全 文 ：第 １４卷第 １期
２０１６年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０１􀆰 ００２
收稿日期：２０１５－０２－０４
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢＡ００８０４）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２２１０１）；江苏高校优势学
科建设工程
作者简介：程书兰（１９８９—），女，江苏南京人，研究方向：基因工程与生物催化；严　 明（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙａｎｍｉｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
醇脱氢酶的纯化、酶学性质及其不对称催化
程书兰，魏　 淼，许　 琳，严　 明
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：为了研究木兰假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａ）中的醇脱氢酶（ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ） ３（ＡＤＨ３）的突变酶
（ＡＩＤＩ）的纯化、酶学性质以及不对称还原合成（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯的能力。 首先对 ＡＩＤＩ进行
（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀、透析以及 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析。 将纯化后的酶用于最适温度、ｐＨ、有机溶剂耐受等酶学
性质的研究，同时考察底物浓度对催化效率的影响。 结果发现：通过纯化获得了电泳纯的 ＡＩＤＩ。 酶的最适温度为
４０ ℃，最适 ｐＨ为 ７􀆰 ０。 该醇脱氢酶的热稳定性较好，对环境 ｐＨ的变化不敏感，在 ｐＨ ４～８之间较为稳定。 部分金
属离子对该酶的活性具有抑制作用，特别是 Ｆｅ２＋对其具有显著抑制作用。 在 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ７􀆰 ０的 Ｎａ３ＰＯ４ 缓冲液
中，底物质量浓度为 ５０ ｇ ／ Ｌ，３０ ℃转化 ２４ ｈ，转化率能达到 ９４％。
关键词：醇脱氢酶；（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯；酶学性质
中图分类号：Ｑ７８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０１－０００８－０６
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃａｔａｌｙｓｉｓ
ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｌａｎ，ＷＥＩ Ｍｉａｏ，ＸＵ Ｌｉｎ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｍｕｔａｎｔ（ＡＩＤＩ） ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ３ （ＡＤＨ３） ｗａｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａ．
Ｗｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ＡＩＤＩ ｆｒｏｍ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｕｄｉｅｄ
ｄｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｒ⁃ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｔｏｗａｒｄｓ （ ３Ｒ， ５Ｓ ）⁃６⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３， ５⁃
ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ． ＡＩＤＩ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ｄｉａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ａｎｉｏｎ
ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． ＡＩＤＩ ｗｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｏｒｇａｎｉｃ
ｓｏｌｖｅｎｔｓ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ａｎｄ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＡＩＤＩ ｗｅｒｅ ７􀆰 ０ ａｎｄ ４０ ℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ＡＩＤＩ ｉｓ ａ ｈｅａｔ⁃ｓｔａｂｌｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ
ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐＨ． Ｆｅ２＋ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＩＤＩ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ３０ ℃， ｐＨ ７􀆰 ０ ｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ， ９４％ ｏｆ ５０ ｇ ／ Ｌ ｔｅｒｔ⁃ｂｕｔｙｌ （ Ｓ）⁃６⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃５⁃
ｈｙｄｒｏｘｙ⁃３⁃ｏｘｏ⁃ｈｅｘａｎｏａｔｅ ｗａｓ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｔｏ （３Ｒ，５Ｓ）⁃６⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３，５⁃ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ ｉｎ ２４ ｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；（３Ｒ，５Ｓ）⁃６⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３，５⁃ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ；ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
　 　 （３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯是合
成阿托伐他汀钙的双手性前体物质，而他汀类药物在
治疗胆固醇及心脑血管疾病方面具有广泛的应
用［１－２］。 目前，合成（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己
酸叔丁酯的主要方法有化学法和生物法。 孙丰来［３］
和张龑等［４］用化学法合成了（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５
二羟基己酸叔丁酯，但存在工艺条件苛刻或催化剂昂
贵等因素，不利于规模化生产。 Ｓｕｎ 等［５］利用固定化
的 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ催化合成（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯
３，５ 二羟基己酸叔丁酯，在底物低于 ５０ ｇ ／ Ｌ时，转化
率能达到 １００％，虽然催化效率较高但固定化成本也
较高。 吴坚平等［６］将醇脱氢酶 ＡｄｈＲ、葡萄糖脱氢酶
ＧｄｈＢＳ和羰基还原酶 Ｃｒ在大肠杆菌 ＢＬ２１中共表达，
工程菌在催化过程中，葡萄糖以及异丙醇的脱氢反应
为催化反应提供了 Ｈ＋和能量，不需要额外添加辅酶，
催化获得的产物转化率和 ｅ􀆰 ｅ．值＞９９％。
目前生物法合成（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基
己酸叔丁酯大部分是用全细胞来催化，而全细胞催
化往往副产物较多，催化效率低。 酶催化法因其具
有反应条件温和、立体选择性强、副反应少、产物比
较单一、收率高、光学纯度高等特点，被广泛用于不
对称合成医药、化工等不同领域［７ ８］，用游离酶催化
合成（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯还未
见报道。 醇脱氢酶 （ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＡＤＨ，
ＥＣ１􀆰 １􀆰 １􀆰 １）又称为还原酶（ｒｅｄｕｃｔａｓｅ），可以催化醇
