全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 3期
2008年 6月
Vol. 20, No. 3
Jun., 2008
单分子装置：传感器、连接器、致动器 *
Hermann GAUB 1，杨　洋2 译述
（1 Department of Physics, University of Munich, Germany; 2国家纳米科学中心，北京 100190）
摘　要：生物大分子之所以可以实现生物学功能是与其独特的力学性质息息相关的。作为纳米科技领
域一个重要工具，原子力显微镜(AFM)可以对纳米尺度的生物大分子进行操纵并检测其力学性质。本
文介绍了利用原子力显微镜对几类特殊蛋白以及 DNA的力学性质的研究结果，发现这些生物分子具有
很好的力学传感、连接和致动能力，将来有望作为单分子装置在纳米世界发挥更多功用。
关键词：A FM；单分子力谱；t i t i n 蛋白；C a lB 脂肪酶；D N A
中图分类号：N39; TH742; Q55　　文献标识码：A
文章编号 ：1004-0374(2008)03-0312-05
原子力显微镜(AFM)是目前在纳米和亚纳米级
别进行表面成像的一个重要工具，由于其对“力”
的灵敏和精确的响应，AFM不但被利用为一种成像
工具，并且还是一种非常优秀的操纵工具(图 1)。
对于大多数生物大分子来说，“力”都是表征它们
结构和功能的一个重要参数。利用AFM这样一种操
纵工具，人们可以在自然或生理条件下对单个生物
分子进行研究，因此，关于单分子结构、功能以
及作用力之间关系的大量知识被迅速积累起来。
近几年来，利用AFM技术，我们对于受体配
体的结合[1,2]、蛋白折叠过程[3]、膜蛋白结构解析[4]、
DNA传感器以及功能化的DNA偶联物(药物分子，
蛋白等)的本质[5,6]进行了深入的研究，并得到了大
收稿日期：2008-02-25
*原英文报告名：Molecular devices: couplers, sensors
and actators
通迅作者：E-mail: gaub@physik.uni-muenchen.de
量关于分子内或分子间机械相互作用细节问题的答
案。根据我们已知的生物分子的特性，我们又可以
利用这些生物单分子对于力的响应制成传感器、连
接装置，甚至更为复杂的分子机械。
1　肌联蛋白激酶——具有力学响应的传感器
生物的肌肉系统可以被看作是多种分子马达、
感受器、缓冲装置等组装起来的一种复杂的协同装
置。肌肉系统中一种由肌动蛋白和肌球蛋白组成的
线性马达已经广为人知，而我们则关注于另一种蛋
白——肌联蛋白(Titin)。
Titin蛋白即肌肉细胞中的细丝，是一巨大的蛋
白质，其相对分子质量高达 3 000K左右。该蛋白
几乎跨越了肌小节(sarcomere)的一半，是目前为止
所发现的最长的以共价健相连的蛋白质。Titin蛋白
包含了大约300个类似于免疫球蛋白(immunoglobulin-
like，Ig-like)的重复结构区域和一个催化结构区域，
即Titin激酶(图2)。该蛋白连接肌小节中的肌球蛋白
和肌动蛋白。Titin蛋白随着肌肉的收缩和放松而伸
展和折叠，最后肌小节重排从而使肌肉具有弹性。
Titin蛋白的种种生理功能与其单分子的机械性
质密切相关，在 1997年发表的一项工作中[3]，我
们利用AFM研究了其免疫球蛋白类似区在外力牵拉
下解折叠的过程。首先，我们将生理状态的 Titin
蛋白(10mg/mL in PBS)吸附于镀金层表面，然后利
图1　原子力显微镜以其精确定位的能力和pN级的力
学分辨率成为分子成像和操纵的有力工具
313第3期 Hermann GAU B：单分子装置：传感器、连接器、致动器
用AFM的针尖以较慢的速度接近这一蛋白附着的表
面并保持若干秒，这样可以随机地粘到某个Titin蛋
白的片段，接着向上提起针尖即可有一定几率观察
到一种锯齿状力谱曲线。在这些锯齿状曲线中大多
能看到 20个以上的峰，在 1µm/s的拉伸速度下其峰
高在150－300pN间变化，拉伸距离均在25－28nm
之间。人们知道Titin蛋白的这一区域是由 244个 Ig
