，通过解这个动力学方程，可得到各种状态对时
间的依赖性[15]。例如其荧光发射强度与在第一激发
态的粒子数成正比，这对于理解时间分辨光谱(寿
命)和时间相关光谱或讲荧光相关光谱术是至关重要
的。下面将介绍 FRET 的新进展。
1.1 单束激光激发的 FRET 荧光共振能量转移是
荧光蛋白作为供受体的一个短程的能量转移效应(短
程作用距离小于 10 nm，在此距离时供体激发的荧
光能量转移给受体)。在这个距离上一个荧光团通
过偶极子和偶极子之间的作用，以无辐射方式把能
量转移给另外一个荧光团，引起第二个荧光团的激
图1 单分子生物光子学方面所发表文章的统计数据[13]
用 ‘‘single molecule’’作为关键词，在 PubMed 文献库中检索
有关单分子文章的数量。
r ISC b1 FRET
1
k +k +k +k
1 6 生命科学 第 20卷
发。一旦发生了能量转移，供受体之间必然存在供
体荧光淬灭和受体荧光激活两者的相关性。这种相
关性的变化表现为荧光图像和光谱特性的变化，即
通过测量荧光共振能量随时间的变化，或者光谱的
变化都可以获得荧光蛋白分子的构像变化。FRET
现象早在 1951年已经被 Förster发现[16]， 但是长期
以来并没有显著的进展。自从绿色荧光蛋白及其变
体出现之后，FRET才成为探测研究活细胞中蛋白
分子之间相互作用的有力武器。自 20世纪 90年代
以来，利用 FRET方法解决蛋白分子构象问题所发
表的文章至少有几百篇。在2004年之后实际上该方
法的发展正在步入成熟阶段[17]。此时，FRET现象
已经发展到可以利用三种方式来进行研究，即光学
强度成像测量、光谱测量和寿命测量，在显微术方
面，从远场到近场光学显微术，从全场成像到点扫
描成像都可以获得 FRET的成像信息。我们知道利
用供体荧光寿命的测量所计算出的 FRET效率是最
可靠的，因为分子荧光的寿命并不受环境的干扰[18,
19 ]。而其他两种方法却受到了各种实验条件的干
扰，以至利用荧光强度的测量计算出的 FRET效率
存在一些问题，即使到了 1999年，Ha等[20]利用光
漂白方法只能获得溶液中 FRET效率和 γ值(供体和
受体量子产率和两个通道检测效率的比值)，遗憾
的是这些实验数据依然依赖于做实验的仪器设备参
数，不能给出精确的定量性质，这使各个实验室所
获得的 FRET有关数据缺乏相比性，其根本原因是
因为分子之间的相互作用响应是非线性的，致使
FRET的大多数激活发射指标均依赖于成像系统的光
学参数以及探测器准直度。直至Zal和Gascoigne等
[17]给出了 E-FRET 处理方法，人们在两通道探测的
基础上又发明了三通道探测法，在这里使用了一种
由 3 种滤光片组成的滤光组盒。在使受体漂白之
后，利用供、受体的相互作用数据线性地校正了成
像数据。于是定义了在 FRET成像中这个伴随着漂
白过程的矫正程序，实验证实了 E-FRET比前面处
理方法具有更大的优势。这个优势使 E-FRET方法
提供了在以FRET效率为单位的FRET成像数据的统
一表述形式。它与仪器参数无关，允许在实验室之
间对于 FRET成像数据进行定量的比较。基于这种
激活受体发射的方法，比率计量 E通过计算两个重
要的串扰项可以得到。第一项在探测通道中测量，
比较容易得到，而第二项却需要在探测通道中设备
和探测器准直程度相关的矫正因子 g， 这里涉及到
