全 文 ：第23卷 第8期
2011年8月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 8
Aug., 2011
文章编号：1004-0374(2011)08-0790-06
一氧化氮合酶FMN结合结构域的电子传递及调控机制
研究现状
王瑞勇，张　璐，柴亚辉，吴　静，尹瑜静，常俊标*
(郑州大学化学系，郑州 45000)
摘　要：生物体内 NO是在一氧化氮合酶 (mitric oxide synthase, NOS)催化下生成的，NOS的结构包括 C端
还原酶域和 N端加氧酶域。还原酶域中的 FMN结合结构域既可接受来自 NADPH-FAD结构域的电子，又
可作为提供电子的供体，在调控催化过程中的电子传递方面发挥着重要作用。主要从 FMN结合结构域的
构象平衡及其对不同亚型 NOS的动力学差异的贡献、FMN结合结构域自身的电荷性质以及 NOS中其他结
构域对 FMN结构域的功能调控三个方面进行了论述，以期揭示 NOS独特的电子传递催化机制。
关键词：一氧化氮合酶 ; FMN结合结构域 ; 电子传递
中图分类号：O629.23; Q55 文献标志码：A

Electron transfer and regulation mechanism of FMN subdomain
in nitric oxide synthase
WANG Rui-Yong, ZHANG Lu, CHAI Ya-Hui, WU Jing, YIN Yu-Jing, CHANG Jun-Biao*
(Department of Chemistry, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China)
Abstract: NO synthesis in vivo is catalyzed by nitric oxide synthase. Nitric-oxide synthase is composed of a
C-terminal, flavin-containing reductase domain and an N-terminal, heme-containing oxidase domain. FMN domain
plays a central role by acting as both an electron acceptor (receiving electrons from NADPH-FAD) and an electron
donor (delivering electrons to the NOS heme). In the minireview, the following sections were presented: (i) a three-
state, two-equilibrium model for the conformation of the FMN subdomain, in addition, its contribution to
differences of nitric-oxide synthases I, II, and III from the view of kinetic, (ii) the surface charge of the FMN
subdomain, (iii) how the partner subdomain (C-terminal residue and CaM binding) regulate the conformational
equilibria of the FMN module in NOS. This helps to explain the unique electron transfer and catalytic behaviors of
NOS.
Key words: nitric oxide synthase; FMN domain; electron transfer
收稿日期：2011-03-14； 修回日期：2011-05-17
基金项目：国家自然科学基金项目(20905065)；中国
博士后科学基金项目 (20100471004)；国家杰出青年科
学基金项目(30825043)
*通信作者：E-mail: changjunbiao@zzu.edu.cn
一氧化氮 (NO)作为一种细胞信使或神经递质，
在神经、心血管、呼吸、免疫、消化等系统中具有
