全 文 ：第23卷 第11期
2011年11月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 11
Nov., 2011
文章编号：1004-0374(2011)11-1140-05
单分子荧光共振能量转移技术
赵永芳
(哥伦比亚大学分子识别中心，纽约 10032，美国)
摘　要：单分子荧光共振能量转移技术 (single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET)通过
检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发
展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应 (ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊
的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分
子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。
关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团
中图分类号：Q3-3；TG115.33 文献标志码：A
Single molecule fluorescence resonance energy transfer technique
ZHAO Yong-Fang
(Center for Molecular Recognition, Columbia University College of Physicians and Surgeons, New York 10032, USA)
Abstract: Single molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) method was used to detect the
conformational changes by detecting the energy transfer efficiency between donor and acceptor in single molecule.
Before the development of single molecule detection method, most of the molecular experiment was done by
ensemble averages method which lost lots of special information. Single molecule detection can analyze the single
molecule in the system, get the histogram distribution of the molecules and also analyze the kinetics of the
bimolecular reaction. This review described the recent progress of single molecule fluorescence energy transfer
technique.
Key words: single molecule; fluorescence resonance energy transfer; fluorescence fluorophore
收稿日期：2011-06-16
通信作者：E-mail: yongfangzhao@gmail.com
1　单分子荧光技术
单分子科学作为一门新兴边缘学科，给生命科
学领域研究带来了蓬勃生机，使人们能更深刻地了
解复杂的微观生命过程。单分子荧光技术在生物及
化学领域取得了惊人的发展，让实时监测单个生物
分子或分子复合物变得可行，大大扩展了对生物大
分子复杂的动力学过程的表征能力 [1-4]。
在单分子技术出现之前，分子生物学实验结果
往往只代表测量时间内大量分子的平均行为，而生
物体系一般是不均一的体系。因此，监测单个分子
的行为具有重要的意义。当单个荧光基团 (fluores-
cence fluorophore)标记到目标分子后，它能在多方
面去探测目标分子。首先，通过荧光成像技术可以
了解目标分子在细胞内的空间分布 [5-6]，也可以应
用荧光强度 [7]以及极性的变化 [2]来检测目标分子
的运动及活性情况。当一个分子或两个相互作用的
分子上标记两个不同的荧光基团后，一个是在能量
转移过程中提供能量，即供体 D (donor)；另一个接
受能量，即受体 A(acceptor)。这样可以运用荧光共
振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer,
FRET)技术 [3]来对体系进行研究。因此，比单个荧
光基团标记更具有优势，称为单分子荧光共振能量
转移 (single molecule fluorescence resonance energy transfer,
smFRET)技术。smFRET近年来迅猛的发展，在研
赵永芳：单分子荧光共振能量转移技术第11期 1141
究蛋白质折叠和构象变化 [8]、RNA折叠和催化 [9-10]、
膜融合蛋白和肌动蛋白的运动 [11-12]，以及信号转导 [4]
等方面相当有效。
荧光供体及受体之间的 FRET可以用来测量两