荧光的量子产率以及供体和受体的探测效率，即g随
着溶液的 pH值、温度、光学准直度和光学系统和滤
波片的性质而变化，是一个非常复杂的矫正方法。
Lee等[18]利用多束超短脉冲交替激发(ALEX- alternat-
ing laser excitation)成功地解决了这些问题。
1.2 多激光束激发的多色FRET 双色FRET解决了
很多生物分子相互作用问题，但是对于更加复杂的
生物系统需要添加第三个荧光团，则可允许三维的
测量和视见三色 FRET。这更有助于理解分子的构
象变化和动力学过程，如分子间的距离变化和溶液
中单分子的复合体相互作用的化学计量。人们利用
该方法研究了DNA的动力学问题[13,21]。
该方法受益于纳秒激光器ALEX激发模式的设
计和应用，两个同步激发的振荡器以 14.7ns的间隔
给出两束交替激发光束来激发 FRET[22]。利用这种
方法可以很方便地同时获得FRET中的相关因子g以
及 FRET效率。这些结果都以比率计量形式得到二
维直方图，比率计量 E报告了供体和受体之间的距
离，而比率 S报告了两者的化学计量。利用ALEX
可以给出供体和受体的化学计量，也可以测量其距
离，并把 FRET可用范围扩展为 0－ 100%，同时
可以探测大分子的亮度、寡聚程度以及指示大分子
配合基的相互作用度。即利用ALEX方法可以精确
测量来自扩散状态下单分子的 E，这个精确的 E是
背景、串扰和 g 矫正了的。
下面我们将说明ALEX方案如何实现在不同激
光束激发情况下，平行地获得多种所需要的相关矫
正因子 g 的数据。这需要分析仅存在供体时受体荧
光，以及供受体都存在时相互作用荧光分布的数
据。这种特殊的多次测量导致ALEX能够恢复供体
和受体相互作用时的化学计量。它可以区分仅存在
供体或受体以及都存在时的情况，因为它们都是与
g相关的，因此给出了精确的 g因子。因为这个矫
正因子g是建立在平行测量到的样品未被矫正E的数
据上的，因此使精确的E与仪器因素(激发强度和探
测器准直度)无关。在复制复合体的研究，利用
ALEX方法所测得的距离与群体 FRET所测结果一
致；且对于 DNA测量结果与理论预计结果一致；
在结构模型测量中所获得的结果与X-射线晶体谱仪
测量结果相符合。这种基于ALEX探测的结构分析
方法很适用于生物分子之间及其复合体动力学的分
析，特别是对于那些不适用于通常结构生物学方法
(如 X-射线谱仪和 NMR谱仪)的样品[22]。简言之，
1 7第 1期 王桂英，等：分子生物光子学的进展
利用两个同步激发的振荡器以纳秒间隔给出两束交
替光束激发，利用一般灰度成像方法探测获得
FR ET 的效率。第一，激发供体荧光，在其被漂
白之后，测量供体荧光的恢复；第二，测量被供
体荧光激发的受体荧光(假如它是荧光团的话)，这
是激活发射成像方法的基础；第三，供体荧光的寿
命和偏振都被 FRET的发生而改变，这些可以由荧
光寿命成像显微术来解决。
另一类 FRET的应用是针对单分子光子统计学
的蛋白折叠超快动力学，他们利用 FRET观测了一
个展开蛋白的折叠情况，全过程发生在 50ns中。在
这里展示了蛋白折叠现象上的化学动力学和借助于
表面自由能物理描述上的联系[23]。这是单分子方
法首次揭示在纳秒时间尺度上的生物分子动力学过
程 [ 2 ]。
2 荧光相关光谱显微术[24]
2.1 概念及背景简介 荧光相关光谱显微术系指对
