全 文 ：第25卷 第10期
2013年10月
Vol. 25, No. 10
Oct., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)10-0993-07
DNA合成技术及应用
王　霞，赵　鹃，李炳志*，程景胜，元英进
(天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室，天津 300072)
摘　要：DNA从头合成技术是指以寡核苷酸链为起始的合成 DNA片段的技术，其不断进步是合成生物学
快速发展的基石之一。常规使用的连接介导的 DNA合成技术和 PCR介导的 DNA合成技术日益成熟，精
确合成长度已经达到 0.5~1 kb。微阵列介导的 DNA合成技术不断发展，其低成本、高通量的特点吸引了人
们的注意；而酵母体内 DNA合成技术的成功探索也为体外 DNA合成提供了一种补偿方法。DNA合成在
优化密码子用于异源表达、构建异源代谢途径、合成人工基因组以及合成减毒病毒用于疫苗研制等方面有
广泛应用。综述了 DNA从头合成技术的研究进展，并介绍了 DNA合成的前沿应用。
关键词：DNA从头合成；基因组合成；合成生物学
中图分类号：O621.3；Q812 文献标志码：A
DNA synthesis methods and applications
WANG Xia, ZHAO Juan, LI Bing-Zhi*, CHENG Jing-Sheng, YUAN Ying-Jin
(Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, School of Chemical Engineering
and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)
Abstract: De novo DNA synthesis technologies refer to synthesizing DNA fragments from oligonucleotides. The
improvement of DNA synthesis technologies is one of the reasons for the rapid development of synthetic biology.
The traditional ligation-mediated DNA synthesis and PCR-mediated DNA synthesis are increasingly mature, and
DNA can be synthesized in length of 0.5-1 kb in accuracy using these methods. Microarray-mediated DNA
synthesis has recently attracted attention due to low cost and high throughput. The successful exploration of DNA
synthesis in yeast provides a compensation method for synthesis in vitro. DNA synthesis has been applied widely,
including codon optimization for heterologous expression, construction of heterogenous metabolic pathways,
synthesis of artificial genomes, and synthesis of attenuated artificial virus for vaccine research. Here we summarized
the research progress in de novo DNA synthesis methods and the advanced applications of DNA synthesis.
Key words: de novo DNA synthesis; genome synthesis; synthetic biology
收稿日期：2013-04-16； 修回日期：2013-05-29
基金项目：国家高技术研究发展计划(“863”计划)
(2012AA02A708 )
*通信作者：E-mail: bzli@tju.edu.cn
随着寡核苷酸链合成技术的快速发展，合成成
本不断下降，合成长度与精度不断提高，使得以寡
核苷酸链为起始的大规模 DNA合成成为可能 [1]。
