全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 1期
2008年 2月
Vol. 20, No. 1
Feb., 2008
细胞膜表面单分子事件的实时观察
张筱敏，邱　爽，罗建红*
（浙江大学医学院，杭州 3 1 0 0 5 8）
摘　要：单分子实时检测以高分辨率显微镜及纳米操作技术为支撑，实现在微观世界单分子水平探索
和阐明生命现象的本质，进而展现生命科学的全景。本文综述了近年来单分子成像和检测领域的技术
进展，以及将这些技术和创新方法在活细胞膜表面单分子事件研究中的应用，如蛋白质扩散、蛋白折
叠动力学、膜受体装配及近膜区囊泡运动等。
关键词：单分子事件；成像；检测；细胞膜
中图分类号：Q2 -3 3　　文献标识码：A
Visualization of single-molecule event on cell membrane
ZHANG Xiao-min, QIU Shuang, LUO Jian-hong*
(Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310058, China)
Abstract: Based on high-resolution microscopy and nano-manipulation techniques, single molecule detection
allows us to explore and illustrate life phenomenon from microscopic view, and to better understanding of the
panorama of life sciences. We reviewed here the technique advances in single molecule visualization and
detection, and as well as the application of these techniques and creative research mathods in single molecular
events on cell membrane, such as membrane protein diffusion, protein unfolding kinetics, assembly of receptors,
vesicle movement and so on.
Key words: single molecule events; visulization; detection; cell membrane
文章编号 ：1004-0374(2008)01-0029-10
相对而言，传统的在集团(assembly)层面对生
命系统的研究是在观察考证宏观现象的基础上对生
命活动进行阐释，而新近发展起来的对单分子的实
时、视见及纳米操作的研究则是对宏观表象的本质
进行直接的探索。集团层面的研究，使得科学家在
众多“为什么”面前，只能用“推测”来回答，
用众多间接的方法来加以佐证：因为大部分有机分
子集团都存在静态不整和动态不整。集团层次所体
现出的特征，是其内部分子的异质性在平衡状态时
的宏观表现。因此，集团层次的研究，轻易掩盖
了许多事实真相，如忽略了细胞内局部微环境对目
标分子的影响；平均化掩盖了静态不整带来的差
异；许多时候需要对目标分子进行人为同步化等
等。集团层次的研究固然为我们带来了丰富的研究
成果，然而它所具有的局限性是科学家必须要克服
的一大障碍。随着各种荧光标记技术和高分辨显微
镜在生命科学研究领域的应用，自 20世纪末期，单
收稿日期：2007-11-11；修回日期：2007-12-05
基金项目：“973”项目(G2002CB713808)
* 通讯作者：E-mail：luojianhong@zjuem.zju.edu.cn
分子检测领域蓬勃发展起来。单分子研究可以用来
考察异质群体中的每个个体，并可以鉴定、分类、
定量比较它们的亚群。对于复杂的、难以同步化的
生化反应，单分子研究则可以提供详细、确定的动
力学参数。单分子研究的灵敏性使之可以用来检测
生物系统中那些发生概率小的事件，或那些数目较
少的目标分子，而这在集团平均研究则是不可能
的。通过在单分子水平的研究，我们在蛋白质与配
体的结合(受体与配体、酶与底物等)、DNA与转录
复合物相互作用、肌动蛋白运动模式、细胞膜的结
构和表面分子特性等方面，取得了突破性的进展。
可以说，实现对单个分子的追踪和观察，为生命科
学领域的研究开辟了一片新天地。
3 0 生命科学 第20卷
细胞膜是细胞感知外部环境变化并对其做出反
应的重要场所。对细胞外环境变化的感知会导致单
分子发生结构或化学变化，从而触发细胞内信号级
联反应，或者调解细胞表面的分子运输。传统的研
究已经鉴别了多种细胞表面受体和细胞信号传导机
制，如营养因子、生长因子、病原体、细胞外基
质等。然而，有许多生理、病理变化只影响单个
分子或细胞器。另外，在信号平均化的过程中，许
多信息也会丢失，因此，欲确定信号传导机制的部
分重要细节，必须能够研究单个独立的变化过程。
目前，有些技术和方法的时间和空间分辨率已经大
为改进，可以用于研究处于或接近细胞表面处大分
子的反应。一些方法，如电子显微镜，具有极高
的空间分辨率，但并不适合用于动态成像研究。另
一些方法，如扫描探针显微镜和近场扫描光学显微
镜可以提供纳米数量级的空间分辨率。然而，如果
要扫描，如细胞表面大小的区域，它们的时间分辨
率就会很差。此外，这些显微镜不能同时观察全部
细胞表面，这就限制了它们在实时监控细胞表面变
化中的应用。电学检测方法，如电压膜片钳技术，
具备小于毫秒的时间分辨率，但全细胞电生理记录
则无法获得空间信息。然而，随着荧光相关光谱、
全内反射荧光显微术、受激发射损耗等显微技术进
一步发展、高灵敏度 CCD的研发，以及量子点等
各种分子标记的开发和应用，光学成像已经成为人
们在细胞的近膜区进行单分子检测的主要手段。以
下我们对近年来在细胞膜表面单分子实时、视见研
究领域取得的进展做一个回顾。
1　显微技术的发展
1.1　荧光相关光谱术 (fluorescence correlation
spectroscopy, FCS)
FCS通过测定溶液中焦点容积(focal volume)内
发光粒子因布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落
现象，并经分析荧光涨落的相关函数而获得单个粒
子(如分子)的浓度、化学动力学参数等信息。如果
以 1:1的比例对目标分子进行标记，那么荧光强度
与目标分子的浓度成正比。在焦点容积内，由于大