于分子荧光物理参数瞬时细微涨落的探测及其与时
间相关处理的技术。这种涨落在一定环境温度下总
是不断发生的，通常是作为测量信号噪音处理的。
自相关分析提供了时间序列信号的自相似性，即描
述了它所携带信号持续的时间。所以支配分子动态
过程的必要信息可以通过对其引起荧光涨落信号的
时间相关图像推导出来。FCS 技术记录的荧光分子
的涨落是由于荧光分子扩散进入和逃出一个小的激
发体积形成的，其中激发体积的大小由聚焦激发激
光质量所决定 。激发体积内分子发射的荧光强度是
通过记录一个个光子获得的。假设激发光是稳定
的，则荧光强度的涨落被定义为信号时间平均值的
偏离[25]。探测这些偏离可以获得的化学和物理参数
是局部浓度、迁移率系数、结合和分离比例常数，
以及酶动力学参数。任何一种最初测量参数的改
变，例如荧光亮度和迁移率的变化都可以作为一种
反应被测量和显示。在解答活细胞中问题时，所采
用的这种非侵入方法的测量是直接的。由于这种方
法具有小于 0.5 µm的分辨率，可在活细胞区域内进
行选择性测量，对于探测受体 -配体在细胞膜上的
相互作用上是可行的。尤其是对于局部分子动力学
的观测提供了对于环境参数、pH或黏度参数的探测
途径。这种多用途的技术对于定量评估生物系统中
小分子相互作用和动力学的研究具有实际的吸引力。
下面对其研究背景作一简单的介绍。30年前
Webb 和 Coworkers等发表了严格的 FCS的计算公
式，而且发现该方法可以应用到各种情况中，在当
时就显示了可以广泛应用的潜在前景。该方法系指
突然的改变一个作用系统的热力学态，使它远离热
力学平衡态，接着研究随后的弛缓变化。相对于经
典技术而言，它包含了与实际环境相互作用下所进
行的能量交换，即需要 FCS探测和对相关光谱微小
起伏的弛缓分析[24]。为了抽取同一类型的动力学信
息，甚至可以在有限温度下对任何固有热力学平衡
系统的最小波动来进行分析。该方法的突破发生在
20世纪 90年代，Rigler等[26]利用共焦扫描显微术
(CFOM)上的 FCS达到了单分子级，并获得了梦想
的信噪比。
FCS的理论简述如下：若激发光是稳定的，则
荧光强度的涨落，即随时间 t变化的荧光起伏自相
关函数定义为信号时间平均值的偏离：
δFi (t)=Fi (t)-〈Fi (t)〉 (1)
0
1 ( )
T
iF f dtT ∫ (2)
归一化的自相关函数定义为：
Gii(τ)=< δFi (t) δFi (t +τ)/< Fi(t)>2 (3)
荧光起伏 δFi (t)=Fi(t)-
平上的与各种物理参数，例如全部荧光发光效率以
及激发光强度的空间分布等有关的任意过程引发来
的荧光起伏。假如这种起伏仅仅是由于浓度变化
(所谓数量起伏)引起的，则第 i个样品导致的 3D扩
散自相关函数可以表示为：
Gii(τ)= veff1−
这里 τd , i= Dr 4
2
0 定义为分子 i 在有效体积元
(v=π3/2 20r z0)中平均横向扩散时间[27]。r0 是激发光横
向束腰半径， z0 是激光强度下降到最大值 1/ e时的
纵向距离。在已知Veff之后，这个扩散系数可以很
容易地由相关函数特征衰减时间 τd,i推导出来。像
方程 4 的第一项因子就是聚焦体积内平均粒子数的
倒数。因此，在获得 r0和 z0 后， 荧光分子的局部
浓度就可以由自相关函数的幅度 G(0)精确得到：
G(0) =1/
1
.