生成酮或醛及其可逆反应。 生物体内绝大多数的
氧化还原反应都需要脱氢酶或氧化酶的参与，是重
要的生物催化剂，催化还原许多在生理和药理上有
活性的羰基化合物［９］。 然而这类酶在催化反应的
同时通常需要消耗一定量的辅酶 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ作为电
子传递体［１０］，并且大多只能以 ＮＡＤＰＨ 作为辅
酶［１１］，额外添加的 ＮＡＤＰＨ 价格昂贵，不适用于工
业生产，而 ＮＡＤＨ 价格较为便宜。 因此本实验选用
了经过定点突变的 ＡＤＨ３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＢ９１６６７􀆰 １），
辅酶依赖型由完全依赖 ＮＡＤＰＨ改为 ＮＡＤＨ。
本研究中，笔者将来源于木兰假丝酵母中的
ＡＤＨ３的突变酶 ＡＩＤＩ纯化，分析其酶学性质并应用
于催化（Ｓ） ６ 氯 ５ 羟基 ３ 羰基己酸叔丁酯
（Ｃ２）合成（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁
酯，以期为进一步研究醇脱氢酶的结构与功能的关
系以及手性药物的生物合成奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 试剂与菌株
标准蛋白质，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司；抗生素及其余试
剂，生工生物工程（上海）股份有限公司。
（Ｓ） ６ 氯 ５ 羟基 ３ 羰基己酸叔丁酯和
（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯由浙江海
正药业有限公司馈赠。
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ２４ａ ＡＤＨ３ 由笔者所在实验
室成员构建并突变为 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ２４ａ ＡＩＤＩ。
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ／ ｐＥＴ２２ｂ ＢｍＧＤＨ由笔者所在实
验室构建，葡萄糖脱氢酶 ＢｍＧＤＨ 序列来自于巨大
芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ ２８９４。 葡萄糖脱
氢酶（ＧＤＨ）能将辅底物葡萄糖转化为葡萄糖酸并
将氧化型辅酶 ＮＡＤ＋转化为还原型辅酶 ＮＡＤＨ，实现
辅酶的循环再生。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
ＬＢ培养基（ ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０，ＮａＣｌ １０，酵母
粉 ５０。 用于活化和培养大肠杆菌。 １２１ ℃高压湿热
灭菌 １５ ｍｉｎ。
ＴＢ 自诱导培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 ２５，酵母粉
１５，ＮａＣｌ １０，乳糖 ３，葡萄糖 ２。 ｐＨ ７􀆰 ０。 １１０ ℃高压
湿热灭菌 １５ ｍｉｎ。 用于菌的发酵和酶的诱导表达。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 定点突变方法
突变位点为野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中
第 ３５位的丝氨酸（Ｓｅｒ）突变为天冬氨酸（Ａｓｐ），且
第 ３６位的精氨酸（Ａｒｇ）突变为异亮氨酸（ Ｉｌｅ）。 定
点突变引物 １：ＣＡＧＴＧＴＴＡＣＧＣＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡ⁃
ＧＴＧＴＴＧ， 引物 ２：ＣＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣ⁃
ＧＴＡＡＣＡＣＴＧ。 定点突变采用 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 公司的
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ⁃ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ进
行突变株的构建，突变所采用的 ＰＣＲ 模板为
ｐＥＴ２４ａ ＡＤＨ３。 加入 Ｄｐｎ Ｉ 消化 ＰＣＲ 反应中的双
链模板和杂和环中的模板链，转化到 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ 感
受态细胞中。
１􀆰 ２􀆰 ２　 菌种的自诱导培养及发酵