分子不停的进行布朗运动，进入或离开该容积的分
子数目总是在平衡值附近波动，这就会产生荧光涨
落。或者，由于发生化学反应，导致发光物质的
结构发生变化，荧光强度也随之发生变化，这也会
表现为荧光涨落。将大分子布朗运动和化学反应这
两种情况下的荧光强度波动进行量化，就可以得到
荧光强度关于时间的自相关函数[1]。荧光分子的发
射光穿过焦点容积传递到检测器，每检测到一个光
子，就转换为一个脉冲。这样，在一定时间间隔
内，通过处理脉冲数据，就能相应地量化荧光强
度，在一段时间内连续记录就可以检测到连续的荧
光强度变化[2 ]。
由于焦点容积很小，在目标分子浓度较小的情
况下，可以认为单个焦点容积只容纳一个目标分
子。使用 FCS进行检测，实际上是通过考察数千
个单扩散事件综合得到的数据。因此，FCS能够在
相对短的时间内对扩散系数以及分子浓度进行精确
计算，也主要用于有关扩散和浓度的研究领域中。
1.2　单粒子跟踪 (single-particle tracking, SPT)　
单分子跟踪技术结合了录像显微镜和数字相
机，以一定的频率连续拍摄标记的单分子，经过图
像数据处理，描绘出单分子的运动轨迹。目标分子
以绿色荧光蛋白、量子点(200－500nm)或者胶体金
(40－ 100 nm)标记，直径往往小于可见光波长范围
(390－ 780 nm)，因此会散射光波，形成同心圆的
衍射图纹，中心处分辨率可精确到 10nm。
1.3　原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)
AFM的悬臂末端可以在追踪样本表面时进行垂
直运动，通过压力传感器量化检测到的这种运动，
准确定位悬臂末端，从而获得关于样本表面的信
息。使用AFM进行检测，分辨率可以达到纳米至
原子数量级，如AFM已用于Desmoglein 1Ca2+依赖
构象变化的细胞表面成像[3]、单分子相互作用以及
膜表面蛋白质折叠和去折叠过程中的力学特征。
1.4　受激发射损耗术(stimulated emission depletion,
STED)　
STED指在激发光束上重叠另一束波长不同的圈
形激光，后者可以使荧光团去激化。在这两种激光
的平行作用下，只有荧光团中心点会发出荧光，理
论上说，中心亮点的分辨率可以达到 10 nm(图 1)。
Hell小组已经获得了 28 nm的横向分辨率和 33 nm的
轴向分辨率。STED突破了衍射极限概念，已经在
单荧光分子实验中成功地突破了衍射极限，并且由
于是非接触成像，光强适度，不会对样本产生光损
伤，将这一荧光显微术结合于激光共聚焦显微镜、
全内反射显微镜等，有望对单分子进行探测、定
位，对细胞间和蛋白质进行详细而精确的观察[4]。
Williq等[4]使用STED对神经递质通过胞吞被内
化后的运动特征进行研究。突触小泡直径大约
40nm，用荧光显微镜很难分辨。而采用 STED，使
用 470nm的激发光和 615nm的去激发光，使荧光焦
点处的焦斑半高全宽(full-width-half-maximum,
F W H M )从共聚焦显微镜时的 1 9 5 n m，缩小为
66nm，因此可以分辨相距为 45nm的两个光点，如
Sieber等[5]对Syntaxin在胞质膜表面成簇状况的研究
中发现，使用 STED后相对于普通的激光共聚焦显
微镜，分辨率提高了 7 倍(图 2)。
3 1第1期 张筱敏，等：细胞膜表面单分子事件的实时观察
1.5　相干反斯托克斯拉曼散射显微术(coherent anti-
Stokes Raman scattering microscopy, CARS)　
生物样本的振动光谱包含了许多大分子指纹信
息，可以利用这种信息，在组织中区分生物化学成
分，这种指纹信息可以通过 C AR S 来进行检测。
CARS是一种非线性效应。用一束频率为ωp的pump
beam和一束频率为ωs的 Stokes beam照射样本，当
频率差 (ωp-ωs)和所监测对象带有的特异的拉曼活性
分子振动频率相同时，就会发生共振，产生很强的
anti-Stokes 信号，频率 ωas=2ωp-ωs。而且，由于
CARS是非线性效应，因此只有在激光焦点处产生
信号，这样就可以逐点对厚的样本进行 3D 成像，
这一点上，类似于双光子显微镜[6 ]。
这样，通过调节 ωp和 ωs，利用不同生物分子
的振动光谱，就可以获得背景较低的成像信息，而
不需要荧光标记。Tong等[7]将 200nm的聚苯乙烯颗
粒包装入脂质体，来研究叶酸受体介导的内吞作
用。将(ωp-ωs)从 2 840cm-1调整至 3 045cm-1(与芳香
环C-H键的振动频率相符)，大大降低了原细胞内的
自发荧光。通过这样的调节，达到了选择性观测聚
苯乙烯的目的，并且收获了较高的信噪比，FWHM
达到 250nm左右。研究发现在 7h孵育之后，聚苯
乙烯颗粒已经被完全内化，并且运送到核周。
可见，通过检测分析 CARS信号，就能研究
囊泡的内化运输。应用这一技术不会产生光漂白和
光损害，对活细胞来说是非常安全的，研究结果也
相对可靠。
1.6　全内反射荧光显微术(total internal reflection fluo-
rescence microscopy, TIRFM)　
当光波穿越一个高折射率的介质(如玻璃)到达
一个相对低折射率的表面(如水或缓冲液)时，如果
入射角度在临界点之上，光会被完全反射回来，并
且在折射率较低的介质内，从临界面开始形成持续
的光波，光强度从分界面开始以指数级的速度递
减，被称为“逝场波”。全内反射显微镜或逝场
波显微镜就是基于这一原理的一项技术。荧光团越
接近于分界面，激发光强度越强。在一定距离内，
荧光团能有效地被渐逝光激发，通过改变光的入射
角度，可以调节这个距离，该分析深度(激发强度
减弱至 1/e)范围从 50nm至 150nm。这一焦深小于透
镜焦距，因此基本可以屏蔽离焦荧光的干扰。这不
但提高了成像敏感度，同时减少了暴露于激发光中
图1　STED成像原理示意图[4]
图2　普通激光共聚焦显微镜(左图)成像和采用STED成像的分辨率差异
3 2 生命科学 第20卷
的细胞的数量，使细胞受到的光损伤降至最低。由
此可见，TIRFM应用于细胞表面变化的成像时，具
有其独特的优势，它具有其他光学成像技术无法比
拟的高信噪比和对比度。目前TIRFM主要用于细胞
膜及近膜区域的荧光标记分子的研究。
2　荧光标记的发展
2.1　有机染料分子
在过去的几十年里，有机化学家们设计出几千
种荧光探针，被广泛应用到生物学研究的各个领
域，目前常用的有 fluorescein、rhodamine、Alexa、
Cy系列的荧光染料。通过复杂的蛋白化学标记的方
法，把这些荧光染料标记到蛋白的特定位点，而且
