全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 2期
2008年 4月
Vol. 20, No. 2
Apr., 2008
Smad4介导转化生长因子 -β信号调节骨骼发育
和稳态维持的功能
杨　晓
(军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室，北京 100071)
摘　要：转化生长因子 -β(TGF-β)是一个包括数十种 TGF-βs、骨形态发生蛋白(BMPs)等配体在内的生长
因子超家族，在哺乳动物整体和组织器官发育过程中具有广泛而重要的功能。Smad4是细胞内 TGF-β
信号通路的核心信号转导分子。为了深入研究 Smad4介导的 TGF-β信号在骨骼发育过程中的生理功能，
我们利用转基因技术研制了软骨细胞、肥大型软骨细胞和成骨细胞分别特异性表达Cre重组酶的转基因
小鼠，利用条件基因敲除技术研制了不同类型骨骼细胞 Smad4基因敲除的小鼠模型。表型分析结果揭
示了 Smad4在软骨细胞增殖和分化、骨重塑以及稳态维持过程中的功能以及相关的分子机制，为理解
人类相关骨骼疾病的发生及其机理提供了新的线索。
关键词：S m a d 4；软骨内成骨；骨重塑；条件基因敲除
中图分类号：R318；Q983.3　　文献标识码：A
The function of Smad4 mediated transforming growth factor-β in regulating
bone development and maintaining bone homeostasis
YANG Xiao
(Genetic Laboratory of Development and Diseases, Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071,China)
Abstract: Transforming growth factor-β (TGF-β) is a large family of cytokines consisting of several tens of ligands
including TGF-βs and bone morphogenetic proteins (BMPs). It plays very important and diverse functions during
mammalian development and organogenesis. Smad4 is a central intracellular mediator of TGF-β signaling. To
further study the physiological function of Smad4 mediated TGF-β signals in bone development, we have
generated bone tissue specific Cre transgenic mice which expressed the Cre recombinase specifically in
chondrocyte, hypertrophic chondrocyte or osteoblast respectively, and bone tissue specific Smad4 gene
knockout mice. Phenotype analyses revealed the functions of Smad4 and related molecular mechanisms in
chondrocyte proliferation and differentiation, bone remodeling and homeostasis, and provided new clues for
understanding mechanisms underlying related human skeletal diseases.