1
GV
C
CV effeff
>=<⇔>< (5)
在已知体积 Veff之后，扩散系数可从上面提到
的相关函数的特征延迟时间 τd,i 表达式中得到。
1 8 生命科学 第 20卷
2.2 荧光双色交叉相关(fluorescence dual-color cross-
correlation，FCCS)[28] 利用
关系，可以从高精度测量得到的振幅相关曲线来确
定荧光分子的局部浓度。对于球状粒子的近似，可
以通过Stokes-Einstein方程推导出的扩散系数来确定
介质的局部黏度 η v，该方程是：
Di=kT/(6 πηv Rh, i) (6)
参数 T是温度，k是 Boltzmann常数，而 Rh,i是这
个分子的流体动力学半径。若 Rh,i是未知的，它需
要与在另外环境下扩散分子的Rh,i进行比较而求得。
若该粒子运动不仅仅遵循 3D扩散，或者假如
具有不同迁移率的发射粒子种类，或者对荧光信号
的不同发射特征贡献，在方程 6中的表达式变为：
GM (τ)=V 1−eff n∑ ηv
其中，(a)Mn (τ)=(1+τ/τd,n)-1(1+τ 20r /z0τ d,n)-1/2， 对
应于三维空间自由扩散。
(b) Mn (τ)=(1+τ/τd,n)-1 ，对应于两维膜上
的扩散。
(c) Mn (τ)=exp(-(τ.v/r0)2)，对应于以速度
v 的主动传输。
实际上，很多的染料系统动态的荧光性质是非
常复杂的，而且受到分子环境的影响。染料的优势
是它的可逆性导跃迁，这本来在量子机制上是被禁
止的，对于染料而言这种跃迁是允许的，因此可长
时间重复地激发三重态。这样即导致了重复性的快
速荧光间歇式的发射，导致了在快速时间相关曲线
上的一个附加肩膀。因此来自方程 7的迁移率相关
曲线GMT (τ)添加一个随 t变化的指数衰减项，
GMT (τ)= GM (τ)(1-T+Te-t/Tτ ) (8)
方程(8)可描述分子体系内部和分子间的反应，
这种反应所产生的起伏在时间尺度上比迁移数目的
起伏要快很多。假如分子的扩散系数保持不变，则
全部的相关曲线由反应项和迁移率项的乘积给出[21] ：
Gtot(τ)=χ(τ) GM(τ ) (9)
考虑到在荧光态B和全部暗态D之间的可逆性
跃迁，即 B
AD
AB
→
←
D ， 这与应用在方程(8) 对三重态的
描述具有相同的函数形式。因此具有弛豫时间 τF=
(KD+KB)和作为分子暗态的平均部分为 F=KD/(KD
+KB)， 即分子花费在暗态的时间为χ (τ)=(1-F+Fe-t/Tτ)。
1994年，Eigen Rigler为了改进测量精度，引
进了从双标记的分子团中分离出单标记分子反应离
析物，以便区分过多的无反应的单分子标记样品，
因而增加了探测的可靠性。1997年由 Schwille在两
种分别标记寡核酸的杂交反应中成功地实现了这种
方法[28,29]。在 2000年时，Heinze 报道他们利用光
子交叉相关监测了一个DNA和酶作用物的分裂。
2.3 双光子相关以及交叉相关 共焦扫描显微镜的
一个主要缺点是利用像面上的小孔完成了纵向高分
辨率的探测，但仍避免不了处于焦面上的被激发单
分子损伤和荧光可能发生的漂白。Denk等演示了双
光子激发可以用短激光激发并扫描成像，这样既避
免了小孔对成像系统的制约，又避免了共焦扫描显
微镜中焦点附近的光子损伤。因此这种显微术很适
用于活细胞探测。对于细胞内的 FCS采用双光子激
发实验已经报道了它的优点。与单光子 FCS相比
较，双光子激发在获得同样的信号水平上而减小了
照明区的光子漂白，因此可以较长时间的捕获数
据。应该指出的是双光子跃迁到激发态是对称禁止
的，而且此呈现出不同的选择定则和振动偶合。所
以很多荧光团的双光子激发光谱与两次激发的单光
子光谱具有很大的不同(这两次激发的单光子光谱和
一次激发的在荧光性质上没有什么变化)。这能够
使人们找到最佳的双光子激发条件，这样人们即可
