全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第22卷 第3期
2010年3月
Vol. 22, No. 3
Mar., 2010
文章编号 ：1004-0374(2010)03-0252-04
冷冻透射电镜：从分子到系统
Wolfgang Baumeister
(德国马普生化所)
摘　要：单颗粒电镜结合其他方法能够在(近)原子水平提供结构模型，已经成为一种研究大蛋白复合物
的有效方法。该文将以两个大的蛋白裂解复合物——tripeptidyl peptidase II (6 MDa)和26S蛋白酶体(2.5
MDa)举例说明。低温电子层析能进行非重复的超分子结构分析，如多核糖体和全细胞；能够为超分子
组织提供前所未有的信息(可视化蛋白质组学)。
关键词：冷冻透射电镜；单颗粒；蛋白复合物
中图分类号：Q-336；Q5-33　　文献标识码：A
Cryo-electron microscopy: from molecules to systems
Wolfgang Baumeister
(Max-Planck-Institute of Biochemistry, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Germany)
Abstract: Single particle electron microscopy has become a powerful method for studying large protein complexes
and, in conjunction with other methods, can provide structural models at (pseudo) atomic resolution. This will
be exemplified with two large proteolytic complexes, tripeptidyl peptidase II (6 MDa) and the 26S proteasome
(2.5 MDa). Cryo-electron tomography enables the structural analysis of non-repetitive supramolecular structures,
such as polyribosomes and even whole cells providing unprecedented insights into their supramolecular orga-
nization (visual proteomics).
Key words: cryo-electron microscopy; single particle; protein complexes
冷冻透射电镜是在低温下检测冷冻含水生物样
品的实验手段，其优点在于避免了人工假象，而常
规的样品处理涉及化学固定、染色和脱水，会造成
一些假象。生物分子电镜含有三个主要分支：电子
晶体学、单颗粒分析和电子断层扫描。
1　单颗粒分析
单颗粒分析现已成为用来研究大的蛋白质复合
物的有效方法，并且结合其他方法能够提供在(近)
原子水平的结构模型，其优点在于：第一，能够
处理非常大的复合物(越大越好)，并且，只需要非
常少的材料；第二，能够处理异源的(不纯的或构
象上多样的)材料。该单题粒分析缺点在于：尽管
理论上可以获得高分辨率，但是实际上通常难以达
到。目前，单颗粒分析还是一种低通量、专业性
很强的方法：因为中等分辨率(~1nm)比较容易获
得， 所以这是一种研究大分子复合物很有前途的方
法，并且与定量对接技术结合起来，为杂交方法提
供了非常好的研究平台。
1.1　Tripeptidyl peptidase II (6 MDa)，TPPII
T P P I I 及其功能的发现经历了如下的历程：
1983年，Balow 等在大鼠肝脏的外溶酶体中发现了
TPPII。1987 年，TPPII 被划分为枯草杆菌类型的
丝氨酸蛋白酶。1987和 1990年，Macpherson 等构
建了一个含有弓形亚基的大颗粒。1996 年，Rose
等发现TPPII 在大脑中的膜结合形式会降解神经递
质。1999 和 2000 年，Geier 等发现在蛋白酶体受
抑制的情况下，TPPII表达量会上升。2000和2005
年，Hilbi等发现TPPII参与肌肉败血症、凋亡和癌
症发生过程。2003和2004年，Seifert 等发现TPPII
253第3期 Wolfgang Baumeister：冷冻透射电镜：从分子到系统
在抗原递呈中也发挥作用。2007和2008年，TPPII
在MHC class II 抗原递呈中的具体作用饱受争议。
2007 年，McKay 等发现TPPII 在脂肪代谢和肥胖
中的作用。2008年，Huai 等发现TPPII 缺陷会激
活细胞死亡程序并且导致免疫- 衰老。
单颗粒重构的第一步是将构象类似的单颗粒图
像归类，第二步是通过计算方法确定不同类单颗粒
的orientation。2002年，Rockel等[1]在3.3 nm分辨
率上重构了57×27 nm TPPII复合物的三维结构，表
明相对分子质量为150 k的亚基组成了两条相互交缠
在一起的超结构。每条链12.5 nm 宽，并且由11
个节段组成。
2005年，Rockel等[2]通过冷冻电镜手段获得了
修改过的三维模型，展示了分子构造的细节，并且
结合生化数据更深入地了解了其组装机制(图 1)。