菌种活化：取 １００ μＬ甘油菌均匀涂布在带抗性
的 ＬＢ固体平板上，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ７～８ ｈ。 挑
取单菌落转接至装有 ５ ｍＬ 加有抗性的 ＬＢ 液体培
养基的摇管中继续活化 ７～８ ｈ。
种子液制备：将活化好的菌以 ２％的接种量转
接至装有 １００ ｍＬ ＬＢ液体培养基的 ５００ ｍＬ摇瓶中，
３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ７～８ ｈ。
发酵培养：种子液以 ３％的接种量接种到加有
抗性的 ＴＢ培养基的发酵罐中，３０ ℃发酵 １５ ｈ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 粗酶制备和酶活测定
将发酵液 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，去上清，用
９　 第 １期 程书兰等：醇脱氢酶的纯化、酶学性质及其不对称催化
０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ７􀆰 ０的 Ｎａ３ＰＯ４ 缓冲液洗菌 ２次，缓冲
重悬并进行高压破碎，破碎后 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０
ｍｉｎ。 上清即为获得的粗酶液。
ＡＩＤＩ酶活测定体系：１６８ μＬ ｐＨ ７􀆰 ０ Ｎａ３ＰＯ４ 缓冲
液中加入终浓度为 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｃ２， ２ μＬ １００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤＨ，最后加入 １０ μＬ 粗酶液启动反应，３０
℃、３４０ ｎｍ 处测定吸光值的下降（测 １８０ ｓ）。 在 ３０
℃、ｐＨ ７􀆰 ０ 条件下，每分钟氧化 １ μｍｏｌ ＮＡＤＨ 或
ＮＡＤＰＨ 所需的酶量定义为 １ 个羰基还原酶的酶活
单位。
１􀆰 ２􀆰 ４　 酶的纯化
１）（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀　 将酶液在冰水浴中持续搅
拌的同时缓慢加入饱和（ＮＨ４） ２ＳＯ４溶液至终质量浓
度为 ３０％，磁力搅拌约 ０􀆰 ５ ｈ，４ ℃冰箱中静置 ２ ｈ。
８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４ ℃离心 １５ ｍｉｎ，弃去沉淀，将上清液
继续加饱和（ＮＨ４） ２ＳＯ４溶液至终浓度为 ６０％，磁力
搅拌约 ０􀆰 ５ ｈ，４ ℃静置过夜，再次 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４ ℃
离心 １５ ｍｉｎ，弃去上清液，将沉淀用适量 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ｐＨ７􀆰 ０磷酸盐缓冲液复溶。 复溶酶液装入透析袋
中，用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ７􀆰 ０ 的磷酸盐缓冲液透析 １２
ｈ，脱去酶液中大量的（ＮＨ４） ２ＳＯ４。
２） ＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 阴离子交换层
析［１２－１３］ 　 将 ＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ阴离子交换柱（２􀆰 ６
ｃｍ×１６ ｃｍ）首先用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ７􀆰 ０ 的磷酸盐缓
冲平衡，待基线走平后进样，上样流速为 ２ ｍＬ ／ ｍｉｎ。
上完样后用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ７􀆰 ０ 的磷酸盐缓冲液洗
脱，然后用 ０～０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ梯度洗脱。
１􀆰 ２􀆰 ５　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分析和蛋白含量测定
蛋白质含量测定采用常规的 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［１４］。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳按照文献［１５］进行。 ９５ ℃水
浴 ５ ｍｉｎ后上样 ２０ μＬ，进行电泳，分析蛋白的表达
情况。
１􀆰 ２􀆰 ６　 酶的最适温度及温度稳定性