这些小的有机染料的一个显著优势就是它们很少会
产生空间位阻并干扰蛋白的功能。
最近，Tsien等研究出一种结合荧光染料和基
因标记技术的活细胞单分子标记方法，这种方法所
用的荧光染料为一类能穿透细胞膜、含有双砷基团
的荧光分子(如FlAsH-EDT2等)。这类分子进入细胞
后能选择性与六肽标签CCXXCC序列结合，形成能
发荧光的、共价结合的双砷 -四蛋氨酸体系。六肽
标签可以通过分子克隆技术与目标蛋白的基因融
合，这样，活细胞表达的重组蛋白就能够被可透膜
的双砷染料特异性标记。目前，已经开发出可产生
蓝色、绿色或红色荧光的双砷染料，这项技术所用
的标签小，并能提供电镜和荧光成像，对光化学敏
感的荧光蛋白质有较好的时间分辨能力，并具有特
定的几何学空间图像的特点。目前用不同的双砷染
料进行的程序性标记可以显示蛋白质分子的生长
期。该标记技术的主要弱点是背景干扰较高，检测
敏感性与 GFP在同一数量级，或者比 GFP还差。
另一弱点是，靶蛋氨酸在与双砷染料结合之前必须
处于还原状态，这会影响分泌途径中或细胞外的蛋
白标签的标记。
2.2　荧光蛋白(fluorescence protein, FP)
最早是从水母中克隆继而表达了绿色荧光蛋白
(green fluorescence protein, GFP)。此后，通过突
变或者对其他物种进行研究，得到了多种更适合于
进行分子标记的荧光蛋白(FP)。FP作用是不需要任
何辅助因子，但一定需要氧气：因为需要氧化在
FP蛋白结构内部的 3个氨基酸使之进行自环化，然
后发光团才能发光。通过突变，可以增加 FP的稳
定性，甚至产生出能够进行光转换的 FP，如从暗
到明、从一种颜色转变成另外一种颜色。这些转变
有的是可逆的；有的是不可逆的。运用多种多样的
荧光蛋白，可以有效的监测蛋白质的扩散、运输以
及蛋白寿命。一般来说，除了在酸性 pH及变性的
情况下会淬灭外，荧光蛋白的发光几乎不受周围生
化环境的影响。FP一般通过基因克隆的方法连接到
目标蛋白上，这被称为“遗传标记法”。首先基
因操作制备 FP和目标蛋白的融合基因，继而使用
转染等方法将融合基因导入细胞内，使 FP和目标
蛋白以融合蛋白的方式在同一个启动子的带动下得
以表达，从而实时监控目标蛋白。
2.2.1　遗传标记FP的方法改进　遗传标记是通过化
合键的形式实现 FP与目标蛋白的连接，具有更高
的精确度，且标记方法具有很大改进空间，如将FP
基因片段在合适的位点分开连接在两种蛋白上或者
蛋白肽链的两端，当蛋白重新折叠，或者两种蛋白
相互作用之后，FP两个分开的部分就能够互相影响
而重建发光团，这一过程叫做双分子荧光互补法
(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)。
然而，目前尚无应用于单分子检测的例子。
2.2.2　对 FP各性状的改进　目前，FRET仍然是检
测单分子构像改变，以及单分子之间相互作用的有
力工具；而CFP和YFP分别作为供体和受体的这一
分子对，则是使用最广泛的。然而，CFP本身具
有的一些特性一直影响着 FRET效率，如它量子产
率低、发射光谱的拖尾现象降低了信噪比等等。此
外，CFP和YFP的pH适宜范围也有一定差异。Rizzo
等通过点突变 CFP的方法得到了 Cerulean。相较于
CFP而言，Cerulean具有更高的量子产率和消光系
数，使用Cerulean代替 CFP作为供体可以在很大程
度上提高 FRET效率。
此外，从其他有机生命体中，还发现了许多
不同的荧光蛋白，如海葵红色荧光蛋白(DsRed)。
在 FRET研究中，它可以作为 Sapphire或 EGFP的
受体，且 Sapphire和DsRed具有不同的最适 pH，可
以通过调整环境的pH而将供体和受体的激发和发射
完全隔离开来。此外，最近克隆了一对可用于
FRET的荧光蛋白，MiCy (a cyan-emitting protein)
和KO (an orange emitting protein)。这一蛋白对的优
点在于具有一个较大的 Forster distance，约 5.3nm，
而 CFP-YFP蛋白对则只有 4.9nm，能够检测更大范
围的蛋白之间相互作用，且两发射光通道相距较
远，产生的干扰较少。
突触定位的 pHluorins是一种 pH敏感的GFP。
它在中性 pH的条件下发出荧光，但是在酸性条件
下，荧光强度大大下降。在细胞内许多微区 pH偏
酸性，如内质网腔、高尔基体、分泌小泡等；而
胞外区具有中性 pH。利用这一特性，Ashby等[8]研
究了AMPA受体的内化。他们在将 pHluorin连接在
GluR2的N末端(胞外区段)。分泌前，N末端在囊
泡内，由于囊泡内为酸性环境，pHluorin作为一种
pH敏感型 GFP，只会发出很弱的荧光；而当受体
3 3第1期 张筱敏，等：细胞膜表面单分子事件的实时观察
被运送到细胞膜上时，N末端处于胞外的中性环境
中，荧光将大大增强，这样就能分辨胞内和膜上的
AMPA受体。
目前单分子成像技术对所检测的对象的浓度都
有严格的要求，一般是在 nmol/L级。因此，往往
采用减少被测对象的标记量，或者减少被测对象表
达量等方法来满足这一要求。然而，一些低亲和力
的结合要求有一定数量的目标蛋白；此外，某些酶
也只有在达到一定浓度后才能最大程度发挥作用。
在这些情况下，必须保证一定的被测对象表达量，
那么要实现单分子水平检测就比较困难。在这个方
面，Eggeling等[9]使用了一种新方法，称其为非浓
度依赖的单分子光谱。使用这种技术，可以将可见
分子的数目减少到 1/1000。在研究中，使用可逆的
荧光转换蛋白 d r o n p a。这种荧光蛋白在蓝光
(488nm)照射时关闭荧光；紫外(405nm)照射后开启
荧光。荧光的开启和关闭是由荧光团的顺式反式异
构决定的。从关闭状态到开启状态的改变可以通过
紫外光照射来诱导。实际上，蓝光并不是完全导致
荧光消失，在一定程度上它也可以开启荧光。因
此，在蓝光照射下，单个大分子处于闪光状态，其
发光时间为毫秒，而熄灭时间持续几秒钟，最终形
成一个荧光大量减少后的平衡状态。这个平衡状态
荧光强度弱，但是代表性很强。用这个方法，在
不减少目标蛋白浓度的情况下，降低了荧光蛋白的
密度，就可以在高蛋白浓度下检测到单个分子的荧
光信息 [ 9 ]。
Dmitriy等则使用 asFP595，一种在强烈绿光照
射(530－ 570nm)下发出红色荧光，而在蓝光照射
(450nm)下会熄灭的可逆光激活荧光蛋白(photoa-
ctivatable fluorescent proteins, PAFPs)。在研究中，
通过多次激发荧光，在每个独立的时间区间内追踪
蛋白快速移动，得到了较高的分辨率，并实现了长