Key words: Smad4; endochondral ossification; bone remodeling; conditional gene knockout
文章编号 ：1004-0374(2008)02-0165-06
收稿日期：2007-12-14；修回日期：2008-01-25
基金项目：国家自然科学基金（30 430 35 0）
通讯作者：E-mail: yangx@nic.bmi.ac.cn
1　研究的意义
骨骼是由软骨组织和骨组织为主构成的重要器
官，是人体的支架，具有支持软组织、参与身体
运动、保护机体重要器官以及保有骨髓等重要的功
能。骨骼是一个非常复杂的系统，人体中有二百多
块大小和形状不等的骨骼分布在身体各处。这些骨
骼的正常发育和维持涉及发育过程中的图式形成、
细胞分化和骨重塑(bone remodeling)的过程。各种
不同类型的细胞协调生长和分化以使骨骼具有一定
的力度和弹性、及时修复并不导致过度生长[1]。骨
·基金动态 ·
166 生命科学 第20卷
骼系统的发育异常导致许多疾病，如出生缺陷、遗
传性骨骼疾病、骨质疏松、骨关节炎和风湿性关节
炎等。深入研究骨骼发育和相关疾病发生的分子机
制对于这些疾病的早期诊断、预防及治疗具有重要
的意义。
骨骼的形成主要通过膜内成骨(intramembranous
ossification)及软骨内成骨(endochondral ossification)
两种方式[2]。软骨内成骨指间充质细胞通过聚集和
分化形成软骨细胞，而后在软骨模板上形成骨的过
程。这些软骨细胞经过程序性的细胞增生、成熟、
肥大性分化和凋亡的过程，最后被骨组织所取代。
四肢骨和脊椎骨是通过软骨内成骨形成的。体内的
扁骨如颅骨大多是通过膜内成骨的方式形成的，由
间充质细胞直接分化为成骨细胞。骨形成后，通过
由破骨细胞骨吸收及成骨细胞骨形成循环而构成的
骨重塑过程保持骨的更新。由于骨骼组织的特殊结
构和实验手段的限制，过去对骨骼发育及其功能的
分子基础和病理生理学认识十分贫乏。由于影响骨
骼发育和骨骼生理功能的基因在小鼠和人类中高度
保守，因此，小鼠可以作为一种理想的动物模型。
在过去的十多年中，对自发变异个体的遗传学分析
尤其是转基因和基因敲除遗传修饰小鼠模型的应
用，深刻地改变了人类对骨生理学的认识[1]。
组成骨骼的细胞类型主要有三种：软骨细胞、
成骨细胞和破骨细胞。软骨细胞和成骨细胞由中胚
层来源的共同祖细胞分化而成。软骨细胞谱系的细
胞将分化成静息型、增殖型和肥大型软骨细胞并在
长骨生长板中依次呈柱状排列。在关节软骨部位，
软骨细胞保持未分化的静息状态。影响生长板发育
的信号通路和分子包括 Ihh/PTHrP信号通路、成纤
维细胞生长因子(FGFs)、骨形态发生蛋白(BMPs)、
转化生长因子 -β(TGF-βs)、Sox9和 Runx2等[2-6]。
Ihh/PTHrP信号通路在调节软骨细胞增殖和分化过程
中的重要作用已被许多体内和体外的实验所证实。
Ihh由肥大前区软骨细胞表达。肥大前区软骨细胞
分泌的 Ihh刺激软骨细胞的增殖、促进软骨膜和增
殖区BMPs的表达。Ihh通过一种未知的机制促进关
节周围区软骨细胞分泌 PTHrP分子，PTHrP可抑制
肥大前区软骨细胞进行终末肥大性分化。当肥大前
区软骨细胞达到一定数量，在空间分布上超出
PTHrP的作用范围时，便开始进行肥大性分化[7]。
目前，控制生长板不同类型软骨细胞排列方式的分
子机制以及生长板调节骨骼纵向生长的分子机制均
不清楚，不同信号通路间的相互作用及其机制也有
待于进一步深入的研究。
对控制成骨细胞分化的基因了解甚少。有限的
研究结果表明，成骨细胞的增殖和分化过程是由不
同的基因控制的，如 Runx2/Cbfa1和Osterix控制成
骨细胞分化，而LRP5信号通路控制成骨细胞增殖[8]。
一定有其他的基因和信号通路调控成骨细胞的分化
和增殖过程，对这些基因和信号通路的深入研究有
可能找到促进成骨细胞活性使骨形成增加，从而有
效治疗骨质疏松的方法。通过基因敲除研究发现了