重要调节作用，参与众多生理病理过程 [1-3]。通常
痕量 NO可作为生物信号分子参与多种信号传递，
而高浓度 NO与一些疾病有关。因此，在分子水平
上揭示 NO合成过程对促进人类健康研究具有重要
意义。
生物体内 NO是由 L-精氨酸 (L-Arg)和分子氧
在一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase, NOS)催化下，
由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)提
供电子，在黄素单核苷酸 (FMN)、黄素腺嘌呤二核
苷酸 (FAD)及四氢生物蝶呤 (H4B)、血红素 (Heme)
王瑞勇，等：一氧化氮合酶FMN结合结构域的电子传递及调控机制研究现状第8期 791
等因子辅助下生成，反应产物为 L-胍氨酸、NO和
NADP+。NOS的结构可分为加氧酶域和还原酶域 [4]，
N-端加氧酶域由 Heme、H4B、L-Arg结合结构域
组成，其功能是结合底物 L-Arg和维持酶分子的
二聚体的结构，C端还原酶域由 NADPH、FAD、
FMN结合结构域等组成，起传递电子作用。在氧
化酶域和还原酶域之间是一个钙调素 (calmodulin,
CaM)结合结构域。
NOS有三种亚型结构，分别为神经型 NOS
(neuronal NOS, nNOS)、 内皮型 NOS (endothelial NOS,
eNOS)和诱导型 NOS (inducible NOS, iNOS)，通过
调控各区域内电子传递过程而发挥其作用 [5]。三种
NOS具有不同的动力学、生化和生物特性，NOS
独立的加氧酶域和还原酶域能够分别单独表达和纯
化，通常仍保留原来的组成、结构、底物结合特性
以及催化 NO合成的能力，这表明单独表达的 NOS
结构域能够折叠，具有正常功能，可分别作为对象
研究。因此，研究催化过程中的电子转移机制及各
结构域在电子传递中的作用是热点之一 [6]，具有重
要意义。
1　FMN结合结构域的构象平衡及其对不同亚
型NOS的动力学影响
1.1　FMN结合结构域的构象平衡
FMN结合结构域可作为转移至血红素的电子
来源和贮藏处，在 NO合成中既可接受电子，又可
提供电子。NOS还原酶域 (nitric oxide synthase
reductase, NOSr)包括 FMN结合结构域和 NADPH/
FAD结合结构域，两者之间由铰链连接，其中
NADPH/FAD结构域与铁氧化还原蛋白 -NADPH还
原酶 (FNR)高度的相似 [7-8]。在 NOSr中，NADPH
结构域为电子供体，可提供 2个电子，电子从
NADPH结构域转移至 FAD结构域，然后从 FAD
对苯二酚传递至 FMN对苯二酚 (FMNH2)，最后至
血红素或其他外源性电子受体 (如细胞色素 C、细
胞色素 P450等 )。电子传递至加氧酶域后，使血红
素结合氧和 L-Arg，开始 NO的合成过程。
NOSr中 FMN结合结构域有两种状态的构象
平衡 [9-10](图 1)，可决定 FMN结构域与电子供体
(NADPH/FAD结构域 )和电子受体 (如 Heme)相互
作用的可能性及程度。第一种构象为 FMN结合结
构域被屏蔽状态 (图 1, A)，即 FMN 结构域与
NADPH/FAD结构域发生作用，接受 FAD结构域
提供的电子，形成 FMN对苯二酚型。第二种构象
为 FMN结合结构域未被屏蔽状态 (图 1, B)，即
FMN结构域与 NADPH/FAD结构域分离，展现
FMN结构域模块，以使其继续传递电子至 NOS加
氧酶域或细胞色素 C。因此，NOSr的稳态活性在
一定程度上由以上两种构象的位置及动力学平衡决
定，FMN结合结构域的两种构象还可调控 NOSr的
催化活性，直接影响其还原细胞色素 C的活性 [11]。
1.2　FMN结合结构域对不同亚型NOS的动力学影响
在 NO合成过程，NOS的催化行为是复杂、多
步骤的，主要由 Heme的还原速率 (Kr)、FeⅢHeme-
NO复合物的离解速率 (Kd)和 FeⅡHeme-NO的氧化
速率 (Kox)决定
[12]，这三个基本参数反映了三种不同
亚型的 NOS动力学上的最大区别。对 nNOS来说，
较于 Kd和 Kox，其较大的 Kr决定了在稳态 NO合成
中 nNOS主要以 FeⅡ -NO的形式存在；对 eNOS来
说，其较小的 Kr决定了 eNOS主要存在形式为