时程追踪目标分子而不发生荧光减弱现象。这样就
可以更精确的检测到目标分子的扩散速度。 研究中
还使用普通的GFP在相同时间跨度下进行实验作为
对照，发现在后期背景绿荧光会非常高，严重干扰
研究结果[1 0]。
2.3　量子点(QDs)
QDs (quantum dots)是合成的无机纳米晶体，体
积为 1－ 10 nm。与 FP相比，QDs具有较高的消
光系数，是 FPs的 10－ 100倍，且QDs的发射光
谱范围很广，从短波到发射光谱极限。又由于QDs
的发射光谱取决于其成分、体积、形状，在单一
激发光的情况下，可以得到多种不同颜色的 QDs。
此外，QDs具有很高的光稳定性，可以多次进行成
像，克服了 FP荧光淬灭的缺点。在构成上，所有
的QDs都有一个CdSc或者CdTe的核心，以及一个
ZnS壳。在应用时，包被外壳对QDs来说很重要，
这使得QDs具有可溶性，且防止它们在水的作用下
淬灭，但它的疏水性依然对它透膜造成了阻碍。有
研究显示，较大的QDs在进入海马神经元的突触时
会有一定困难。而由于 QDs的体积相对较大，当
标记对象密度较大，或者是一个固定在某处的蛋白
时，可能会导致原目标蛋白与邻近蛋白的作用效率
降低。鉴于 QDs荧光强度高的特点，它更适于在
密度较低时标记目标分子。目前大部分单分子成像
研究是使用QDs作为膜表面标记物，这是因为在这
类研究中标记物不需要穿越结构严整的细胞膜。
3　细胞膜表面单分子事件的实时成像研究
3.1　细胞膜成份的观察
3.1.1　对膜蛋白扩散运动及膜微区的研究　在细胞
膜上，有一些局部微区(microdomain)，这些微区
一般有特定的蛋白质成分。微区携带着组合在一起
的特定蛋白和膜脂在细胞膜表面协同移动，往往具
有细胞信号转导、物质运输等特殊的功能。通过对
细胞膜单分子进行追踪，可以获得有关其扩散系
数、运动轨迹等详细信息，这些参数就能够在细胞
膜微区的“界限”，及其划分特征等方面提供非常
有价值的信息。
SPT(single particle tracking)是研究膜表面分子
动力学特性及膜微区主要方法之一。由于QDs不易
受到光漂白，且亮度高，尤其适宜于单分子长时程
追踪。因此，在 SPT研究中，QDs标记往往被广
泛使用。Sonesson等[11]使用 QDs标记脂肪酶，在
静止和流动缓冲体系中，对脂肪酶在制备的三肉豆
蔻精薄膜作用和运动的动力学特征进行追踪成像分
析。他们发现，单个脂肪酶在制备薄膜上往往先在
一个固定区域内作扩散运动，然后会长距离运动到
另一个区域，继续进行局部的扩散运动，周期往
复。由于是单分子成像，可以对移动步距进行分
析。发现限制运动的步距，在静止体系和流动体系
没有显著区别，均为 0.45µm左右。而在流动体系
中，跨区运动的步距要高于在静止体系，但依旧是
远小于流动缓冲液的流动速度。提示也许在跨区运
动中，脂肪酶和底物薄膜的连接较弱，受流动缓冲
液的带动影响较大。
这是对QDs标记的单个目标分子进行SPT研究
的范式。当然，在体追踪膜表面单分子也已经实
现。Bates等[12]对幼鼠肾细胞膜上QDs标记的单个
CFTR进行轨迹追踪，发现大部分 CFTR(>50%)在
膜表面是静止的。而在CFTR的C末端增加 10个组
氨酸，掩盖它的 PDZ结构域，阻止它与支架蛋白
的作用之后，大部分 CFTRHis-10的扩散系数大大增
3 4 生命科学 第20卷
加。有趣的是，在扩散运动当中，CFTRHis-10会被
吸引到某个位点附近，在一段时间内(<1min)，围
绕该点运动，然后再离开继续扩散运动。在细胞膜
上往往存在一些固定的位点，扩散运动的CFTRHis-10
会多次回到这些位点。看来，膜表面蛋白分子移动
的这种“stop-and-go”模式是普遍存在的，并且
它似乎蕴含着不同的复杂的机理，耐人寻味。
Douglass等[13]用TIRFM对T细胞内GFP标记的
酪氨酸激酶 LcK蛋白进行 0.5－ 10 s的追踪。LcK
是膜连接蛋白，追踪结果显示，即便是单个LcK蛋
白，也呈现出不同的运动模式。与脂肪酶类似的，
有些时候，LcK蛋白在膜表面具有较高的移动性，
而有时则表现出高度的限制性，且这种“mobile”
状态在同一个单分子的运动轨迹中往往是交替出现
的。膜受体 LAT同样呈现出这样的运动模式，而
CD2分子在膜表面更倾向于处于静止状态。进一步
研究发现，处于运动模式中时，LAT和 LcK蛋白
分子的轨道往往绕开CD2分子簇，而一旦运动时遭
遇 CD2分子簇时，就被捕获，但之后也并不是完
全静止，而是在 CD2分子簇周围很小范围内活动。
这种遭遇-被捕获的事件在T细胞被激活的情况下大
量发生，这种现象在单分子研究中可以被发现，但
是在集团研究中就体现为LAT、LcK和CD2分子的
共定位。
过去的研究表明，LAT和LcK与细胞膜表面下
细胞蛋白骨架有相互作用。似乎CD2是稳定处于某
些膜微区中，LAT和LcK则在各膜微区中游走。当
T细胞被激活时，细胞骨架帮助膜蛋白进行重排，
LAT和LcK进入CD2分子所在的微区，形成功能性
微区。另外一种被广泛认同的观点则认为膜蛋白的
这些运动特性是与细胞膜中的胆固醇相关，当然这
与细胞骨架参与膜功能区的形成并不一定会矛盾，
这些都需要更多更深入的研究。最近，使用 FCS对
膜表面单分子进行追踪，时间分辨率已经可以达到
微秒。结合直径 75－ 250nm的纳米孔更是克服了
FCS在空间分辨率上的局限。可见，单分子荧光成
像确实为膜蛋白扩散动力学及膜微区相关研究提供
了新方法、新视角。
3.1.2　对膜表面蛋白折叠动力学的研究 对于膜表
面分子研究的另一热点在于膜表面蛋白的折叠动力
学。多肽链是如何折叠成蛋白质的？为何同种蛋白
质会以不同的三级结构存在？哪些分子力在维持蛋
白质三级结构中起了主要作用？过去，对蛋白质的
三级结构的研究仅限于可溶且体积较小的蛋白。膜
整合蛋白所处的环境很难模仿，对膜蛋白进行实验
非常困难。近期，得益于对AFM充分合理的利用，
对膜蛋白折叠的研究日渐成熟。Kedrov等[14]使用
AFM研究去折叠和重新折叠膜上Na+/H+逆向转运蛋
白(sodium-proton antiporters ，NhaA)。这是一个
非常经典的用AFM来研究膜表面蛋白折叠和去折叠
的研究。蛋白去折叠的自由能变化也可以用AFM进
行测定。Preiner等[15]利用AFM在单分子水平研究
了 HR(halorhodopsin)、BR(bacteriorhodop-sin)、
NhaA三种蛋白的折叠自由能(即去折叠状态和完全
折叠状态之间的能量改变)。
3.2　细胞膜受体、离子通道的研究
3.2.1　对配体 -受体结合动力学方面的研究　配体
和细胞膜上的受体结合，是将胞外信号转导到细胞
内关键步骤之一，同时配体受体结合能力也是设计