个荧光基团之间的距离。能量转移的效率 E，是荧
光受体的荧光强度与所有荧光强度 (受体和供体的
荧光强度之和 )的比值 [3,13]。同时，E = [1 + (R / Ro)
6 ]-1，
其中 R是荧光供体和受体之间的距离，而 Ro是 E
为 0.5时两荧光基团之间的距离 (即 Forster半径 )。
单个生物分子的构象变化就能通过 smFRET进行实
时监测。FRET技术的优点在于其用荧光强度的比
值，而不是荧光的强度，这样实验的结果不会受仪
器本身的噪声影响而强烈波动。
2　smFRET的特点
单分子技术的优势使其在生物领域受到极大的
青睐。例如在不均一的体系中，单分子技术能直接
反映分子特性的分布状态。此外，在复杂的生物化
学反应中，单分子技术能够在不同步化每一步反应
的情况下研究每一步的动态化学反应 [3,13]。
2.1　smFRET研究群体的分布状态
当单个生物分子的 FRET值确定后，可以通过
FRET 值的分布作出生物分子的统计图 [14]。这种方
法不局限于 smFRET技术，还有其他的方法也能达
到这一目的。可以假设有一个不均一的样品，包含
两个不同的群体，每一个群体有不同的 FRET值。
传统的整体稳态 FRET测量只能得到单一的 FRET
值，即整个样品的平均 FRET 值，但是它不能反映
出样品的不均一性。而 smFRET方法通过生物分子
的统计图能很直观的检测出样品的群体分布状态，
以及每一个群体的 FRET值 (图 1 A)。
2.2　smFRET研究生物分子的动力学反应
对于生物化学反应，如果想用整体 FRET来研
究动力学反应，得出反应的动力学参数，需要用各
种方法来使反应同步化，使每一个分子处于反应的
同一状态，然后在外加的因子下启动反应。如果反
应无法同步化，整体 FRET的方法就无法对反应的
动力学进行研究。但是 smFRET并不受生物化学反
应同步化的限制 (图 1B)。同时 smFRET还能探测到
稀有的构象变化以及非富集中间产物的形成 [15]。这
些是很难用整体 FRET检测到的。
3　smFRET的实验设计
smFRET 技术的发展与相关领域的发展是分不
开的，长期以来由于信噪比太低，使 smFRET 技术
不能广泛地应用。最近 20年来，由于在显微技术、
荧光染料以及照相技术上突破性的发展，使得
smFRET 得到迅猛的发展。首先，全内反射荧光显
微镜 (total internal reflection fluores-cence microscope,
TIRFM)[16-17]以及减少激发体积的显微技术 (运用共
聚焦或双光子显微镜 )[18-19]的发展，使背景噪声降
到最低，大大提高了信噪比；其次，人们对荧光染
料的改进，使得荧光染料的亮度及光学稳定性得到
极大的提高；再次，低温电荷耦合器 (charge coupled
devices, CCD)取得突破性的进展，在提高量子效率
的同时，还提高时间分辨率，使其达到毫秒级别。
显微镜的物镜 (高数值孔径 (NA)，高放大率，低像
差 )及激光技术 (高稳定性，多个波长 )的发展也
推动了 smFRET的发展。
3.1　用于单分子荧光的染料
运用于单分子荧光技术的染料需具备以下几个
条件 [3]：(1)光稳定；(2)亮度高 (高消光系数及高
发射量子效率 )；(3)低荧光强度波动性 (至少在所
研究的生物事件的时间分辨范围内，荧光强度的波
动小 )；(4)激发波长及发射波长在可见光的波长范
A, LeuT在无Na+的条件下，smFRET能检测出两个FRET的
峰，而整体FRET的方法只能得到平均的FRET值(虚线)；B,
smFRET能检测到单个LeuT分子构象间的转化，进而得到分
子动力学参数，这些信息很难应用整体FRET的方法得到。
图1 smFRET能检测不同的构象
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围内；(5)容易获得，可以方便购买，并对生物分
子进行标记。另外，适合 smFRET的一对荧光基团
还需具备以下的性质：(1)光谱重叠低，这样能降
低供体的发射波长与受体的发射波长的重叠，同时
也能减少受体直接受激光的激发；(2)供体和受体
的发射量子效率具有可比性。第二个条件能保证在
FRET值变化的时候供体和受体的荧光强度的反相
关性。
荧光蛋白 [20-22]、有机染料 [13,23]以及半导体量
子点 [24-25]在单分子荧光技术上均有应用。荧光蛋白
具有较低的光稳定性，在单分子技术上它的应用不
如有机染料广泛。有机染料由于其相对分子质量小，
光稳定性强，以及多种形式的有机染料可以很容易
购得 (例如 Cyanine系列的染料可以从 GE Heal-
thcare购得 )，因此其应用最为广泛。其中，长期以
来一直广泛应用的是 Cyanine染料系列中的 Cy3及
Cy5。 半导体量子点也可作为荧光的供体用于单分
子荧光技术上。目前商品化的半导体量子点的直径
大于 20 nm，远大于有机荧光染料分子 (直径小于
1 nm)。如此大的体积，使其在 smFRET中检测生
物分子的构象变化上不够灵敏。 另外，单官能的半
导体量子点目前尚未商品化。但是 Jacob Piehler实
验室 [25]及 Alice Y Ting实验室 [26]报道了单官能的
半导体量子点的制备及在单分子荧光技术上的应
用。由于其光稳定性远强于荧光蛋白及有机荧光染
料，半导体量子点作为一种新型的荧光探针正越来
越广泛地被采用。
3.2　样品的制备及单分子的检测
单分子荧光 FRET可通过激光共聚焦显微镜及
全内反射荧光显微镜来实现。对于激光共聚焦显微