许多控制破骨细胞分化的转录因子，包括 PU1、c-
fos、NF-κB和Mitf[9]等。通过基因敲除研究还发现
了破骨细胞分化的抑制分子，被称为骨保护蛋白
(osteoprotegerin，OPG)的一种可溶性肿瘤坏死因子
受体。OPG通过阻断 NF-κB配体的受体激活分子
(RANKL)与细胞膜受体(RANK)结合使破骨细胞减
少，从而使骨密度增加。RANKL通过 c-Fos促进
破骨细胞的分化，同时也诱导 IFN-β反馈抑制 c-fos
的表达[10]。RANKL/RANK/OPG信号通路在调节成
骨细胞和破骨细胞的相互作用中具有重要功能，一
些促进骨吸收的因素如甲状旁腺激素、维生素 D3
等和一些抑制骨吸收的因素，如雌激素、降钙素等
都具有调节该信号通路的作用。所有这些研究完全
改变了对骨吸收过程的理解，并对骨质疏松的治疗
产生了深远的影响。
TGF-β超家族分子包括TGF-βs和BMPs等许多
成员，在哺乳动物整体和组织器官发育过程中具有
广泛而重要的功能[11]。骨骼系统是体内 TGF-βs和
BMPs储量最高的器官。TGF-β超家族分子通过细
胞膜表面Ⅰ和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体进行信号
转导。Smad蛋白是其胞浆信号转导分子，包括受
体调节型 Sma d(Sma d1、2、3、5、8)、通用型
Smad(Smad4)和抑制型 Smad(Smad6、7)。其中，
Smad2、3主要传递 TGF-βs和活化素(activin)信号，
Smad1、5、8 主要传递 BMPs 信号。软骨细胞、
成骨细胞和破骨细胞均表达 TGF-βs、BMPs分子以
及它们的受体和Smads分子。许多研究表明，TGF-βs
和 B M P s 能够促进间充质细胞向软骨细胞分化，
BMP信号与 FGF信号相互拮抗调节软骨细胞增殖、
Ihh表达以及肥大性分化的过程[12, 13]。关于 TGF-β信
号通路是否与 Ihh/PTHrP信号通路相互作用并调节
软骨细胞的增殖和分化，不同研究所得到的结论存
在极大的分歧[14, 15]。TGF-β信号同时也是维持关节表
167第2期 杨　晓：Smad4介导转化生长因子 -β信号调节骨骼发育和稳态维持的功能
面软骨所必需的。我们通过对 Smad3基因敲除小鼠
[16]骨骼相关表型的分析，发现 Smad3介导的 TGF-
β信号抑制关节表面软骨细胞的肥大性分化[17]，提
示老年性的骨关节炎也许与系统或局部TGF-β表达
减少以及关节软骨细胞对 TGF-β 的反应性降低有
关。对骨关节炎患者 Smad3基因的所有 9个外显子
进行筛查的结果表明，Smad3基因突变可能与人类
骨关节炎的病理过程相关[18]。所有这些数据显示，
TGF-β 信号通路在软骨细胞发生、增殖、分化以
及相关疾病发生过程中具有重要的作用。
许多研究显示TGF-β在成骨细胞分化和骨重塑
中也具有重要功能[19,20]。TGF-β1基因敲除小鼠显示
骨量和骨弹性明显下降。体外实验表明，BMP和
TGF-β1信号通路相互作用调节成骨细胞的分化。
最近的研究结果还显示，Smad2和 Runx2相互作用
介导 TGFβ1刺激胶原酶 III在成骨细胞的表达，进
而影响骨吸收的过程。TGF-β信号通路还与许多其
他调节骨代谢的激素和细胞因子信号通路相互作用
调节骨的生长发育和重塑，如PTH可诱导Smad3在
成骨细胞中表达，从而抑制凋亡并促进 I型胶原合
成 [ 2 1 ]。
值得注意的是，虽然许多研究结果显示TGF-β
超家族分子对骨骼的生理功能有重要影响，但对它
们进行的研究大多是利用体外实验和过度表达转基
因小鼠完成的。由于骨骼发育和分化受到体内许多
因子和信号通路的影响，体外实验和基因过表达实
验完全是在非生理条件下进行研究，不能完全模拟
体内生理过程。由于TGF-β超家族分子在哺乳动物
发育早期也具有十分重要的功能，此外，数量众多
的配体和受体之间具有广泛的功能冗余和代偿，因
此，TGF-β信号通路分子基因敲除常常导致小鼠胚