小分子药物的一项重要指标。荧光成像技术的发展
为研究配体和受体结合的动力学特性提供了多种方
法，如 Oliver等用 FCS比较了用三种荧光团荧光
素——四甲基罗丹明、OG488(Oregon Green 488)
和Alexa 532连接到丙苯二氮受体丙苯二氮 Ro 07-
1986/602后，带荧光的该配体和受体的结合性，以
此方法来对标记荧光进行选择。如前所述，FCS的
检测体积很小，可以认为它检测的荧光来自单一目
标蛋白。而实际使用 FCS得到的荧光涨落是综合考
量了多个单分子事件之后分析数据得到的。从这个
意义上说，它不及真正的单分子研究精确。如果能
够对处于不同结合阶段的配体 - 受体对进行区分，
就能得为细节、更为真实的信息。
Lill等[16]在活细胞表面通过荧光成像研究了G-
蛋白偶联受体 neurokinin 1 receptor (NKR1) 信号传
导的动力学特征。他们使用四甲基罗丹明(543nm激
发)标记受体拮抗剂底物 P(SP)激活NKR1信号级联
反应。同时又用EGFP(488nm激发)标记NR1R的N
末端。研究中，先在 EGFP 通道观察，调节聚焦
至细胞膜表面，然后转入 TMR通道。一旦发现 SP
信号，就说明缓冲液中的 SP定位至细胞膜上，此
时它们已经和受体绑定。从这个时刻开始记录SP的
移动状况。这样就以配体受体结合为初始点，实现
了数据同步化。
当然，定位于膜上的受体也可以用AFM来研
究。用AFM对配体受体的结合进行单分子水平研
究，可以测量很多在集团水平研究中无法获得的参
数。Chang等[17]定量描述了 gp120和宿主细胞(表达
CD4的细胞)表面受体结合的动力学特性，并且根
据研究结果，为导致HIV入侵靶细胞的早期步骤中
gp120和靶细胞受体相互作用的分子机制提供了一个
模型。即 gp120首先与 CD4结合，结合了 CD4的
gp120快速寻找 CCR5，并与之形成新的联结。如
果 gp120不能立即寻找到 CCR5，就会从 CD4上解
离下来。
3 5第1期 张筱敏，等：细胞膜表面单分子事件的实时观察
类似的集团研究能够提供分子之间，如CCR5/
CD4/gp120相互是否会发生作用，但难以提供更细
节的信息；而分析单分子研究的参数，就可以得到
关于多蛋白质间相互作用的更多细节信息，如稳定
性、结合时间等，为分子研究的诸多假设提供了更
直接的证据。
3.2.2　受体、离子通道侧向运动的研究　对受体侧
向运动研究的一大焦点涉及神经元膜表面受体在突
触上数量的改变，如AMPA受体和NMDA受体在突
触上的分布就会随外部刺激而改变，它们通过胞
吞、胞吐和侧向运动等迅速地在突触和突触外区域
之间移动，这一过程可能具有重要的生理意义。
Tardin等[18]用Cy5或者Alexa647标记含有GluR2
的AMPAR。他们缩短了抗体标记时间(10min)，使
得AMPAR只有部分被标记，这样检测平面上带有
荧光的AMPAR数量大为减少，就可以观察到单分
子，并以每秒 33帧的速度进行系列成像，轨道记
录时程从 0.1s－ 4s不等，取决于光漂白时间。突
触前中心半径小于 300nm的范围内，被认为是突触
区，其他均被认为是突触区外(图 3)。研究发现突
触区单个AMPAR活动范围受到很高限制(轨道 1－
3)，突触区外单分子表现出自由扩散的运动轨迹(轨
道 4)，且AMPAR可在两个区域间跳跃(轨道 5)，同
时改变运动模式。在加入 100µmol/L谷氨酸孵育
15min之后，突触内的AMPAR扩散常数显著提高了
55%。同时，突触内静止态的AMPAR减少了 30%。
此外，近突触区(400－ 800 nm)，AMPAR的密度
提高至加入谷氨酸前两倍。有意思的是，谷氨酸会
导致 A M P A R 内吞，而内吞应该引起静止态的
AMPAR的数量上升。看似与之相悖的实验结果实
际上提醒我们，AMPAR的内吞发生在突触外区，
这就是说AMPAR要首先扩散到突触外，这就与其
扩散常数提高是相符了。
随后，该小组用QDs标记GluR1和GluR2的N
末端，继续在存活的海马神经元中研究单个AMPA
受体的侧向扩散以及影响其扩散的因素。他们发
现，在突触内AMPA受体运动到 PSD95时，扩散
系数大大下降，当它离开 PSD95时，扩散系数又
重新上升。在 PSD95附近静止态的AMPAR比例是
PSD95外区域的 4倍。而这种与 PSD95相关的突触
定位是与 Stargazin的 C末端 PDZ domain高度相关
的。当截去 Stargazin C末端 PDZ区域后，静止态
AMPA受体的比例，无论在突触区还是突触外区都
显著下降。如果干扰 Stargazin和 PSD的相互作用，
AMPAR在PSD附近滞留的时程也会减短。而GluR2
的 C末端与它的突触后定位无关，C末端的缺失也
不会影响AMPAR的侧向扩散。此外，光漂白后荧
光恢复(fluorescence recovery after photobleaching,
FRAP)结果也显示，Stargazin 和AMPAR很可能是以
某种形式在细胞膜上共同运动的[19]。实际上这种共
同运动的现象并不偶发。如前文已经述及，越来越
多对细胞表面受体侧向运动的研究发现，多种功能
相关的蛋白在细胞膜上常常是捆绑运动，或者它们
被招募到同一个膜微区，以信号平台的方式发挥信
号传导作用。
3.2.3　膜蛋白分子比的研究　很多膜蛋白在被运输
到细胞膜上并实现其功能之前，都必须要形成一个
聚合物，而这个聚合物的分子比(stoichiometry)是受
到精确调控的。即便是在集团水平的研究中要确定
蛋白复合物的分子比，包括亚基的个数，及彼此的
比例也是较难解决的问题。一般，人们会采用生化
的手段，通过非变性条件下蛋白复合物的分子量来
大体推断其分子组成，或者采用宏观的功能分析，
如根据电压钳记录下通道开放时电流的形状来预测
通道的分子比。
近几年，FRET技术被用来分析蛋白复合物的
分子比。F RE T 技术可以判断蛋白之间的相互作
用，目前认为形成复合物的亚单位之间的距离在
FRET的检测范围之内，FRET技术成为在活细胞条
件下分析蛋白复合物分子比的重要手段。多年来，
图3　AMPA受体在神经元膜上移动的轨迹(左侧为轨道示意图，右侧为时间 -距离作图)[18]
3 6 生命科学 第20卷
功能分析认为环核苷酸门控离子通道(cyclic nucle-
otide-gated Ion channel, CNG)是由CNGA1和CNGB1
亚单位组成的且分子比为 2∶2的通道。但是最近
一个小组通过对 C NG 通道的 F R E T 研究，发现
CNGA1和 CNGB1形成通道的分子比为 3∶1。我
们小组也通过 FRET的方法在活细胞内进一步证实