类似的结构重复连接而成，每个 Ig类似结构有89－
100个氨基酸的长度，折叠成 7个 β片层围成的桶
装结构域，因此我们假设我们所观察到的锯齿状力
谱的每个齿都与一个结构域解开折叠的过程相一
致。为了证实这一假设，我们利用基因重组的方法
得到仅有 4个和 8个重复结构域的蛋白样品 Ig4和
Ig8，并保证其C端最末一个氨基酸是半胱氨酸以利
用 S-Au键将其共价连接于金表面。通过多次实验，
我们针对两种样品分别得到了大量的最多4个或8个
峰的锯齿状力谱，证明了齿状峰与每个 Ig类似结构
域解体的一致性。再接着我们尝试了对同一条Titin
蛋白进行反复松弛和再拉伸，再拉伸时可以再次得
到锯齿状结构的结果表明了Titin蛋白每个Ig结构域
具有很强的复性能力，没有了力的牵拉时能够很快
恢复为折叠状态，这也就解释了为什么肌肉可以快
速的牵拉和收缩。Titin蛋白不但可以以其 Ig类似重
复结构实现分子弹簧的功能，它同时还具有一个丝
氨酸 -苏氨酸激酶区域(TK)，该区域为我们展现了
其优秀的力学传感器性质。TK作为一个磷酸激酶
可以激活下游转录因子，从而指导肌肉相关蛋白的
表达，进而控制骨骼肌肌小节高度有序的组装过
程。Titin激酶的晶体结构表明，其 C端尾巴通过
自动调节可以结合在其活性位点从而使得该激酶具
有非常规的自抑制机理。而高于 50pN的外力牵拉
可以解除这一抑制而开启其磷酸激酶的活性[7]。我
们在2005年的部分工作中[8,9]利用力学探针分子动力
学模拟的手段弄清了这一“张力诱导活性”过程的
深层机理(图 3)。我们发现 TK的活化过程伴随着其
催化部位机械地顺序打开，而不是整个结构域的完
全解体。结果显示，TK两端的 β片层是在外力下
最早被打开的，而C端相对于N端更弱的力学抗性
导致了其更早的结构改变，这一有序的结构重构现
象解除了 C端尾巴对于磷酸激酶活性位点的抑制从
而激活了其磷酸激酶的活性，进而激活了下游的基
因转录和蛋白表达。
上述结果可以很好解释当肌肉局部受损时自我
修复是如何发生的。可见，受损肌小节内各种蛋白
的解聚直接减弱了该小节的弹性，当肌肉拉伸时，
作用于细丝Titin蛋白 Ig-like重复区域的超常张力造
成了部分结构域的舒展，力的增大又诱发了 TK结
构域巨大的构象变化，而这种构象变化使得 TK的
C端尾巴离开并释放出活性位点，从而减轻了TK的
自抑制，于是肌肉细胞对于损伤的修复在Titin磷酸
激酶的促使下开始了。
对于Titin蛋白的系统研究使得我们认识了一个
敏感的力学传感器——Titin Kinase，它对力学信号
的接收和化学信号的启动使得它在肌肉系统这一复
杂的分子工厂里起到了重要的作用。未来的工作
中，我们还将进一步解释 TK激活的亚步骤，并将
在单分子水平研究 TK与信号的交互作用。
2　CalB脂肪酶——另一种力的测量工具
从上文的Titin激酶得到启示，我们可以假设酶
图3　利用分子动力学模拟Titin Kinase
　 作为一个机械力传感器的机理
图2　Titin 蛋白Ig-like重复区域被拉伸
得到的锯齿状力谱[3]
314 生命科学 第20卷
作为蛋白质都会受到外力的影响而改变其结构进而
改变其功能。为了证实这一观点，我们研究了另一
种酶——南极假丝酵母脂肪酶(Lipase B from Can-
dida antarctica, CalB)，该酶具有较低的底物特异
性，可以将若干种荧光前体分子转化为带有荧光的
分子，如图 4 所示：
图4　CalB可以非特异性的将荧光基团前体水解为释放荧光的分子
CalB的催化过程是伴随着结构的变化的，因
此如果对其施加一个外力，破坏其不同结构间的平
衡使其保持在某一状态，其效果就可以立刻被观察
到。通过比较一个时间段荧光信号的强度变化，我
们就可以研究有无外力或不同外力对该脂肪酶的不
同影响。
为了监控酶分子的构象改变，需要将酶分子的
特异位点固定于玻璃表面，从而保证可以利用全内
反射荧光显微镜(TIRF microscope)对其进行观测。
同时另一个已知的分子传感器(抗原抗体结合)需要被
修饰在酶的特定位置，这一传感器用于把AFM悬臂
梁的力传递到酶分子上并保证当力超过一定极限时