反应体系不变，选择不同温度（２５、３０、３５、４０ 和
４５ ℃）进行反应，以确定最适温度。 然后，分别在不
同温度（２０、２５、３０、３５、４０、４５ 和 ５０ ℃）对酶进行孵
育 ０􀆰 ５ ｈ，冷却至室温，以未处理的酶液酶活为
１００％，在最适温度下测定酶的残余活力，以考察酶
的温度稳定性。
１􀆰 ２􀆰 ７　 酶的最适 ｐＨ及 ｐＨ稳定性
配制 ｐＨ 为 ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ 和 １２ 的
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲溶液。 反应体系不变，在最适温度下
通过测定不同 ｐＨ的 Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲中的酶活，确定
酶的最适 ｐＨ。 将重组酶在不同 ｐＨ 的缓冲液中孵
育 ６ ｈ，在最适条件下，以未处理酶液的酶活为
１００％，测定酶的残余活力，以考察酶的 ｐＨ稳定性。
１􀆰 ２􀆰 ８　 有机溶剂对酶活的影响及有机溶剂稳定性
在 ２００ μＬ测定体系中加入终浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
的 ＮＡＤＨ、２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的底物 Ｃ２、体积分数为 ５％的
有机溶剂，用缓冲补足 １８０ μＬ，最后加 ２０ μＬ 酶液
启动反应，以对照组不加有机溶剂的酶活为 １００％，
测定残余活力，考察有机溶剂对酶活的影响。
反应体系中加入缓冲、酶和体积分数为 ５％的
有机溶剂，室温放置 １ ｈ，再加入底物 Ｃ２ 和 ＮＡＤＨ
启动反应。 对照组体系中加入缓冲和酶，室温放置
１ ｈ，再加入 Ｃ２ 和 ＮＡＤＨ 测定酶的活力。 以对照组
的酶活为 １００％，测定残余活力，考察酶的有机溶剂
稳定性。
１􀆰 ２􀆰 ９　 金属离子对酶活的影响
在反应体系中加入 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的不同金属离子
（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｓｒ２＋、
Ｋ＋、Ｂａ２＋和 Ｌｉ＋），以不加金属离子的反应体系中酶液
的酶活为 １００％ 在最适条件下测定酶的相对活力。
１􀆰 ２􀆰 １０　 酶催化制备（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基
己酸叔丁酯
ＡＩＤＩ ２６􀆰 ７ Ｕ ／ ｍＬ，ＧＤＨ ２６􀆰 ９ Ｕ ／ ｍＬ，ＮＡＤ＋ ０􀆰 ２
ｍｍ ／ Ｌ， 底物 Ｃ２（１０、３０、５０、７５和 １００ ｇ ／ Ｌ）。 葡萄糖
与底物 Ｃ２质量比为 ４ ∶ １，０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ７􀆰 ０ Ｎａ３ＰＯ４
缓冲补足 ２５ ｍＬ。 在 ３０ ℃、 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ条件下反应。
每小时用 ＮａＯＨ调 ｐＨ至 ７􀆰 ０。 每小时取样 ５００ μＬ，
加 ５００ μＬ醋酸丁酯，漩涡混匀，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １
ｍｉｎ，取上清至另一干净离心管中待检测。
１􀆰 ２􀆰 １１　 分析方法
采用 Ａｇｉｌｅｎｔ ７８２０Ａ气相色谱仪测定底物和产
物浓度。 分析条件：ＦＦＡＰ 聚乙二醇毛细管柱（３０
ｍ×０􀆰 ３２ ｍｍ×１ μｍ）；载气 Ｎ２；进样量 ２ μＬ；梯度
升温（初始温度 １３０ ℃，保持 ５ ｍｉｎ；以 １５ ℃ ／ ｍｉｎ
程序升温至 １８０ ℃，保持 １３ ｍｉｎ） ；氢离子火焰检
测器。 底物和产物的出峰时间分别为 ４􀆰 ４ ｍｉｎ 和
１７􀆰 ９ ｍｉｎ。
分析产物的差向异构体的方法：使用色谱柱
ＣＰ Ｃｈｉｒａｓｉｌ Ｄｅｘ ＣＢ（２５ ｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ），载
气为高纯 Ｎ２，分流比 １ ∶ ５０；进样室和检测室温度
２５０ ℃。 （３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯
和（３Ｓ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯出峰时
间分别为 １６􀆰 ２ ｍｉｎ和 １６􀆰 ４ ｍｉｎ。
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＡＩＤＩ的诱导表达和酶活测定
ＴＢ 自诱导培养基诱导表达重组大肠杆菌
ＢＬ２１ ／ ｐＥＴ２４ａ ＡＩＤＩ １５ ｈ，高压破碎、离心获得 ＡＩＤＩ