NMDA受体的NR1与NR2亚单位的分子比为2∶2[20]。
另外，FRET技术不但可以判断蛋白之间是否
存在相互作用，它还可以判断蛋白之间的距离，因
为 FRET效率(E)与蛋白之间距离的 6次方(R6)成反
比。我们小组就是利用这一特性分析了NMDA受体
亚单位同二聚体的胞外N端在装配成异四聚体前后
的构象改变。最近，FRET技术与 TIRFM的结合
可以将研究目标聚焦在膜表面有功能的蛋白复合
物，并且分析其分子比或者动态判断不同状态下
(例如通道开放或关闭)膜蛋白的构象改变。另外，
还有研究小组报道了3种荧光蛋白之间的FRET检测
和计算方法，又进一步扩展了 FRET技术的应用范
围。但是即便如此，FRET在用来判断分子比时也
有其局限性，因为它最适合判断蛋白含有一个还是
多个亚单位，但是当蛋白的某个亚单位个数多于 3
时则无法精确判断其个数，可能要借助其他的方法
如生化等来具体分析。当然，还可以用蛋白结晶的
方法，通过对结晶体的结构分析来确定蛋白的分子
比，但是这种方法比较复杂，不是每个实验室都可
以掌握的。
2007年，Nature上发表了一篇文章，提出了
一个巧妙的方法，将对膜蛋白的分子比分析从集团
水平推进到了单分子水平。我们都知道要确定观察
到的荧光信号是否来自单个荧光蛋白，其中最主要
的证据是一步漂白(one-step photobleaching)，Ulbrich
和 Isacoff[21]正是利用这一特点，通过判断荧光分子
的具体漂白步骤，来确定细胞膜上膜蛋白的亚单位
个数(图 4)。他们将通道亚单位标记上 GFP，那么
GFP的个数就代表了亚单位的个数。单个GFP的漂
白是固定的一步漂白过程，通过观察复合物中所含
GFP的荧光强度以及其漂白步骤就可以判断GFP的
个数，即亚单位的个数。同时他们采用 TIRFM显
微术来排除细胞质内自发荧光的干扰，首先分析了
分子比比较明确的钙离子通道，CNG通道以及含
NR1/NR2B的NMDA受体来验证这种方法的可行
性。然后进一步分析了含NR1/NR3B的NMDA受体
的分子比，发现细胞膜上此种NMDA受体亚型的分
子比也是 2∶2。此方法思路比较清晰，设计非常
巧妙，能够在活细胞内通过计数GFP漂白步骤来快
速确定亚单位的分子比，而且分析过程不需要特殊
的软件，可以被广泛应用。这种方法还能够用来检
测信号转导复合物的功能，特别是当这种复合物被
激活时能够征募某些细胞伴侣。这种方法也有一定
的局限性，例如它无法判断含 5个亚单位以上的复
合物的分子比，因为这种条件下对于 n和 n+1个亚
单位的漂白步骤的区分会比较困难。
3.3　对囊泡运动的研究
对分泌细胞的胞吞、胞吐，以及神经末梢递
质和调质的释放，传统的研究中一般通过放射性免
疫实验检测放射物的变化，或者是检测突触末梢电
生理反应等间接的方法。随着荧光标记技术和成像
技术的发展，2004年之后，开始利用 GFP在培养
的细胞中对分泌细胞囊泡和相关蛋白直接标记、成
像、追踪。最近，还实现了对转基因动物的囊泡
运动进行成像。
然而，神经末梢单个突触扣结上的分泌囊泡个
体很小(40 nm)，而且内含物致密，当多个囊泡同
时被荧光标记时，要区分单个囊泡就比较困难。
2005年之后，这个问题才慢慢解决。Lemke等[22]
利用双染色的方法，即先用FM5-95(红色)在长时续
图4　在单分子水平利用荧光成像技术分析受体分子比的方法[21]
3 7第1期 张筱敏，等：细胞膜表面单分子事件的实时观察
强刺激下对神经元突触扣结进行染色，然后在最小
电刺激的情况下对少量进行胞吞的囊泡用 FM1-43
(绿色)进行染色，实现了对单个囊泡的成像观察。
随后，Katrin等通过 STED技术，获得了清晰的突
触囊泡的成像图。研究中，他们对一种囊泡蛋白
(synaptotagmin I)的囊泡内肽链用单克隆抗体进行标
记，追踪在胞吐后回收过程中这种蛋白的变化。发
现在回收之前，这些囊泡蛋白仍然是以成簇的形式
停留在细胞膜上，不会进行扩散。提示至少有一部
分囊泡蛋白融合入细胞质膜后依然保持原来的组织
形式，在囊泡回收时直接可以利用这些蛋白组合模
块，而不用再重新组合蛋白。
使用荧光蛋白标记来研究单囊泡的运动也已经
实现。这有赖于新型GFP的开发和利用。David等
使用全内反射显微镜来观察和记录星形胶质细胞内
SpH(synaptopHlourin)标记的单个囊泡。并且检测到
两种不同的单囊泡释放形式。其中一种形式类似于
kiss-and-run 囊泡融合，占 40%；另一种类似于完
整胞吐的发生，占 6 0 %。
前面已经提到，SpH是一个VAMP2和 pH-敏
感GFP突变型的融合蛋白。囊泡腔内是酸性 pH环
境，这种 pH-敏感型 GFP在酸性条件下，不会发
出荧光。当胞吐发生时，SpH被释放到胞外的中性
环境中，这时，荧光团发生去质子化，荧光强度
大大增加。这可以用来检测胞吐的发生。研究发现
了两种不同的囊泡释放模式。在模式一中，荧光衰
减周期为 1.5s，而且没有向目标区域外扩散；而在
模式二中，荧光衰减周期为大约 5s，而且扩散到
了 2µm之外的区域中。研究认为模式二代表胞吐现
象，SpH被释放后扩散到周围膜上。而在模式一的
情况下，当胞吐发生之后便发生内吞作用，也就是
kiss-and-run模式，同时腔内酸性增加，荧光就淬
灭了。
3.4　对细胞骨架蛋白的研究
目前所获得的大部分对动力蛋白和细胞骨架的
工作原理的信息，是结合使用AFM和 TIRFM在体
外对单个蛋白分子进行操作和检测获得的。体外(in
vitro)研究人为排除了生物系统内复杂的环境体系的
因素，如目标分子是否和其他分子互相作用；是否
定位于某个细胞微区；或者目标分子是否是一个大
的复合物的一部分。但是这些因素都会影响，也可
能改变目标蛋白的活性状况，而且，有许多生化生
理过程，如基因表达、细胞信号转导等都是由一个
或少数几个蛋白质分子来调控的。这些都无法在体
外实验进行研究。因此，在动力蛋白和细胞骨架的
研究方面，也必然要寻求能够稳定可靠的进行体内
(in vivo)标记和追踪单个分子的研究方法。最近，
这一目标也实现了，这里主要以 kinesin来介绍对骨
架蛋白在体研究方面的一些进展。
Courty等[23]首次利用QD在体标记并追踪了细
胞内单个 kinesin的运动特征，检测到单个 kinesin在
体时扩散速度为 1－ 0.6µm/s，且与体外实验一致，
这种扩散是连续的，没有往复也没有停顿。并且发
现kinesin在细胞内的运动并不依赖于F-actin 蛋白骨
架，但是依赖于微管蛋白(MT)。研究中为了保证
QD-kinesin复合物中最多只含有一个动力蛋白，将
QD-SAV和 kinesin的化学剂量比调整为 1∶1或 1∶10
(QD：kinesin)。通过胞饮小泡，而不是显微注射，