胎期死亡或者没有明显的骨骼相关的表型[2, 22]。所
有这些原因导致人类对TGF-β超家族分子在骨骼发
育和相关疾病中的作用和机制仍然所知甚少。目
前，第一代完全基因敲除的小鼠模型正在被基于条
件基因敲除技术的第二代小鼠模型所替代。基于
Cre-LoxP系统的第二代小鼠模型可以模拟人类疾病
相关的体细胞突变，并对突变进行时空上的调控[23]。
利用条件基因敲除技术可以在特定发育阶段以及特
定细胞中灭活靶基因，提供了激动人心的新机会研
究已知或者未知基因在疾病的起始、发生和治疗过
程中的作用及其机制。我们利用转基因技术研制了
系列骨骼细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，
利用条件基因敲除技术研制了在不同类型骨骼发育
相关细胞中阻断 Smad4介导 TGF-β信号的小鼠模
型，综合利用各种分子生物学技术手段在生物整体
水平和组织细胞水平对这些小鼠模型的表型进行分
析和研究，深入探索 Smad4介导的 TGF-β信号与
其他信号通路的相互作用，以及它们在软骨细胞有
序排列、软骨细胞增殖和分化，以及骨重塑过程中
的分子机制，为理解人类相关骨骼疾病的发生及其
机理提供了新的线索。
2　项目的主要进展
2.1　成功研制了系列骨骼细胞表达Cre重组酶的转
基因小鼠　利用 II型胶原、X型胶原和骨钙素启动
子构建了分别在软骨细胞(Col2a1-Cre)[24]、终末分
化的肥大型软骨细胞(Col10a1-Cre)[25]和成骨细胞
(OC-Cre)[26]中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。
将这些转基因小鼠与报告小鼠 ROSA26杂交，通过
LacZ染色检测 Cre重组酶转基因小鼠表达 Cre重组
酶的组织特异性和时空分布。LacZ染色结果以及多
组织基因组PCR结果显示：Col2a1-Cre 转基因小鼠
中 Cre重组酶在所有骨骼组织的软骨细胞中表达。
Col10a1-Cre转基因小鼠中Cre重组酶表达在骨骼组
织中终末分化的肥大软骨细胞中。OC-Cre转基因小
鼠中 Cre重组酶表达在骨小梁，皮质骨和顶骨表面
分布的分化成熟的成骨细胞以及分散于骨基质中的
骨细胞中。这些转基因小鼠的成功研制为深入研究
骨骼发育相关的细胞谱系，以及调控软骨细胞、肥
大型软骨细胞和成骨细胞生理功能的信号通路以及
遗传机制提供了宝贵的工具小鼠。
2.2　Smad4基因在软骨细胞分化和生长板组织中的
功能　通过对软骨细胞特异性 Smad4基因敲除小鼠
的分析，提供了第一个遗传学证据证明 Smad4介导
的TGF-β信号抑制软骨细胞肥大型分化，同时是维
持骨骼生长板正常排列组织所必需的。
软骨细胞特异性Smad4基因敲除小鼠出生后体
型矮小，体重比同窝对照小鼠明显偏低。对胫骨近
端生长板进行组织学分析，发现 Smad4基因敲除引
起生长板软骨组织结构紊乱。BrdU标记实验结果表
明，Smad4突变小鼠的增殖软骨细胞增殖能力明显
降低。TUNEL结果显示 Smad4基因敲除小鼠凋亡
的软骨细胞增加。突变小鼠生长板增殖区内存在异
位的肥大软骨细胞，提示 Smad4基因敲除也影响软
骨细胞的肥大分化。随着年龄增长，Smad4基因敲
除小鼠生长板软骨组织的结构更加紊乱，显示
168 生命科学 第20卷
Smad4分子介导的信号可能作为形态发生素(mor-
phogen)指导软骨细胞沿着骨骼长轴顺序分化。
原位杂交检测发现肥大前软骨细胞和肥大软骨
细胞的标记分子 -Ihh和胶原10分子在突变小鼠软骨
细胞增殖区内异位表达。对 4 日龄小鼠进行 von
kossa染色，发现在 Smad4基因敲除小鼠的生长板
内，骨领最上端紧邻软骨细胞增殖区，表达成骨细
胞的标记分子—骨桥素。这些结果在分子水平上证
实 Smad4基因敲除引起生长板软骨细胞肥大分化提
前，且诱导毗邻的软骨膜细胞分化为成骨细胞。
原位杂交和免疫组化结果显示 Ihh和 PTHrP分
子及其受体Ptc1和 PPR在基因敲除小鼠中的表达明
显降低。小鼠跖骨体外培养实验结果表明，Smad4