他们发现：TPPII 相对分子质量为5.7 (+/-) 1 M，
每个纺锤体样结构含有20 部分，一个部分为285 k,
每个部分是一个二聚体(2×150 k)。
接下来要解决的问题是如何获得更高分辨率的
结构，晶体学或许会给出更好的答案。但TPPII 的
结构具有浓度依赖性。根据其动力学稳定方面数
据，通过 GuHCl 处理、在 N 端加 MBP- 标签、定
点突变、透析和冷处理、化学修饰等方法，稳定
了TPPII 组装的中间体，并且最终得到了TPPII 二
聚体的晶体。在TPPII 的枯草杆菌结构域中S 462
被置换，接下来，将 X - 射线晶体结构拟合到 E M
envelope中，我们可以看到单体是如何形成二聚体
进而形成多聚体的。在活性检测中，可以清楚地看
到大小确实很重要：纺锤状结构具有最高的活性。
二聚体只有 8% 的活性，而较大的纺锤体状结构有
85% 的活性[3]。另外，L2 的残基456~458 结合在
底物结合口袋中，其激活涉及到构象变化。
综上所述，TPPII 是一个自我区域化肽酶，它
含有细胞质接合的活性位点，可以将折叠好的蛋白
质排出在外，能够积累肽段——“分子海绵”，其
激活被延迟并且与组装偶联。这为下游蛋白质降解
通路的成分——氨肽酶的对接提供了很好的基础。
1.2　26S 和20S 蛋白酶体
26S 蛋白酶体是一个多亚基(>35)复合物(2.5
MDa)，以ATP- 依赖形式降解泛素化的底物。20S
蛋白酶体是蛋白降解的核心复合物，从古细菌到人
类都非常保守。
26S 蛋白酶体结构研究的问题在于：复杂性、
易变性和柔性。Nickell等[4]通过自动数据获取(网格
扫描、合适网格选择、数据收集方法以及自动聚焦
的手段)得到了26S 蛋白酶体的电子密度等值曲面和
差额图。
果蝇-26S 蛋白酶体的三维模型构建步骤如下：
用Mod-EM将20S CP 和Rpt’s comparative 模型拟合
到冷冻电镜三维重构图中，然后为26S 蛋白酶体建
模。根据公共蛋白质组数据为26S 蛋白酶体建模。
其中，大多数信息来自酵母双杂交(14个)、Pulldown
(7个)、共纯化(4个)、质谱连用(4个)、化学交联
(14个)和Filter binding (7个)。根据蛋白质组数据和
电镜密度图为26S 蛋白酶体建模。通过优化和聚类
得到了与输入数据一致的组装模型。从中确定了
Rpn10 的大致位置。进一步的结构分析表明，果蝇
的26S 蛋白酶体主要可分为两类。
2　低温电子断层扫描
分子的结构大多数是预先决定的，因此具有可
重复性。而更高有序的结构是适应随机变化的，因
此有独特的拓扑结构。低温电子断层扫描结合了三
维成像和保持样品的生理状态两大特点。它使我们
在分子分辨率上能够研究大的拥有特殊拓扑结构(细
胞器或整个细胞)的构造。这样，反过来，使分子
机器在它们的功能环境中的可视化成为可能。研究
的最终目标是通过结合分子成分的高分辨率结构和层
析的细胞图获得细胞内部空间的近原子分辨率图。
图1　C2-对称的TPPII 模型[2]
navette (左)和dumbbell (右)方向表面
254 生命科学 第22卷
动态的巨大复杂的组合。在纳米尺度上，细胞主要
还是一个未知的世界。 正如Ball[7]所说的：“我们
了解分子；我们了解细胞和细胞器；但是，两者
之间的内容是混乱而神秘的。我们谈及分子生物学
和细胞生物学，但是，没有人真正谈及中观生物
学。可是，这才是许多反应发生的水平；是几个
到上百个纳米尺度的规模。正如大分子高分辨率三
维结构能够提供针对它们工作状态的信息一样，可
视化超分子构造也会使我们在一个不受干扰的细胞
的环境中更好地理解细胞的功能。”
3.1　相关显微学方法
相关显微学方法是通过光学和电子显微镜检测
同一样品以获得有用信息的方法。光学显微镜能够
检测大的细胞水平的结构。荧光显微镜能够检测到
感兴趣物质的特点。电子显微镜和电子断层扫描能
在更高分辨率上放大这样的特点。通过聚焦离子束
milling发现靶标切片。
以丝状伪足中的肌动蛋白细胞骨架为例讲解相
关显微学方法的应用。检测和发现的策略见图3[8]:
以 S.melliferum 为例。首先确定核糖体的位
置，再通过cross-correlation coefficient计算和高斯
拟合方法来优化核糖体的定位。然后通过降低电子
密度图的阈值，将已知的核糖体晶体结构嵌入此前
获得的三维重构电子密度图中，获得各个核糖体更
多的结构信息。
下面以最近研究的体外和体内的多聚核糖体的
三维结构为例来说明获取结构信息的方法。通过计
算，可以得到多聚核糖体在空间上的关联信息。
那么，形成多聚体的生理意义是什么？我们发
现，在蛋白质合成过程中，tRNA 进入位点依然是
可用的；mRNA 被单独分隔和保护起来；新生链
的退出在空间上是分开的。Brownian 动态仿真了这
一过程。以上是体外的结果，体内实验证实也是如
此。进一步地，在人胶质母细胞瘤细胞系中，通
过冷冻断层重构的方法，我们也获得了多聚核糖体
在细胞中的结构信息。
3.2　从蛋白质组学数据库到蛋白质图像库的构建
具体地，从基因组学、蛋白质组学到模板库的
构建、三维信息的分解，再到利用cross-correlation
function来构建蛋白质图像库[9]。以Thermoplasma
acidophilum中蛋白质质量控制和降解来说明了相关
蛋白质图像库的构建[10]。图2　Dictyostelium核孔复合体的结构[5]
下面以动态层析核孔复合体为例来说明这一技
术。