将QD-Ks转入细胞(cell-loading technique based on the
osmotic lysis of pinocytic vesicles)，这样就不会出
现可见的细胞形态的改变。为了确定是单个 QD，
使用间断激光照射样本，出现相应的荧光闪烁的轨
道被认为是单个QD标记 kinesin的特征。此外，将
两种QDs混合(发射光分别在 605nm和 655nm)，结
果发现，发射光谱在 605nm和 655nm的荧光闪烁点
没有共定位，进一步确定 Q Ds 以 1∶1 的方式与
kinesin结合。这样，就证实在细胞里QD可以表征
单个 kinesin，而没有形成小的聚集(aggregates)。
Cai等[24]则在 kinesin1的尾部连续标记三个
mCit，这是一种高亮度高稳定性版本的 EYFP。使
用这种标记方法结合 T I R F M 就可以分辨单个
kinesin，并进行追踪，且所检测的 kinesin并没有
结合在任何细胞器上，也没有和体积较大的QDs连
接，它所反应的 kinesin运动形式更能够代表 kinesin
真实的动力学特点。
4　展望
短短二十几年，单分子检测技术飞速发展，从
最初只能在低温下检测单个固定分子，逐渐发展为
在室温下活细胞内甚至细胞器内进行单分子的成像
与操纵。最近 5年，单分子技术本身更是发生了进
一步的改进。人们寻找更方便、更容易获得的化合
物来进行更多点的标记或位点特异性的标记；开发
更好的探针，并改进现有的荧光蛋白，量子点的光
物理特征，使之更适合单分子的检测；成像设备的
进一步优化，甚至研发出突破光学衍射的 STED显
微镜，实现了光学成像概念的突破。单分子检测技
术被更多地应用到生理条件下的研究。特别是对膜
上以及近膜区单分子事件的研究，过去多在人工质
膜上进行，虽然系统简单，方便研究，但是无法
真正模拟生理条件下的过程。而现在则可以实现在
培养的活细胞，甚至整体动物模型上对近膜区单分
子事件进行观察和分析。在集团研究时，对于细胞
膜表面许多生理生化过程研究者们往往只能提出许
多假设模型，单分子水平的研究可以为这些假设提供
3 8 生命科学 第20卷
直接证据，因为单分子研究的参数可以提供多蛋白质
间相互作用的更多细节信息。有人打个比喻，认为
单分子成像研究实际上是在制作一个细胞题材的电
影，虽然生化和生物物理方面的研究已经使我们认识
到试管里分子的动态行为，并使我们通过这些现象间
接地理解细胞内每分钟，甚至每秒钟发生的事件。
但是最终，我们要做到在一个细胞内成像单个分子，
我们不但要观察它们的时空特点，还要进一步理解带
有这些异质性特点的生物大分子，是如何严密地组成
一个工作网络体系，是如何创造出生命的。目前离
这一目标还有一定距离，但是我们相信，在不远的
将来，随着单分子检测技术的进一步发展，我们会
实现对一个细胞的分子水平的全程观察。
当然，在单分子成像及纳米操作技术迅速发展
的今天，我们越来越发现，仅仅将视野停驻在生命
科学领域是不够的。生物大分子基本上都是有机分
子，有机分子之间的相互作用是符合非常复杂的化
学原理的。如果对这些基本化学原理没有很好地掌
握，在分析研究结果时，往往会非常局限。此外，
单分子成像在很大程度上依赖于荧光显微成像，在
定量分析时得到的原始数据往往要经过反复的物
理、数学公式转换，才能为我们所用。否则，即
便拥有了非常先进的技术设备，我们所能做的也将
非常有限。进入微观世界以后，相对论取代了牛顿
定理，光具有更高的波动性而不是粒子性。可见，
在生命科学领域，我们不但要将“眼睛”带入微
观世界，更重要的是我们要将“大脑”带入微观
世界，渐渐接受用全新的思维方式来分析我们的研
究和取得的成果。
[参　考　文　献]
[1] Garcia-Saez AJ, Schwille P. Single molecule techniques for
the study of membrane proteins. Appl Microbiol Biotechnol,
2007, 76(2): 257-66
[2] Vukojevic V, Pramanik A, Yakovleva T, et al. Study of molecu-
lar events in cells by fluorescence correlation spectroscopy.
Cell Mol Life Sci, 2005, 62(5): 535-50
[3] Waschke J, Menendez-Castro C, Bruggeman P, et al. Imag-
ing and force spectroscopy on desmoglein 1 using atomic
force microscopy reveal multivalent Ca(2+)-dependent, low-
affinity trans-interaction. J Member Biol, 2007, 216(2-3):
83-92
[4] Williq KI, Rizzoli SO, Westphal V, et al. STED microscopy
reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic
vesicle exocytosis. Nature, 2006, 440(7086): 935-9
[5] Sieber JJ, Williq KI, Heintzmann R, et al. The SNARE motif
is essential for the formation of syntaxin clusters in the
plasma membrane. Biophys J, 2006, 90(8): 2843-51
[6] Evans CL, Potma EO, Puoris’haag M. Chemical imaging of
tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman
scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102
(46): 16807-12
[7] Tong L, Lu YH, Lee RJ, et al. Imaging receptor-mediated
endocytosis with a polymeric nanoparticle-based coherent
anti-stokes Raman scattering probe. J Phys Chem B, 2007,
111(33): 9980-5