对于不同染料进行冗长的且瞬时的激发。人们已经
使用色氨酸蛋白来探测其本身的双光子激发荧光。
这个实验装置相对共焦显微镜来讲是简单的，它不
需要小孔，因为荧光在激发荧光强度上的二次方的
关系，还有有效体积元和扩散时间变化两者的关
系。
2.4 FCS和 FCCS的应用 自 20世纪 90年代以后，
FCS不仅开辟了 FCCS等新途径，而且解决了若干
分子生物学的问题，在这里不作详述，仅列表说明
主要的应用。
由表 1可以看出这些应用的起步是很早的，很
多成果已经从 20世纪 90年代就开始形成，更有甚
者，在 1978年Magde等[30]即利用 FCS研究了聚合
体的主动输运问题。在这里特别给出利用 FCS方法
探测荧光迁移率的结果，由图 2我们看出荧光迁移
率的大小明显地依赖于环境。例如，在水缓冲液中
和在血清中大的被标记的受体，其曲线上的时间之
半可以差几个量级。利用方程(7) 可以计算时间衰
减曲线再计算相应的扩散系数，在水中其染料的扩
散系数是 3×10-6 cm2/s， 而在细胞膜上对于体积大
的受体是在 10-10cm2/s的量级。
关于 浓度和聚集度的测量，由方程 4可以证明
1 9第 1期 王桂英，等：分子生物光子学的进展
G(0)等于有效体积元Veff中分子数的倒数。假如知道
焦体体积的话，原则上可以精确地计算绝对局部浓
度。对于一些研究而言，知道这个相对的数目已经
足够了。例如，Kinjo 和Nashimura利用 FCS 和荧
光标记具有三种约束酶(HaeIII、Hgal、BsmAI)成份
的DNA碎片中的数目。基于这个研究他们建议FCS
可以用于寻找DNA序列中的遗传区别。在分子间相
互作用的研究中，若扩散系数的变化足够大，则关
联和去关联作用都可能伴随着发生。假如扩散系数
的变化从 1到 2倍，这样就能充分地利用 FCS区分
粒子，则人们即可以通过 Stokes-Einstein关系式来
估计氢动力学半径。以均匀的球形近似表达粒子，
并以分子重量的立方根来标定氢半径。因此，一个
完整的蛋白需要增加 8倍质量，才能追随它的关联
过程。尽管这是有吸引力的，但这个也只能应用于
少数有限几个可能的作用系统。Bismuto 等[31]研究
了ANS与自然的和部分折叠的金枪鱼 tuna 脱辅基
红蛋白(apomyoglobin)捆绑问题。但不幸的是这个
智能探针不能用在双分子反应中。对于这个困惑问
题解决的方案是双色交叉相关测量。虽然所需要的
设备昂贵，并存在第二个激光和探测器以及校准的
诸多困难，但是这个方法是有更多用处的，是一个
更好的万能工具，而且数据分析也是相当简单。现
在最重要的参数是交叉相关振幅，可以对穿过焦体
截面扩散的双标记粒子浓度直接进行测量。
FCS不仅可以应用到分子的运动，而且可以评
价各种构象变化。粒子在一个黏度为ηv的水溶液中
的扩散系数由 Stokes-Einstein 关系式给出[Eq.(6)]。
扩散系数的变化不仅是由于化学反应所导致，而且
任何现象所导致的流体力学直径(hydrodynamic
radius)的变化 Rh都可以引起这个扩散系数的变化。
就这三维的结构来讲，蛋白的形状也影响它的迁移
表1 FCS和FCCS的生物学应用
序号 生物学问题 方法 时间(年) 参考文献
1 浓度和分子聚集的测量 FCS 1999 [27]
2 迁移率分析 FCS 2000 [24]
3 受限反常扩散 FCS 1990, 1993, 1999 [35, 36, 37]
4 主动传输现象 FCS 1978 [30]
5 构象变化 FCS 2002 [32]
6 探测分子微环境的细胞间动力学 FCS 2000, 2001 [24, 38]
7 分子间相互作用的研究 FCCS 2001, 2007 [31, 39]
8 活细胞内的测量 FCS, FCCS 2006, 1999 [34, 40]
9 酶活性的直接监测 FCCS 2005, 2007 [25, 39]