Beck 等[5]从Dictyostelium discoideum中分离到
完整的细胞核，通过低温电子断层扫描对其进行了
结构和动态研究，得到了重构的Dictyostelium核孔
复合体结构(图2)。
至于该细胞核动态结构，根据分析和补偿可以
得到其塑性形变的信息。此外，通过不对称单位的
相关平均可以提高分辨率。如：标准的单颗粒分析
可以得到8.3 nm的分辨率，而不对称单位的平均可
以得到5.8 nm的分辨率(523核孔复合体包含4 184
个不对称单位)。对以上结构进行优化可以发现核
孔复合体新的特点。通过纳米金标记示踪细胞核的
运输，最终得到了核运输的单分子Monte Carlo 仿
真模型[6]。
3　构建细胞内的分子景观
细胞是一个较分子更复杂的组合体，一个高度
255第3期 Wolfgang Baumeister：冷冻透射电镜：从分子到系统
3.3　可视化蛋白质组学
可视化蛋白质组学的目的在于提供一个分子图
像, 例如，一个描述蛋白质组或具体蛋白质子集的
集合在空间排布的信息。这样的图能够为分析细胞
相互作用网络提供最重要的资源。低温电镜层析结
合计算方法为其解读提供了纳米级精确度的图像；
这是非侵入性的，我们能够在完整细胞中研究相互
作用网络。
我们现在取得了很大进展，但其实在以下方面
还有很大进步的空间：(1)数据质量。我们可以用
更好的工具制作超薄尺度样品；利用双轴倾斜；采
用更好的检测器；用可视化的措施来增加对比度。
(2)数据分析。可以用subtomogram的分类和比对；
通过模式识别来证实检测到的特点；进行数据挖
掘。(3)数据整合。相关联方法(如：电镜/ 质谱联
用)；使用系统和重复性数据整合的计算工具。(4)
数据的可视化。采用自动分割；复杂结构数据的交
流等。
[参 考 文 献]
[1] Rockel B, Peters J, Kuhlmorgen B, et al. A giant protease with
a twist: the TPP II complex from Drosophila studied by
electron microscopy. EMBO J, 2002, 21: 5979-84
[2] Rockel B, Peters J, Muller SA, et al. Molecular architecture
and assembly mechanism of Drosophila tripeptidyl pepti-
dase II. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102: 10135-40
[3] Seyit G, Rockel B, Baumeister W, et al. Size matters for the
tripeptidylpeptidase II complex from Drosophila: the 6-
MDa spindle form stabilizes the activated state. J Biol Chem,
2006, 281: 25723-33
[4] Nickell S, Beck F, Korinek A, et al. Automated cryoelectron
microscopy of “single particles” applied to the 26S
proteasome. FEBS Lett, 2007, 581: 2751-6
[5] Beck M, Forster F, Ecke M, et al. Nuclear pore complex
structure and dynamics revealed by cryoelectron
tomography. Science, 2004, 306: 1387-90
[6] Beck M, Lucic V, Forster F, et al. Snapshots of nuclear pore
complexes in action captured by cryo-electron tomography.
Nature, 2007, 449: 611-5
[7] Ball P. Portrait of a molecule. Nature, 2003, 421: 421-2
[8] Frangakis AS, Bohm J, Forster F, et al. Identification of
macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of
phantom cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 14153-8
[9] Nickell S, Kofler C, Leis A P, et al. A visual approach to
proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006, 7: 225-30
[10] Ruepp A, Graml W, Santos-Martinez ML, et al. The ge-
nome sequence of the thermoacidophilic scavenger
Thermoplasma acidophilum. Nature, 2000, 407: 508-13
(中国科学院上海巴斯德研究所 吕　柯，陈　荣　编译)
图3　检测和发现策略的原理流程图[8]