粗酶液，ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳分析其诱导表达情况，结
果见图 １。 测定其酶活，结果见表 １。 由图 １ 可知，
在 ２􀆰 ５０×１０４左右有明显的条带，与预期结果一致。
由表 １可知，突变酶 ＡＩＤＩ的辅酶依赖型与野生酶相
比发生了彻底的改变，由完全依赖 ＮＡＤＰＨ 改为完
全依赖 ＮＡＤＨ，且催化活性达到野生酶的 ３倍左右。
Ｍ—标准蛋白质；１—重组菌粗酶液；２—对照空菌酶液
图 １　 ＡＩＤＩ重组蛋白的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳图
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＡＩＤＩ
表 １　 醇脱氢酶 ＡＤＨ３及其突变酶 ＡＩＤＩ的活性测定
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＡＤＨ３ ａｎｄ ＡＩＤＩ
ＡＤＨ 辅因子 比酶活 ／ （Ｕ·ｍｇ－１）
Ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ ＮＡＤＰＨ ０􀆰 ０１１
ＡＩＤＩ ＮＡＤＰＨ —
Ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ ＮＡＤＨ —
ＡＩＤＩ ＮＡＤＨ ０􀆰 ０３５
２􀆰 ２　 突变酶 ＡＩＤＩ的分离纯化
菌体经过高压破碎后得到粗酶，经过（ＮＨ４）２ＳＯ４
分级沉淀、透析、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 离子交换层析后
的酶液用 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 检测。 结果见图 ２。 由于
（ＮＨ４）２ＳＯ４沉淀过程中 ＮＨ
＋
４ 对酶活有影响，因此分
级沉淀过程中无法测 ＡＩＤＩ 的酶活，但随后的透析将
ＮＨ＋４ 去掉，酶又恢复原来的活力。 纯化后的酶液比活
达到 ０􀆰 １０３ Ｕ ／ ｍｇ，比粗酶液高 ２􀆰 ８倍，结果见表 ２。
表 ２　 ＡＩＤＩ的纯化结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＡＩＤＩ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
步骤 ｍ（总蛋白） ／ｍｇ
总酶活 ／
Ｕ
比酶活 ／
（Ｕ·ｍｇ－１）
粗酶 ５２５ １９􀆰 ５ ０􀆰 ０３７
渗透 ３３０ １０􀆰 ５ ０􀆰 ０３９
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ５８􀆰 ５ ７􀆰 ０５ ０􀆰 １０３
Ｍ—标准蛋白质；１—重组菌粗酶液；２—３０％～６０％
（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀酶液；３—ＤＥＡＥ 柱纯化酶液
图 ２　 ＡＩＤＩ蛋白纯化 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＩ
２􀆰 ３　 突变酶 ＡＩＤＩ酶的最适温度及热稳定性
图 ３是突变酶 ＡＩＤＩ 酶的最适温度曲线。 由图
３可知：该醇脱氢酶催化还原反应的最适温度为 ４０
℃。 当温度高于 ４０ ℃后，酶活力显著下降。 在不同
温度下将目的酶溶液保温 ０􀆰 ５ ｈ 后测定其残余活
力。 结果显示 ２５～４０ ℃保温的酶活损失不大，可保
持原有活力的 ８０％以上。 但当温度高于 ４０ ℃时，
酶蛋白的失活较为严重；在 ５０ ℃下保温 ０􀆰 ５ ｈ，酶蛋
白的还原活力几乎全部丧失（图 ４）。
图 ３　 温度对 ＡＩＤＩ的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＡＩＤＩ
２􀆰 ４　 突变酶 ＡＩＤＩ的最适 ｐＨ及 ｐＨ稳定性
在不同 ｐＨ条件下测定纯化后酶液的活力，结果
１１　 第 １期 程书兰等：醇脱氢酶的纯化、酶学性质及其不对称催化
如图 ５ 所示。 由图 ５ 可知：该酶的最适 ｐＨ 为 ７􀆰 ０。
ｐＨ可影响酶的构象以及相关基团的解离状态，从而
影响了酶活力。 酶的最适 ｐＨ不等于最稳定的 ｐＨ，因
此需考察不同 ｐＨ条件下酶的稳定性。
图 ４　 ＡＩＤＩ的热稳定性曲线
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＡＩＤＩ
图 ５　 ｐＨ对 ＡＩＤＩ的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＡＩＤＩ
将酶在不同 ｐＨ的反应体系中温浴 ０􀆰 ５ ｈ 后测
定酶的残余活力，结果见图 ６。 由图 ６ 可发现该酶