传感器自身会断开，从而保证酶分子仅仅发生构象
变化而不是被展开而变性。在这样一种设置下，才
可以在用一个外力操纵酶分子的同时监测玻璃表面
荧光的脉冲作为一个结构变化的证据。
而为了实现这样的一种复杂设置，必须在基因
水平上对该脂肪酶进行修饰。首先，需要将 CalB
的基因克隆到大肠杆菌中并表达[10] ；其次，需要
在酶中引入一个特异位点用于在玻璃表面固定，这
一要求是通过在酶分子 C端引入一个半胱氨酸来实
现的，半胱氨酸残基可以与马来酰亚胺基团修饰过
的玻璃表面特异结合[11] ；第三，一段寡肽需要被
修饰于酶的N端，从而可以被AFM针尖携带的抗原
分子识别，用于构成上述限制性传感器。
利用这样的装置我们已经可以看到特定位置荧
光爆发随外力的施加而发生的变化，并且得到了外
力消失后(传感器断裂)CalB恢复到活性状态的迟豫
时间约为 4s(结果尚未发表，相关图片不便加载)。
接下来的工作中，我们将改变CalB与针尖或基底的
结合位点从而进一步研究其结构与功能的关系；我
们还希望设计出一种以CalB为基础的单分子力学转
换器。
3　单分子复制与粘贴
利用扫描隧道显微镜，人们已经可以操纵单个
原子在表面上组成各种各样的图案，因此人们常把
扫描隧道显微镜称为“最小的手指”。然而，科
学尚未成熟到利用单原子组装新材料新物质的程
度。在特别需要对分子特别是生物大分子进行研究
的今天，“最小的手指”反而显得不那么适用。近
些年来，我们利用生物分子间可以特异性识别的特
点，将生物分子和AFM探针结合作为一种更为实用
的“手指”来进行单分子的操纵得到了很多有趣的
结果。
DNA本身作为遗传物质的载体是一种重要的生
物大分子。同时，其碱基互补配对的性质为单链间
的特异性识别提供了基础，碱基对间的氢键相互作
用小于共价键，积累起来又远远大于范德华力，再
加上成熟的合成和修饰技术种种这些性质都使得
DNA能够被设计为一种很好的机械力传感器。在前
315第3期 Hermann GAU B：单分子装置：传感器、连接器、致动器
期的工作中，我们已经利用AFM牵拉固定于基底的
DNA链研究了“竖直”(shear)状态[12-14]和“拉链”
(unzip)状态[15]下DNA双链被迫打开的力学性质。实
验结果表明A-T碱基对间的自由能为 3.2kBT，G-C
碱基对间的自由能为 5.2kBT，因此在特定温度且不
考虑热扰动的情况下，以特定状态打开特定序列的
DNA双链需要固定的力。而考虑拓扑结构的话，对
于特定序列的 DNA双链，以“拉链”方式打开它
比“竖直”方式需要的力要小得多。
在上述结果的基础上我们已经可以利用DNA分
子作为传感器甚至可以代替AFM悬臂梁来研究其他
分子间的相互作用[5]。在 2003年的相关工作中，我
们将被检测的DNA分子连接于基底的金表面，将已
知序列和承受力大小的DNA传感器作为标准样连接
于图案化的 PDMS膜表面，利用一个两端分别与传
感器和样品互补且修饰了荧光的单链DNA桥将两者
连接，当PDMS膜从金表面揭下来时，荧光随DNA
桥留在 PDMS膜上和金表面的比例即可作为标准样
和样品间承受力能力的直接判据。按照同一思路，
将标准样以“竖直”和“拉链”两种状态分别结
合于上下两表面，通过揭开后的荧光分布也可看出
“拉链”态对于力的承受远远小于“竖直”态。
同样，将标准样DNA单链与抗体结合在一起并修饰
上荧光，还可特异性的进行抗原检测以应用于疾病
诊断。
了解了DNA不同状态和不同链长对于力的承受
能力不同，最近我们设计出一种利用 AFM对单个
DNA分子进行复制和粘贴的系统(图 5)。在该系统
中，大量修饰了荧光的“货物”DNA分子的一端
以“拉链”状态结合于“库房”基底上，而“货
物”DNA的另一端则可以与修饰在AFM 针尖上的
“吊车”D N A 以“竖直”状态互补结合(中间留
有未配对区)。当携带了“吊车”序列的 AFM 针
尖“蘸”在“库房”基底上时，“吊车”就会
随机钩住一个“货物”，当针尖抬起时由于“货
物”D N A 与基底单链间的“拉链”被拉开，该
“货物”DNA 就被提取到针尖上暂存起来。另外
有一块目标基底，基底上修饰了可以与“货物”
DNA下半部分整个序列“竖直”互补的单链DNA，