从 1970年的首例人工合成基因 [2]到 2002年的合成
脊髓灰质炎病毒基因组 [3]，再到 2010年的 1.08 Mb
的蕈状支原体基因组合成 [4]等的报道，在科学家们
不懈地努力与挑战下，DNA合成能力在过去 40多
年中，发生了质的飞跃。DNA合成不仅证明了人
类创造人造生命系统的能力 [4]，而且在遗传学、分
子生物学、合成生物学等诸多领域拥有广泛应用 [5-7]。
近年来，合成生物学迅速崛起，其中遗传通路、
代谢途径等的人工构建都离不开基因合成。尤其是
异源基因的优化与表达，由于不同物种间遗传密码
子的偏好性差异，需要对原始基因序列密码子进行
修饰，这为人工合成基因技术提供了极大的应用空
间。基因组的重新设计与合成，以及由此引发的
病毒疫苗的研制，都始于 DNA从头合成 (de novo
生命科学 第25卷994
DNA synthesis)。
然而，寡核苷酸链合成长度的增加伴随着精确
度与产量的降低，限制了寡核苷酸链精确合成的长
度 [8]。一些依赖于酶促策略的 DNA合成技术被研
发出来，将相对短的寡核苷酸链拼接成长的 DNA
片段，以满足研究者日益增长的基因合成需求。常
用的两种 DNA合成技术是连接介导的 DNA合成
与 PCR介导的 DNA合成。然而，化学法合成寡核
苷酸链具有成本高、通量低的缺点，这就促使了微
阵列技术 (microarrays)的发展，微阵列介导的 DNA
合成技术也逐渐兴起。而酵母体内 DNA合成的成
功探索也为体外 DNA合成提供了一种补偿方法。
本文综述了 DNA合成技术的研究进展，并对其前
沿应用作一介绍。
1　DNA合成技术
1.1　连接介导的DNA合成
用 DNA连接酶连接寡核苷酸链形成长的基因
(表 1)，早期便出现在基因合成和某些商业化固
相基因合成平台的报道中。第一条人工合成基因，
77 bp的编码酵母丙氨酸转运 RNA的基因，1970
年由 Khorana及其同事利用 DNA连接酶合成 [2]。
随着耐热 DNA连接酶的发现和连接酶链式反应
(ligase chain reaction, LCR)的发展，基于耐热连接
酶或 LCR的 DNA组装方法越来越方便 [9-10]。耐热
连接酶的使用提高了连接温度 (50~65 ℃ )，从而减
少了二级结构的形成。
噬菌体 φX174基因组即用此法合成 [10]。5 386
bp的基因组以寡核苷酸链为起始，在 14 d内组装
成功。为了减少突变，所需的 259 条寡核苷酸
链经过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel
electrophoresis, PAGE)纯化，以减少错误长度引物
的污染，富集全长引物。LCR控制在严格的退火温
度 (55 ℃ )下，以排除错误序列的连接。连接产物
经聚合酶循环组装 (polymerase cycling assembly,
PCA)反应组装成全长基因组。合成的 DNA在电转
化进入噬菌体宿主后，恢复成完全的传染性毒粒。
连接介导的 DNA合成技术因其固有的低突变
率和相对容易的使用方法，在某些商业化基因合成
操作中占有一席之地 [11]。
1.2　PCR介导的DNA合成
19世纪 80年代中期，PCR的发明促进了依赖
于 DNA聚合酶的新的组装技术的发展 [12-13]。这些
技术以 PCR为基础，将具有重叠区域的寡核苷酸
链组装成全长的基因构件，归纳起来，有两步组装
法与一步组装法。1995年，Stemmer等 [14]第一次
用 PCA方法，将 56条 40 bp长的寡核苷酸链组装
成 1.1 kb的编码 TEM-1 β-内酰胺酶的基因片段。
以 PCR为基础的组装技术在随后的十几年中发展
迅速 [6,11]。
Boeke实验室以寡核苷酸链为起始，从头合成
酿酒酵母基因组，设计合成的 IX号染色体右臂
(synIXR)与 VI号染色体的部分左臂 (semi-synVIL)，
在酵母细胞中能够发挥功能，而且可以产生表型多
样性 [15]。他们即利用两步组装法合成 DNA小片段。
其中，设计的寡核苷酸链覆盖了 DNA片段的两条
链，相邻而方向不同的两条寡核苷酸链末端具有
20 bp左右的重叠区域，同一方向的相邻寡核苷酸
表1 连接介导的DNA合成方法与PCR介导的DNA合成方法比较
连接介导的DNA合成 PCR介导的DNA合成
基础酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶
寡核苷酸链来源 固相亚磷酰胺化学法 固相亚磷酰胺化学法
寡核苷酸链精确度 高 高
寡核苷酸链重叠区域 需要 需要
寡核苷酸链缺口 不允许 允许
寡核苷酸链总量 多 少
常用方法 LCR PCA
额外的PCR扩增 通常需要 通常需要
对重复序列或二级结构的耐受性 略高 略低