基因敲除后软骨细胞失去了对BMP和TGF-β分子调
节软骨细胞肥大分化的反应性，而 Shh可以抑制对
照和 Smad4基因敲除跖骨的肥大分化，表明 Ihh分
子调节PTHrP分子的表达可能是通过Smad4分子非
依赖的信号通路[24]。
2.3　成骨细胞Smad4维持小鼠出生后骨稳态的功能
和机制　OC-Cre重组酶转基因小鼠和Smad4条件基
因打靶小鼠杂交，得到成骨细胞特异性 Smad4基因
敲除小鼠。在原代 Smad4co/co成骨细胞中转入CMV-
Cre和报告质粒并用 BMP-2或 TGF-β1刺激，结果
显示Smad4基因敲除导致成骨细胞对BMP-2和TGF-
β1的反应性显著降低。
成骨细胞特异性Smad4基因敲除小鼠出生时体
重和大小正常，3周后体型开始比同窝对照小鼠矮
小。软 X 线分析和骨密度仪定量结果显示，6 周
龄、12周龄 Smad4突变小鼠骨密度(BMD)比同性别
对照小鼠显著降低。这说明在分化的成骨细胞中敲
除 Smad4基因，小鼠出现骨质疏松的病理改变。出
人意料的是，7 月龄以上的纯合小鼠虽然体型矮
小，但组织学切片显示小梁骨数量反而比同窝对照
小鼠多。这种表型的逆转在 1年龄小鼠上表现得更
为明显。
为深入研究 Smad4敲除小鼠的表型及其机制，
我们制备了不脱钙塑料切片，并用Osteometrics软
件进行骨组织的形态计量学分析。7周时Von Kossa
染色显示钙化骨明显减少。Goldner trichrome三色
法染色 8周龄不脱钙股骨切片，骨计量软件结果表
明骨小梁体积(BV/TV)下降约 50％，骨小梁数量
(Tb.N)明显减少、骨小梁分离度(Tb.Sp)显著增加，
表明 Smad4敲除小鼠年轻时呈现明显的骨质疏松样
病理改变。用钙黄绿素标记反映骨形成的动态指
标，骨形成率(BFR)和矿物质沉积率(MAR)都下降
了约 50%。Smad4敲除小鼠的成骨细胞数量(Ob.S/
BS)下降了 27％。BrdU标记实验结果表明成骨细胞
增殖能力下降。这些结果表明，Smad4突变小鼠骨
量下降是由于成骨细胞数量减少及功能减弱造成
的。体外成骨细胞诱导试验结果显示，Smad4基因
敲除的成骨细胞形成矿化结节的功能下降。
我们进一步用原位杂交、real time PCR分析
S m a d 4 敲除导致骨量下降的分子机制。骨桥素
(OPN)、骨钙素(OC)、胶原Ⅰ(Col1a2)、碱性磷酸
酶(ALP)、核结合因子(Runx2)等成骨细胞分子标记
物和成骨细胞分化的重要转录调控因子，在 Smad4
基因敲除小鼠中表达都显著降低。我们还发现
TGF-β1表达下降，而 BMP-2和BMP-4表达水平没
有改变。
我们接着考察了成骨细胞Smad4基因缺陷是否
会对破骨细胞的分化和功能产生影响。TRAP染色
并用骨计量软件分析，发现 Smad4基因敲除小鼠的
破骨细胞数量(OcN/BPm)及所占骨小梁表面积(OcS/
BS)明显减少。Real-time PCR发现破骨细胞分子标
记物TRAP 和组织蛋白酶K(cathepsin K)表达明显降
低。同时，我们还发现 S m a d 4 基因敲除导致
RNAKL/OPG轴发生了改变，RNAKL表达升高了 2
倍多、OPG 的表达升高了 7倍多。这在分子水平
解释了破骨细胞数量和功能下降的原因。
通过对成骨细胞特异性Smad4基因敲除小鼠的
表型分析，我们首次提供了遗传学上的证据显示，
作为 TGF-β信号通路的中心介导者，Smad4在出生
后小鼠骨重建和组织稳态的维持过程中具有重要的
功能。基于Cre-LoxP系统的条件基因敲除小鼠使得
我们得以在生理条件下研究Smad4介导的TGF-β信
号对成熟成骨细胞功能的影响。我们的结果证实
Smad4基因缺失会导致成骨细胞骨形成速率和功能
下降、以及OC、ColI、ALP和 Runx2等重要成骨
细胞分子标记物和调节分子表达下调，最终导致骨
质疏松。我们的结果还揭示了 Smad4基因缺失导致
的成骨细胞功能失调可能通过下调 TGF-β1和改变
RANKL/OPG 轴分子表达的比例使得破骨细胞的数量