镜，通过高数值孔径物镜来聚焦激光，有效地减少
了激发体积。因此，背景信号很低，可以满足单分
子荧光的检测。激光共聚焦显微镜可用于表面固定
化的生物分子，同时也可用于自由扩散的生物分子
的单分子检测。其通常运用迅速灵敏的点检测器来
收集光子信号，如雪崩光电二极管，可以达到皮秒
级的时间分辨率。目前已有商品化的用于单分子荧
光技术的激光共聚焦显微镜，如 PicoQuant公司的
MicroTime 200。激光共聚焦显微镜 [27-28]在检测荧
光分子之间距离的群体分布上非常适用。如果需要
监测单个分子的构象在毫秒到分钟范围内变化时，
通常运用全内反射荧光显微镜来观察表面固定化的
生物分子以达到高通量的样品监测。
使用广视野检测的全内反射荧光显微镜在单分
子应用中更为广泛。光通过棱镜或高数值孔径物镜
进行全反射后产生激发渐逝场，能选择性地激发靠
近固定化表面的分子 (~100 nm)。因此，降低了背
景信号。在检测表面固定化的生物分子或追踪分子
的横向运动上，全内反射荧光显微镜是理想的选择，
其通常选择使用电荷耦合器件 (CCD)作为探测器的
摄影机来收集信号，这样可以同步监测数构象的变
化并达到毫秒级的分辨率 [29-30]。
现在有多种商品化的荧光染料，使得生物分子
的标记大大简单化，如对于核酸分子的标记，含有
亚磷酰胺基团的染料能很容易地在核酸合成的过程
中标记核酸分子；也可以用氨基反应性的染料标记
核酸合成过程中产生的氨基，然后通过分子筛、高
效液相色谱或凝胶电泳将染料标记的核酸分子与游
离的染料及无染料标记的核酸分子分开。由于赖氨
酸在蛋白质表面的富集性，通常使用氨基反应性的
染料对蛋白质或抗体进行标记。对于大多数蛋白，
由于表面含有多个赖氨酸，此方法对于位点特异性
的标记并不可行，此时可以选择半胱氨酸。半胱氨
酸在蛋白质表面并不常见，可以使用巯基反应性的
染料对蛋白进行位点特异性地标记。
如果要较长时间使用 smFRET技术观察生物
分子的构象变化，生物分子需要表面固定化。不
恰当的固定方式会影响分子的性质。链霉亲和素
(streptavidin)和生物素 (biotin)具有很强的亲和性，通
常利用它们之间的相互作用来特异性地固定样品 [31]。
例如生物素化的牛血清白蛋白可吸附在玻璃或石英
的表面，然后通过多价的链霉亲和素来结合并固定
生物素化的荧光标记的核酸分子。对于蛋白质的固
定，通常使用钝化剂 (如聚乙二醇 )来抑制蛋白质
非特异性地结合到玻璃或石英的表面。对于 His-
Tag蛋白的固定，可以采用螯合的 Ni2+或 Cu2+，但
是有些情况下需要在 His-Tag和蛋白质之间加一段
链接以保证固定后的蛋白具有合适的取向 [15]。
在 smFRET技术中，来自供体的发射光容易泄
露到受体探测器上 (或受体的发射光泄露到供体探
测器上 )，因此降低干扰对优化分辨率极其重要。
由于荧光发射光谱的不对称性，因此具有长波长拖
尾现象，泄露到受体探测器上的来自供体的发射光
尤其不可忽略。仅荧光供体或荧光受体标记的分子
可以用来校正探测的干扰。如果用供体的激发波长
来激发只有荧光供体或荧光受体标记的分子，可以
确定泄露到受体监测器上的来自供体的发射光，也
可以检测到被供体的激发光激发的受体。如果用受
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体的激发光来激发只有受体标记的分子，可以检测
到泄露到供体监测器上的来自受体的发射光。
3.3　数据处理
为了保证所选择的信号来自真正的荧光分子而
不是来自背景信号，在对 smFRET信号筛选时，通
常需要设定多个参数 [15]。如分子具有单个光褪色步
骤，信噪比大于 8:1，供体的荧光闪烁少，供体对
受体的皮尔逊相关系数小于 0.5，同时荧光分子的
寿命长于 15时帧，并且分子的 FRET值大于 0.15。
标记分子的 FRET值随时间变化，通常被解释
成荧光供体和受体间的距离的变化及标记分子构象
的变化。这是基于在数据采集的时间刻度范围内，
荧光基团能自由旋转 (荧光基团的取向因子 K2=2/3)
及荧光的量子产率在数据收集过程中稳定。
用实验的方法测量荧光基团的取向因子 K2比
较困难，因此通常不用 FRET值来测定绝对距离，
而是用 smFRET来反映分子动态的变化即相对距离
的变化。FRET的变化可能来自分子构象的变化，
也可能是由于荧光基团与标记分子间的相互作用。
通常可以用以下两个对照实验来排除构象变化外的
其他因素导致的 FRET的变化 [3,13]。首先，用整体
平均的方法测量荧光的各向异性。如果荧光的各向
异性值很低，表明荧光基团与标记的分子间的作用
较弱，荧光基团的旋转比较自由。此方法不能排除
荧光基团与标记分子间短暂的相互作用，该相互作
用可以通过测量固定化的单个荧光分子的各向异性
来排除。另外一种对照实验是通过改变实验的生物
学参数来确定观察到的FRET的变化的生物学来源，
如在蛋白质的构象变化试验中，如果 FRET的变化
与蛋白的底物相关，与功能相关的单位点突变也影
响 FRET的变化，这说明所观察到的 FRET的变化
具有生物学意义 [15]。
4　结语及展望
应用全内反射荧光显微镜进行单分子或 smFRET
的研究，在生物领域取得了巨大的进展，使人们对
有些生物过程有了更深入的了解。活细胞水平单分
子的研究能使人们深入理解细胞膜上膜蛋白的动态
变化，膜蛋白与其他蛋白间的相互作用，以及膜蛋
白的生物调控等问题。未来随着探针的改进及数据
分析的改进，该领域会有突飞猛进的发展。
[参　考　文　献]
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