FeⅢ ；而 iNOS适中的 Kr和 Kox决定了 iNOS的存
在形式为两者并存。NOS的催化过程由两个循环组
A：FMN结合结构域被屏蔽构象，作为电子受体，接受NADPH/FAD结构域提供的电子；B：FMN结合结构域未被屏蔽构
象，作为电子供体，传递电子至血红素或细胞色素C。
图1 NOSr中FMN域的构象平衡[11]
生命科学 第23卷792
成 (图 2)，一为有效循环，包括所有产生 NO的步
骤；二为无效循环，包括NO与Heme结合形成复合物，
Heme-NO复合物的离解或氧化，产生硝酸盐和活性
酶的过程 [13-14]。
电子从 eNOS的 FMN结构域传递到 Heme的
速率比 nNOS或 iNOS小 12.5%~25%，在 CaM存
在或不存在两种条件下，eNOS的细胞色素 C还原
酶活性比 nNOS的小 10%左右。通过交换还原酶
区域来构建 NOS嵌合体酶的研究结果表明，血红
素的还原速率限制了 eNOS的活性，是 NO合成中
的限速步骤 [15]。Santolini等 [16]通过构建动力学模
型，对突变型 nNOS和野生型 nNOS的前稳态和稳
态活性进行了比较，研究了血红素的还原速率如何
影响 nNOS 的催化特征 ( 如 Heme-NO 的形成、
Km,O2、NO的合成速率等 )。Chen和Wu
[17]发现缺
失自抑制片段 (残基 1 165~1 178)的 eNOS与野生
型 eNOS相比，细胞色素 C还原酶活性增强了 2倍，
而 nNOS 的相应活性则减弱。Haque 等 [12] 发现
FMN结构域中的 E762N残基使 FeⅡHeme-NO复合
物的形成降至最少，其较小的 Kr和较大的 Kox导致
了 Km,O2的减小。
2　FMN结合结构域的表面电荷性质研究
FMN结合结构域在 NOS催化电子转移过程中
作为一把“双刃剑”，既可提供电子，又可接受电
子 [18](图 3)。晶体结构研究表明，FMN结合结构域
表面带有负电荷 [19]，而与其相互作用的基团表面带
有正电荷，说明电荷的中和作用是反应发生的重要
FMN结构域表面带负电荷，与其相互作用的NADPH/FAD结构域(图左，FMN被屏蔽构象)和Heme结构域(图右，FMN未被屏
蔽构象)表面均带正电荷，形成电荷配对。
图3 nNOS各结构域间的静电作用及构象平衡[19]
Kr：血红素的还原速率；Kcat1和Kcat2为FeⅡO2分别与L-Arg和NOHA作用的速率，形成的FeⅢNO复合物可释放出NO(Kd)，为
有效循环；FeⅢNO被还原为FeⅡNO (Kr´)，FeⅡNO与O2发生氧化反应(Kox)产生NO3
-和活性酶，为无效循环。
图2 NOS催化动力学模型 [13]
王瑞勇，等：一氧化氮合酶FMN结合结构域的电子传递及调控机制研究现状第8期 793
因素 [18,20-21]。Panda等 [21]利用定点突变方法研究了
在 nNOS中 FMN结构域的 6个负电荷残基的电子
转移和催化机制，发现中和或改变每个残基的电负
性都会改变 NADPH结构域的氧化过程、血红素的
还原速率及 nNOS的细胞色素 C还原酶活性。Tejero
等 [18]采用停流技术和稳态实验研究了在 FMN结构
域与 NOS加氧酶域 (nitric oxide synthase oxygenase,
NOSoxy)传递电子过程中，NOSoxy结构域中的 8
个正电荷残基的作用，发现 Lys423、Lys620、Lys660
这三者间的静电相互作用激活 nNOS中血红素的还
原和 NO的合成，利于 FMN结构域和 NOSoxy结
构域间的电子传递。
在电子传递过程中，FMN主要有三种存在形式：
氧化型 (ox)、一电子还原型 (FMN半醌，sq)和二电
子还原型 (FMN对苯二酚，hq)。因 sq/hq的氧化还
原电位 (-180 mV)低于 ox/sq(+70 mV)[22]，故 FMN
半醌不能还原 Heme，电子只能从 FMN对苯二酚型
传递至 Heme，这是 NO合成中的限速步骤 [13]。而
与 NOS结构及功能均相似的细胞色素 P450BM3，
其 FMN半醌可直接还原 Heme[23]，这种区别可归因
于 NOS中 FMN结合结构域中的残基 Gly和 Asn的
存在。Li等 [24]通过移除 FMN结构域中的 Gly810残
基的方法使 ox/sq的氧化还原电位低于 sq/hq，表明
Gly810残基在增强 nNOSr的 FMN结构域半醌稳定
性方面起着重要的作用。
3　NOS中其他结构域对FMN结合结构域构象