10 脱辅基红蛋白均衡结构起伏动力学研究 FCCS 2007 [39]
11 膜的慢动力学过程 FCS 1999 [40]
图2 在不同分子环境中所测量到的迁移率自相关曲线[24]
在不同的媒质中分子迁移率的变化相差几个数量级。在水缓冲液中扩散系数为 3×10-6 cm2/s。而在细胞膜上大受体的迁移率
急剧降低。文献[24 ]中所测的的扩散系数比在水中降低了 4个量级。
2 0 生命科学 第 20卷
率。Kim等[32]利用 FCS 和 FRET联合技术解决了不
动的 RNA 三螺旋交叉点的探测。其 Rh通常对于球
形的比长形分子小，因此可以用来确定蛋白的折叠
状态。随着改性蛋白扩散系数的变化，其扩散时间
也在变化。
3 结语
FRET 和 FCS的确是一种具有统计意义即可信
度很高的很灵敏度的非侵入万能技术。它们既适合
于离体也适合于活体系统探测。 特别是双光子FCS
在研究活细胞过程中已经证明是非常适用的工具，
因为这种技术增强了灵敏度和空间分辨率，而且消
除了在离焦区的光损伤效应[24]。已经证明在有限的
细胞区域，双光子比单光子减少了光漂白效应，因
此允许较长时间的单次采样。对于未来，活细胞和
组织的常规测量会是以单分子灵敏度完成的，这种
观点是应该可以接受的，因为对于集群分子行为的
探测，由于进行了空间和时间的平均而掩盖了独立
分子的个性以及环境异质性的影响。因此活细胞中
单分子的探测是今后研究的主要方向。
但是单个荧光光子在室温下常常会发生淬灭，
从而限制了所能获得的光子的总量子产率；荧光光
谱受环境影响大而且应用的染料具有毒性，因此有
时无法提供单个分子结构或吸附的细致信息。由于
分子振动频率对分子结构极其敏感，所以分子振动光
谱(红外光谱和喇曼光谱)成为分子鉴别的有力工具[33]。
将振动光谱和显微镜结合，在不用标记的情况下，
可以获得亚微米尺度的分子分布状况，所以对自身
不发荧光或不便标记的样品，可以使用分子振动光
谱作为成像工具，同时可以获得分子振动的详细信
息。但是，生物样品中的水对红外光谱有强烈的吸
收，加上长波长带来的较低的空间分辨率，限制了
红外光谱在分子生物学观测中的应用。于是人们对
于单分子共焦喇曼散射成像技术寄予厚望[33,34]。
单分子成像在方法学上和应用上近来的进展给
人以深刻印象，而且对于单分子数据在理论解释和
分析上也有了惊人的进步。活细胞单分子的探测研
究给出了自然状态下的分子行为的再现和定量的数
据。在 2006年一次活细胞中的成像前沿会议上指
出，这种成像技术目前已经转变为多学科联合的新
探索科学[34]。通过本篇的简介，人们有望初步认同
这种看法。
致谢：感谢中国人民解放军第二军医大学陈宜张院
士提供的参考资料。
[参 考 文 献]
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撤稿声明
我是《生命科学》杂志 2004年第 16卷第三期“禾谷类作物胚乳的淀粉合成”一文的通讯作者赵
心爱。
当初我们看到 2003年发表在 Current Opinion in Plant Biology上的一篇综述“Starch synthesis in the
cereal endosperm”，感到这是一篇内容新颖且介绍全面的好文章，可以翻译成中文介绍给国内读者。于
是，在没有得到原作者授权的情况下，我们对文章进行了翻译，并署名作为自己的文章发表在《生命科
学》上。当时我们并未意识到这是一种抄袭行为。后有读者指出，并由编辑部和院领导转告，现在我
已经充分认识到错误的严重性。
我的行为是对原文作者Martha G James等的不尊重，同时也给《生命科学》杂志带来了负面影响，
在此我表示最诚挚的歉意，并恳请撤销这篇文章。
本文所有作者同意上述内容属实，并向原文作者、《生命科学》编辑部及广大读者表示最诚挚的歉
意，同意该文的撤稿。
赵心爱
2008年 1月 17日