具有较广的 ｐＨ稳定范围，在 ｐＨ ４ ～ ８ 时，室温放置
６ ｈ后仍能保持 ８０％以上的酶活。
图 ６　 ＡＩＤＩ的 ｐＨ稳定性曲线
Ｆｉｇ􀆰 ６　 ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＡＩＤＩ
２􀆰 ５　 有机溶剂对酶活的影响及有机溶剂稳定性
为了研究有机溶剂对酶活的影响，在测定体系
中加入 ５％的有机溶剂，测定 ＡＩＤＩ的残余活力，结果
见图 ７。 由图 ７ 可知，甲醇和正己烷对酶活有激活
作用，乙酸乙酯和 ＤＭＳＯ 对酶活影响不大，其他有
机溶剂对酶活均有不同程度的抑制作用。 有机溶
剂会影响酶的稳定性，因此在测定体系中加入 ５％
的有机溶剂，室温放置 １ ｈ，结果见图 ８。 由图 ８ 可
知： ＡＩＤＩ 在 ５％ 的醋酸丁酯、甲醇、乙酸乙酯、
ＤＭＳＯ、正己烷中均具有良好的稳定性，室温放置 １
ｈ可以保持 ９０％以上的酶活，为进一步研究酶的双
相催化以及底物的分离萃取奠定基础。
图 ７　 有机溶剂对 ＡＩＤＩ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｎ ＡＩＤＩ ａｃｔｉｖｉｔｙ
图 ８　 ＡＩＤＩ的有机溶剂耐受性
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＡＩＤＩ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２􀆰 ６　 金属离子对酶活的影响
微生物中的许多氧化还原酶在催化氧化还原
反应时需要金属离子的参与，有些金属离子对氧化
还原酶具有一定的激活或者抑制作用。 由表 ３ 可
知，添加 Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋使 ＡＩＤＩ的酶活明显下降，而添加
Ｍｇ２＋和 Ｍｎ２＋对酶活有一定的激活作用。
２􀆰 ７　 底物浓度对 ＡＩＤＩ催化效率的影响
将 ＡＩＤＩ 在不同的底物浓度条件下催化合成
（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁酯，结果见图
９。 由图 ９可知：底物浓度越高，反应速率越慢。 原因
２１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
可能是该催化反应过程存在底物抑制。 因此，从经济
方面考虑，将底物质量浓度定为 ５０ ｇ ／ Ｌ比较合适。
表 ３　 金属离子对 ＡＩＤＩ酶活力的影响
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＡＩＤＩ
离子种类 ｃ ／ （ｍｍｏｌ·Ｌ－１） 相对酶活 ／ ％
空白 — １００
Ｃａ２＋ １ ８３
Ｃｏ２＋ １ ８９
Ｃｕ２＋ １ ６５
Ｆｅ２＋ １ ６１
Ｍｇ２＋ １ １１１
Ｍｎ２＋ １ １２２
Ｎｉ２＋ １ ７８
Ｚｎ２＋ １ ９４
Ｂａ２＋ １ １００
Ｌｉ＋ １ １００
Ｓｒ２＋ １ ８３
Ｋ＋ １ ８０
图 ９　 （Ｓ） ６ 氯 ５ 羟基 ３ 羰基己酸叔丁酯的催化
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｏｆ （Ｓ） ⁃６⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃５⁃
ｈｙｄｒｏｘｙ⁃３⁃ｏｘｏ⁃ｈｅｘａｎｏａｔｅ ｂｙ ＡＩＤＩ
３　 结论
将木兰假丝酵母中的 ＡＤＨ３的突变酶 ＡＩＤＩ进行
纯化，获得了电泳纯的蛋白。 其最适温度为４０ ℃，酶
液在 ２５～４０ ℃中保温 ０􀆰 ５ ｈ，能保持 ８０％以上的活力。
酶的最适 ｐＨ为 ７􀆰 ０，ｐＨ稳定性较好，在 ｐＨ ４～８的缓
冲液中，室温放置 ６ ｈ能保持 ８０％以上的酶活。 Ｆｅ２＋、
Ｃｕ２＋对酶活有抑制作用，Ｍｇ２＋和 Ｍｎ２＋对酶活有一定的
激活作用。 ＡＩＤＩ 对醋酸丁酯、甲醇、乙酸乙酯、
ＤＭＳＯ、正己烷有良好的耐受性。 ＡＩＤＩ 能够用于不对
称催化合成（３Ｒ，５Ｓ） ６ 氯 ３，５ 二羟基己酸叔丁
酯，当底物为 ５０ ｇ ／ Ｌ时，２４ ｈ转化率能达到 ９４％。
来源于木兰假丝酵母中的 ＡＤＨ３ 的突变酶在催
化手性药物的过程中伴随着ＮＡＤＨ的消耗，可以与葡
萄糖脱氢酶耦联形成辅酶循环再生体系，构建高效的
辅酶循环系统。 在催化实验中，手性药物中间体通常
不溶于水，可以在水相催化体系中加入助溶剂来增加
底物的溶解度以提高催化效率，并且利于后期产物的
萃取和分离。 而实验中关于有机溶剂耐受性的研究
可以为助溶剂的选择提供有力的参考。
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２０１２：１６５０⁃１６５５．
（责任编辑　 荀志金）
３１　 第 １期 程书兰等：醇脱氢酶的纯化、酶学性质及其不对称催化