[8] Ashby MC, De La Rue SA, Ralph GS, et al. Removal of
AMPA receptors(AMPARs) from synapses is preceded by
transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J Neurosci,
2004, 24(22): 5172-6
[9] Eggeling C, Hilbert M, Bock H, et al. Reversible
photoswithching enables single-molecule fluorescence fluc-
tuation spectroscopy at high molecular concentration.
Microsc Res Tech, 2007, 70(12): 1003-9
[10] Chudakov DM, Chepurnykh TV, Belousov VV, et al. Fast
and pr ecise t rack ing using repeated reve rsible
photoactivation. Traffic, 2006, 7(10): 1304-10
[11] Sonesson AW, Elofsson UM, Callisen TH, et al. Tracking
single lipase molecules on a trimyristin substrate surface
using quantum dots. Langmuir, 2007, 23(16): 8352-6
[12] Bates IR, Hebert B, Luo YS, et al. Membrane lateral diffu-
sion and capture of CFTR within transient confinement
zones. Biophys J, 2006, 91(3): 1046-58
[13] Douglass AD, Vale RD. Single-molecule microscopy reveals
plasma membrane microdomains created by protein-protein
networks that exclude or trap signaling molecules in T cells.
Cell, 2005, 121(6): 937-50
[14] Kedrov A, Zieqler C, Janoviak H, et al. Controlled unfolding
and refolding of a single sodium-proton antiporter using
atomic force microscopy. J Mol Biol, 2004, 340(5): 1143-
52
[15] Preiner J, Janovjak H, Rankl C, et al. Free energy of mem-
brane protein unfolding derived from single-molecule force
measurements. Biophys J, 2007, 93(3): 930-7
[16] Lill Y, Martinez KL, Lill MA, et al. Kinetics of the initial
steps of G protein-coupled receptor-mediated cellular sig-
naling revealed by single-molecule imaging. Chem Phys
Chem, 2005, 6(8): 1633-40
[17] Chang MI, Panorchan P, Dobrowsky YM, et al. Single-
molecule analysis of human immunodeficiency virus type 1
gp120-receptor interactions in living cells. J Virol, 2005, 79
(23): 14748-55
[18] Tardin C, Cognet L, Bats C, et al. Direct imaging of lateral
movements of AMPA receptors inside synapses. EMBO J,
2003, 22(18): 4656-65
[19] Bats C, Groc L, Choquet D. The interaction between Stargazin
and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking.
Neuron, 2007, 53(5): 719-34
[20] Qiu SA, Hua YL, Yang F. Subunit assembly of N-methyl-d-
aspartate receptors analysed by fluorescence resonance en-
ergy transfer. J Biol Chem, 2005, 280(26): 24923-30
[21] Ulbrich MH, Isacoff EY. Subunit counting in membrane-
bound proteins. Nat Methods, 2007, 4(4): 319-21
[22] Lemke EA, Klingauf J. Single synaptic tracking in individual
hippocampal boutons at rest and during synaptic activity. J
Neurosci, 2005, 25(47): 11034-44
[23] Courty S, Luccardini C, Bellaiche Y, et al. Tracking indi-
vidual kinesin motors in living cells using single quantum-
dot imaging. Nano Lett, 2006, 6(7): 1491-5
[24] Cai DW, Verhey KJ, Mevhofer E. Tracking single kinesin
molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophys J,
2007, 92(12): 4137-44