精确合成长度 0.5~1 kb 0.5~1 kb
合成突变率 略低 低
成本 略高 略低
合成通量 低 低
商业化应用 少 多
王　霞，等：DNA合成技术及应用第10期 995
链具有 20 bp左右的缺口。首先利用 PCA方法组装
得到包含全长片段在内的 DNA片段混合物，将其
作为模板，加入外侧引物后 PCR扩增得到全长
DNA片段用于克隆。测序正确的 DNA小片段后续
用于组装合成 DNA大片段。
本课题组利用 PCR介导的两步组装法，从
60~80 bp的寡核苷酸链出发，合成了 900多个长约
750 bp的 DNA片段，成功率很高。合成的 DNA
小片段随后组装成 DNA大片段，用于替换酿酒酵
母染色体。
PCR降低了 DNA合成成本，提高了生产力，
增加了可合成的 DNA分子长度。PCR介导的 DNA
合成方法是当前从寡核苷酸链起始合成所需 DNA
序列的 DNA合成技术中最常用的方法 [11]。
以寡核苷酸链为起始的 DNA合成对引物的精
度与纯度有较高要求。高质量的引物能够显著地降
低突变率，也就提高了成功率，减少修复或二次合
成的几率，降低测序成本。
对于大多数 DNA序列，连接介导的 DNA合
成性能大致等同于 PCR介导的 DNA合成。这两种
方法应用最为广泛，精确合成长度能够达到 0.5~1
kb，两者的对比见表 1[11,16]。
1.3　微阵列介导的DNA合成
固相亚磷酰胺化学法 (solid-phase phosphoramidite
chemistry)引物合成技术是过去几十年商业化 DNA
合成的最佳选择方法。受限于化学反应效率，合成
的寡核苷酸链长度一般不超过 150~200 bp[8]。该法
合成的寡核苷酸链作为原材料，用于以 DNA连接
酶或 DNA聚合酶为基础的 DNA合成技术 [11,16]。然
而，化学法引物合成因其高额的成本和有限的通量
成为合成生物学新时代大规模 DNA合成和基因组
组装项目的瓶颈。
微阵列技术作为寡核苷酸链混合群的廉价来
源，最近吸引了人们的注意。相比于化学法引物合
成，微阵列技术在通量、试剂消耗和成本上都有一
定的优势 [16]。近年来，将微阵列技术应用于 DNA
合成在质量、效率和自动化上取得了很大的进展。
在 2012年的一篇综述里对微阵列技术有较为详细
的介绍 [7]。
除了一些改善微阵列质量的策略，第二代测序
仪 (next-generation sequencing, NGS)最近被用于鉴
定无误引物序列用于 DNA片段的合成 [17]。
在提高效率上，从引物群中选择性扩增单链寡
核苷酸的方法被用于有效合成 DNA片段。Kosuri
等 [18]设计了 25万条短引物，特异性扩增所选片段，
以便用于随后的组装。之前因高 GC含量和重复序
列而很难合成的 40条单链抗体被无误组装。在区
域上划分微阵列为单独的亚阵列也是一种提高
DNA合成效率的方法，Quan等 [19]和 Saaem等 [20]
通过在一个单独的塑料芯片表面雕刻了 30个微孔
验证了这一策略。每个微孔合成一个亚阵列，用于
合成一个单独的基因构件。
微阵列技术生成的引物群提供了廉价的引物来
源，但并没有简化或降低下游 DNA合成过程的成
本。为了解决这个问题，Quan等 [19]在同一芯片单
独的微孔里整合了阵列引物合成、扩增与基因组装
步骤，当前合成长度可以达到 1 kb。整个过程在芯
片上完成，达到了增加生产量、减少回转时间与错
配的效果。这个平台可以与下游反应配合，达到小
型化、自动化的高通量合成 [7]。
1.4　酵母体内DNA合成
除了体外 DNA合成方法，Venter 研究所的
Gibson团队探索了酵母体内 DNA合成方法 (图 1)，
并取得了一定成果 [21]。
图1 酵母体内DNA合成概览及时间轴[21]
生命科学 第25卷996
为了得到正确的 DNA序列，单个酵母细胞必
须摄取所有的具有重叠区域的必需寡核苷酸链和与
末端寡核苷酸链具有重叠区域的线性化载体。之后，
这些片段需要在核内进行组装 [21]。
该方法证实了酵母体内 DNA合成的能力与可
行性。
其中，实验用到的许多寡核苷酸链与酵母基因
组序列完全同源，DNA序列的合成可以用同源重
组偏爱游离末端 DNA的缘故解释 [22]。
这种体内 DNA合成方法在周期上明显长于体
外 DNA合成方法，但是作为探索研究，有较大的
发展和利用空间，同时也可以作为体外 DNA合成
方法的补偿方法。
1.5　其他DNA合成方法
Gibson等温组装 (Gibson isothermal assembly)
方法是 Gibson团队研发的一种 DNA组装方法。组
装混合液包括 T5核酸外切酶、Phusion聚合酶和
Taq 连接酶。Gibson等 [23]为验证该方法的简单实
用性，利用此法组装合成了 16.3 kb的鼠线粒体基