当AFM针尖携带“货物”落到目标基底的指定位
置时，该DNA被下面的单链以更强的力束缚住，当
针尖抬起时它就将与上面的“吊车”分离并将荧光
留在目标基底上，实现粘贴的过程。利用这一方
法，我们反复 5 000余次在目标基底上拼出了NIM
(Nano Initiative Munich)的字样[16]。在此基础上，我
们还将利用相似的技术研究酶联瀑布反应的每一步
骤；研究多选择的配基 -配体系统以建立分级的机
械力传感器。
4　总结与展望
随着原子力显微镜的广泛应用，越来越多的生
物分子已经在单分子水平为人们所研究，其中一些
分子的机械性质使得它们可以作为一个已知的分子
器件用于对其他分子的表征和检测。正如上述三个
例子所提到的，Titin激酶分子自身便可以作为一个
灵敏而“聪明”的机械力感受器或传感器；抗原
抗体结合的性质可以被利用作为一个限制性连接装
置；而DNA甚至可以被当作吊车实现货物的转运。
推而广之，我们还可以利用更多生物大分子的已知
图5　单分子复制和粘贴
A: 利用“吊车”分子与样品分子的竖直结合将“货物”从拉链状结合的 DN A单链上摘取下来；B: 将样品分子运送到
目标基底上，使其与基底上的 DNA单链以竖直状态结合并形成更多的碱基配对将“吊车”分子拉离样品分子，完成粘贴，
并可开始下一次复制粘贴过程。
316 生命科学 第20卷
性质与AFM技术或其他微纳技术相结合，更为简便
而有效地去研究未知分子的性质，研究分子间相互
作用，甚至应用于疾病检测、药物筛选等与人类健
康息息相关的领域。通过这样类似于正反馈的推动
作用，人们将以更快的速度和更高的效率认识微观
世界，探知生命的奥秘，提高改造自然的能力。
[参　考　文　献]
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果蝇脑内多巴胺水平过高诱发雄性果蝇之间的“同性之恋”
求偶行为对于动物物种的繁衍和其对环境的适应都是非常重要的。果蝇的求偶行为是一个复杂的过
程，它包括六个步骤：雄蝇转向雌蝇，拍打，唱求偶歌，舔雌蝇尾端，试图交尾和交尾成功。虽然
求偶行为通常发生在异性之间，但某些基因的突变和异位表达可以诱发雄性果蝇间的求偶行为。多巴胺是
一种重要的神经调质，它参与许多简单行为和复杂行为的调控。多巴胺系统对性行为的调控在哺乳动物中
已得到广泛研究。一些研究曾表明，在果蝇中多巴胺系统可以调控求偶过程中雌蝇的接受性和雄蝇的求偶
域值。2004年 5月，中科院上海生命科学研究院神经科学研究所郭爱克研究员带领其研究小组在以果蝇为
模式动物，研究多巴胺水平在帕金森病的神经基础中扮演的角色时，十分偶然地发现升高多巴胺细胞中多
巴胺水平可以诱发很强的雄性果蝇间的同性求偶行为。四年来该实验室的博士生刘彤等，利用遗传学和药
理学方法调控果蝇多巴胺细胞中多巴胺水平来研究多巴胺水平过高对果蝇雄性之间求偶行为的影响，并发
现高水平多巴胺可以大幅度提高雄性果蝇同性间求偶的倾向，但并没有显著性地影响到对果蝇异性求偶行
为、雄蝇自身的吸引性、短期自发运动活性及普遍的嗅觉和味觉感知。研究表明这种高多巴胺果蝇所表
现的雄性同性求偶行为与其视觉和嗅觉系统对雄蝇的感知改变相关。他们的研究成果说明，多巴胺神经系
统在调控果蝇雄雄求偶行为中起着重要作用。虽然目前我们还不知道这样的结果是否也适用于其他物种，
多巴胺系统紊乱是怎样影响果蝇求偶行为的也仍然是未知问题，但是对果蝇雄雄求偶行为进一步研究将有
助于我们了解和阐释果蝇性行为的精细调控机制。科学家普遍认为多巴胺、五羟色胺和去甲肾上腺素等共
同参于人的许多认知和精神活动。但是，人们不应将在果蝇上的研究结果任意外延到其他动物物种。
该项研究的后期工作是与法国德荣的 Jean-François Ferveur教授领导的实验室合作完成的。此项研究
成果 2008年 5 月 21 日在线发表在 Journal of Neuroscience杂志上，这也是该实验室继 2007年 5月之后，
在该刊发表的第二篇研究论文。
摘自 http://www.sibs.ac.cn
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