及功能的影响
3.1 C-端残基对FMN结合结构域构象及功能的影响
nNOSr晶体结构清晰表明，C端尾部或其附近
的残基可调控 FMN结构域的构象自由度，通过与
NADPH结合结构域的连接作用使 FMN结合结构
域趋于被屏蔽构象状态。NADPH中的烟碱基团可
与 FAD的异咯嗪环相互作用，其中 2, 5-ADP基团
与 NADPH/FAD结构域中保存的残基具有离子及氢
键作用，是影响 NADPH稳定作用的重要因素。无
CaM存在的 nNOSr中，NADPH结构域可通过阻止
或降低 FMN结构域接受电子的能力，使 nNOSr保
持 FMN结构域被屏蔽的构象，从而抑制电子传递
至细胞色素 C [25]。
Tiso等 [9] 指出 C端残基Arg1400可通过与NADPH
中的 2-磷酸基团相互作用，稳定 FMN结构域使其
处于被屏蔽构象，影响电子传递过程。Konas等 [11]
和 Ilagan等 [7]分别报道了残基 Phe1395的芳香氨基
酸侧链可阻止稳态中 NADP+的释放，便于 FAD与
NADPH中的烟碱基团有效地相互作用，促进氢负
离子转移至 FAD，从而稳定 FMN结构域被屏蔽构
象，抑制细胞色素 C的还原速率。Panda等 [10]采用
定点突变的方法用 Val、Asn、Glu代替 nNOS中的
残基 Asp1393，结果表明 Asp1393的羧酸酯侧链是
nNOS黄素酶依赖于 NADPH结合结构域还原反应
发生的关键性因素。
3.2 CaM结合结构域对FMN结合结构域构象及功能
的影响
CaM结合结构域位于 N-端加氧酶域和 C-端
还原酶域之间，nNOS和 eNOS可在细胞中表达并
与 CaM可逆地结合、分离，其活性受 Ca2+和 CaM
影响。因此，细胞内 Ca2+的水平可调节它们的活性。
与此相反，iNOS与 CaM的结合不受 Ca2+影响，表
达后活性不变。Ca2+结合于 nNOS中心部位的 Ca2+/
CaM，作为变构机制，使 nNOS的 C末端还原酶域
与 N末端加氧酶域发生重排，而促进电子从黄素辅
基传递至血红素。
CaM结合结构域通过影响两个可能的电子转
移步骤：NADPH→ FAD, FAD→ FMN来调控黄素
辅基到血红素之间的电子传递 [26]。CaM可减少电
子从NOS黄素酶域至外源性电子受体 (细胞色素C)
的抑制程度，其结合于 NOS可使电子从 FMN传递
至血红素，从而引起 NO的合成反应，这些特征在
NOS独特的调控机制中起着重要作用。
Craig 等 [25]的研究表明，还原酶域由于构象被
锁定不能有效地传递电子，CaM改变 FMN结构域
的空间位置从而利于 FMN结构域未被屏蔽构象的
稳定，有效地促进电子转移至细胞色素 C。Fu等 [27]
的研究表明，在 CaM存在下，FADH2-FMN和 FADH·-
FMNH·的电子传递很快；而无 CaM时，半醌的形
成速率慢，说明了 Ca2+/CaM促进了 FAD结构域至
FMN结构域间的电子传递。Tejero等 [28]对 FMN结
构域的 Arg752和 CaM结构域的 Glu47残基突变后得
到的 nNOS作了研究，结果表明 Arg752-Glu47的相
互作用是 CaM能够活化 nNOS的重要特征，CaM
影响 FMN结构域与 NADPH/FAD结构域、Heme
结构域之间的电子传递。
4　结语
FMN结合结构域在电子传递和 NO合成中扮
演着重要角色 [29-30]，电子通过其在同型二聚体内传
递，也可由 FMN结合结构域直接传递到外源性电
生命科学 第23卷794
子受体，可通过屏蔽和去屏蔽两种构象调控电子传
递。FMN结合结构域可影响三种不同亚型 NOS的
动力学参数，在电子传递过程中 FMN结合结构域
的三种存在形式及表面电荷性质则通过电化学手段
进行研究。C端残基和 CaM结构域对 FMN 结构域
都有重要影响，表现为 C端残基可通与 NADPH的
连接，从而稳定 FMN结构域被屏蔽构象，抑制细
胞色素 C的还原酶活性；CaM结构域则起相反的
作用，促进电子从 FMN结构域传递至血红素 (或
细胞色素 C)，引发 NO的合成反应。FMN结合结
构域的电子传递调控机制及在 NOS中发挥怎样的
作用仍将是以后研究热点，对其进行研究可为全方
位认知 NOS复杂的催化行为和 NO合成的反应机
理提供理论基础，具有重要意义。
[参　考　文　献]
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