因组。他们以 600条具有 20 bp重叠区域的 60 bp
寡核苷酸链起始，8条寡核苷酸链一组，组装到
pUC19载体，合成了 75条 284 bp的 DNA小片段；
测序正确后 5条 DNA小片段一组，NotI释放后组
装到 pBR322载体，合成了 15条 1.2 kb的DNA片段；
经 PCR扩增后 5条一组，SbfI消化后组装到 pSMART
载体，合成了 3条 5.6 kb的 DNA大片段；同样经
PCR扩增后，3条 DNA大片段经 AscI消化后组装
到 pCC1BAC载体，组装合成了 16.5 kb的线粒体
基因组，其中包括 221 bp的重复序列，插入的线粒
体基因组经 PmlI释放后，环化得到天然的鼠线粒
体基因组。这里从头到尾用到的组装方法都是
Gibson等温组装。也就是说，Gibson等温组装方法
不仅适用于以寡核苷酸链为起始的 DNA合成，也
适用于构建长的 DNA片段，甚至是基因组。其中，
引物设计并未顾及错配或发卡结构等，只是单纯地
按照固定长度设计，可见 Gibson等温组装方法对
DNA序列的二级结构要求很低 [23]。
虽然 Gibson等温组装方法具有快速、简便易
行等特点，但因其中酶的造价较高，在大规模使用
时，不得不将其成本考虑在内。
2　长DNA片段的合成
目前，DNA从头合成技术精确合成 DNA片段
的长度大多为 0.5~1 kb，当合成更长的 DNA片段
时则需要将 DNA小片段按顺序组装起来，这就涉
及 DNA组装技术。
由于酶切位点对 DNA序列的依赖性很强，传
统的酶切连接方法因可用的酶切位点有限，已经不
能满足研究者合成DNA大片段的需求。BioBricksTM [24]
和 BglBricks[25]利用同尾酶策略实现了酶切位点的
重复使用，但是仍不能避免对 DNA序列本身的依
赖性，而且也会在连接位置留有固定的痕迹。IIs型
限制性内切酶的开发运用解决了无痕连接问题，却依
然避免不了内切酶本质上对DNA序列的依赖性 [26-28]。
一些基于 PCR技术的 DNA组装技术可以解决
上述问题，达到无痕、非序列依赖性的效果。如基
于重叠延伸技术 (overlap extension techniques)的重
叠延伸 PCR(overlap extension PCR, OE-PCR)[29]、循
环聚合酶延伸克隆 (circular polymerase extension cloning,
CPEC)[30]等。另有基于 PCR技术的体外同源重组
技术，如 InFusionTM [31]、特异性切割尿嘧啶 (uracil-
specific excision reagent, USER)克隆 [32]以及非序列
及连接依赖性克隆 (sequence- and ligation-independent
cloning, SLIC)[33]等。
尽管基于PCR技术的DNA组装技术应用广泛，
但随着 DNA长度的增加，PCR反应效率降低、突
变率升高，导致这些方法更适用于质粒或小型途径
的构建。
为了组装更长的 DNA序列，除了体外的
Gibson等温组装方法，科学家们将注意力转移到了
体内同源重组，包括枯草芽孢杆菌 [34]、大肠杆菌 [35]
和酿酒酵母 [4,36-37]重组系统。
酿酒酵母对特别长的 DNA构件的适应性与高
超的 DNA修复机制导致的精确度，使其受到研究
者的青睐。转化辅助的重组 (transformation-assisted
recombination, TAR)方法能够将 DNA大片段在酵
母体内重组成基因组 [4,36-37]，也能够以寡核苷酸链
为起始合成 DNA片段 [21]，抑或将短的 DNA片段
组装成长的 DNA片段 [38]。可见酵母同源重组系统
的实用性。
DNA组装技术在最近的综述里有更为详细的
介绍，总结起来，分为酶切连接方法、重叠延伸方
法与同源重组方法，在不同的领域都有一定的施展
空间 [5,39]。
3　应用
DNA从头合成技术从单链寡核苷酸出发，具
有较大的灵活性，为其广泛的应用奠定了基础。
王　霞，等：DNA合成技术及应用第10期 997
3.1　密码子优化
密码子优化基因序列用于异源表达是 DNA合
成一个常规与关键的应用。在不同的生物体间，遗
传密码子使用频率变化显著。密码子偏好性是影响
原核和真核基因表达的重要因素 [40-41]。基因若要在
异源宿主中高表达，经常需要密码子优化，这已成
为标准的分子生物学操作，以克服贫乏的基因表达。
众所周知的抗虫棉，即是在棉花细胞中导入了经过
优化的苏云金芽孢杆菌杀虫基因。该蛋白专门破坏
棉铃虫等鳞翅目昆虫的消化系统，致其死亡。棉花
细胞表达杀虫蛋白，达到抗虫效果 [42]。
密码子优化不但可以根据宿主偏好性选择密码
子使用，也可以根据研究需要，通过改变密码子来