和功能下降，从而使 7月龄后的突变小鼠小梁骨密
度回升。所有这些结果揭示了成骨细胞中的 Smad4
在调节出生后骨形成以及破骨细胞分化和骨吸收过
程中的重要作用及其可能机制[26,27]。
169第2期 杨　晓：Smad4介导转化生长因子 -β信号调节骨骼发育和稳态维持的功能
3　研究展望
自基因敲除技术诞生以来，它的应用极大地改
变了生命科学和基础医学研究的面貌，已经成为确
定哺乳动物基因功能的“金标准”[28]。条件基因敲
除技术的应用使得研究者得以在特定的组织或者特
定发育阶段评价靶基因的功能[29]。我们实验室近年
来利用组织特异性条件基因敲除技术，揭示了
Smad4介导的TGF-β信号调节骨骼和心血管系统发育、
维持组织稳态以及抑制肿瘤的功能和机制[24, 26, 30-34]。
研制成功的 10余种组织特异性Cre重组酶为深入研
究特定组织器官发育和稳态维持的遗传机制奠定了
基础[24-26, 30-35]。
由于骨骼组织的独有特性和研究手段的限制，
对调控骨骼组织发育过程、生理功能、稳态维持以
及疾病发生过程的遗传机制的认识远逊于对其他软
组织的认识。欧盟小鼠基因敲除联盟将在不久的将
来完成小鼠全基因组的条件基因敲除[36]，国内也启
动了“十一五”支撑计划系统研制条件基因打靶小
鼠。通过对大量骨骼细胞特异性条件基因敲除小鼠
的表型分析，人类能进一步深入了解骨骼组织图式
形成、细胞分化、骨重塑、稳态维持以及相关疾
病发生的遗传控制机理。最近，有研究显示骨骼能
够作为内分泌器官调节血糖稳态和能量代谢[37]，还
发现miRNA能调节成骨细胞的分化[38]。2007年，
相继诞生的miRNA敲除小鼠提供的遗传学证据显示
miRNA参与调节哺乳动物发育和组织稳态维持[39, 40]。
可以预测，骨骼系统miRNA基因敲除的研究将为研
究者在新的层面上理解基因调控正常骨骼发育和抑
制骨骼疾病的分子机制提供新的线索。
[参　考　文　献]
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中科院上海药物所开展国际合作，苦瓜降糖研究取得新进展
上海药物研究所与澳大利亚伽尔文(Garvan)医学研究所合作，从苦瓜中发现了数个具有治疗糖尿病应
用前景的活性化合物成分。双方共同的研究结果发表在最新一期《细胞》出版社期刊《化学与生物学》
杂志上。
苦瓜作为中药使用已经有数百年历史，最早记载于明代兰茂所撰《滇南本草》，称苦瓜“清暑、
益气、止渴”。近代对苦瓜化学成分及其药理活性研究颇多，但是其中主要的降糖活性化学物质及其作
用机理一直未明确。上海药物研究所叶阳研究员课题组认真总结文献和前人研究结果，通过多年探索，从
苦瓜中分离和鉴定了一系列新的天然化学成分，并与伽尔文研究所合作，在细胞和动物水平上首次明确了
植物中的这些天然成分具有降低血糖的活性。
对化合物的降糖作用机制研究表明，这些化合物能激活体内与能量代谢相关的一个重要蛋白——单磷
酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)，该蛋白具有调控人体能量代谢和促进葡萄糖摄取的作用。采取有效措施激
活单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是 2型糖尿病治疗的一个重要途径。
苦瓜在中国一直是药食同源的植物，从该植物中分离得到这一类具有降糖活性的化合物，首次从分子
水平上印证了历代本草中对苦瓜药效的记载及近代药理学研究的结果。通过和伽尔文研究所的合作，科研
人员推测这些化合物在细胞中是通过一条新型信号通路起作用，进一步发现这条信号通路将对发现研究治
疗糖尿病的新途径和发明治疗糖尿病新药都将是一件非常有意义的事情。
上海药物研究所和伽尔文研究所签署了合作协议，将深入对苦瓜的降糖治疗作用进行全面评价和作用
机制研究。
摘自 http://www.sibs.ac.cn
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