添加或去除酶切位点等，方便下游操作。从头合成
的聚酮合酶基因簇即在设计时去除了 BsaI、BbsI与
XhoI酶切位点，方便后续 DNA大片段的组装 [26]。
Stephanopoulos团队将红豆杉属的紫杉二烯合成途
径的相关基因优化成大肠杆菌偏好的密码子序列，
同时去除了部分酶切位点，用于构建下游代谢途径。
通过对大肠杆菌原有代谢途径 (上游模块 )与导入
的紫杉二烯合成途径 (下游模块 )的不断微调，达
到上下游模块的最佳平衡，将抗癌药紫杉醇前体紫
杉二烯的产量提高了 1.5万倍，达到 1 g/L[43]。
从头合成 DNA序列也可以根据研究需要加入
一些“标记”，便于筛选或后期研究，如“水
印”(watermarks)[4]、“PCR标签”(PCR tags)、对称
的 loxP位点 (LoxPsym sites)[15]等。
3.2　代谢工程
DNA合成在代谢工程领域应用广泛。通过在
宿主细胞中导入一个或多个异源基因，与宿主自身
的代谢机制相互作用，构建新的代谢系统，新的细
胞能够合成原来不能合成的产物，如化学制品、药
物等。这在工业化应用上具有广泛的前景，相比一
些成本高昂的化学合成方法，生物合成在缩短生产
周期、提高产品质量、降低生产成本以及环境友好
方面有较大优势。而 DNA合成与组装技术能够极
大地加快代谢通路的构建。前面所述的紫杉二烯合
成途径的构建即是一个例证。另外，Zhao课题组利
用 DNA组装技术，在短期内构建了多个模块途径。
通过不同的基因组合与融合蛋白表达顺序的调节，
对培养条件、菌株等进行优化，使丹参酮前体物的
产量达到 365 mg/L [44]。
密码子优化通常与代谢途径构建相结合，在合
成生物学领域极大地推动了医药、能源等相关产业
的发展。
3.3　基因组合成
随着研究者对 DNA的相关知识与技术的深入
掌握，使基因组的重新设计与合成，甚至是创造人
造生命系统成为可能。7 558 bp的脊髓灰质炎病
毒基因组 [3]、5 386 bp的 φX174噬菌体基因组 [10]、
31 656 bp的聚酮合酶基因簇 [26]、582 970 bp的生殖
支原体基因组 [36]等的陆续合成，不断冲击我们对
DNA合成能力现状的了解。而这些似乎都不及创
造人造生命系统带来的震惊。Gibson团队从头合成
与组装了 1.08 Mb的蕈状支原体基因组，当把该基
因组放入缺乏自身遗传物质的山羊支原体受体细胞
后，成功产生了人造的成活细胞 [4]。该成就标志着
合成生物学里程碑似的贡献，同时为进一步研究提
供了潜在的构架！
约翰 ·霍普金斯大学发起的人工合成酵母基因
组计划 (Sc2.0计划 )已经展开了国际合作。他们将
酿酒酵母染色体重新设计，优化基因组，减少不稳
定和冗余结构，旨在打造一个易于今后操作的人工
合成的酵母系统 [15]。至今还未有全人工合成的真核
基因组，Sc2.0计划一旦完成，必将是合成生物学
新的里程碑！全合成的基因组会有大量的酵母基因
组重建，也会为完全基于基因容量与拷贝数变更的
新型组合遗传学打开一扇门！
不同于前面所述的优化密码子使用，以达到在
异源宿主细胞高表达基因的效果，疫苗研究者运用
相反的策略，将密码子去优化，在基因组规模改变
密码子偏好性，产生成活病毒减毒性状，用于疫苗
研发。Mueller团队利用合成减毒病毒工程 (synthetic
attenuated virus engineering, SAVE)技术 [45]重新设
计了流感病毒基因组，从头合成基因组，得到了减
毒流感病毒的候选疫苗 [46]。
然而，病毒基因组工程化是一柄双刃剑。一方
面，病毒基因组较小，易于工程化操作，DNA合
成与组装技术不断发展，使得病毒基因组的重新设
计与合成经济可行，基于此的疫苗研制有很大的发
掘空间；但是另一方面，病毒的感染性也使人们担
忧潜在的生物安全问题 [47]。
4　结语与展望
在过去的 40多年中，寡核苷酸链合成取得了
突飞猛进的发展，由寡核苷酸链开始的 DNA合成
与组装技术不断改善，DNA合成精度、长度、速
度都得到极大的提高，合成 DNA 的能力也从
生命科学 第25卷998
77 bp[2]发展到 1.08 Mb[4]。DNA合成在优化异源基
因表达、代谢工程、基因组重排与工程化构建、病
毒疫苗研制等方面拥有广泛的应用。然而，目前
DNA合成技术仍存在通量低、错误率高、自动化
程度低、成本高等问题，限制了大量基因组的工程
化构建。学科间的交叉合作、新的合成策略与试剂
或酶的研发，有望加快 DNA合成进程。DNA合成
的经济化、工程化进程也必将推动合成生物学的快
速发展，其合成能力对科研与社会都将造成重大
影响！
[参　考　文　献]
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