全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第21卷 第3期
2009年6月
Vol. 21, No. 3
Jun., 2009
文章编号 ：1004-0374(2009)03-0388-06
糖基转移酶定向进化研究进展
吴佳茜1，王　旻1*，陈代杰2，朱 丽3
（1 中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009；2 上海医药工业研究院，上海 200040；
3 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司，上海 200240）
摘　要：糖基转移酶在改造含糖活性化合物以获得结构多样性过程中起着重要作用，定向进化不仅能够提
高其对底物的宽泛性，同时也能够提高其催化活性。定向进化的成功与否取决于突变体库的多样性及筛选
方法的可靠性和效率。本文简要综述了糖基转移酶随机突变方法及高通量筛选正突变体的策略，包括基于
细胞的筛选法、基于荧光受体高通量筛选和pH 值指示计高通量筛选。
关键词：糖基转移酶；定向进化；高通量筛选
中图分类号：Q 5 5 　　文献标识码：A
Research advances in directed evolution of glycosyltransferase
WU Jia-qian1, WANG Min1*, CHEN Dai-jie2, ZHU Li3
(1 School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;
2 Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040, China;
3 Shanghai Health Creation Center for Biopharmaceutical R&D, Shanghai 200240, China)
Abstract: Glycosyltransferase plays an essential role in modifying bioactive compounds containing sugars.
Directed evolution is one of the new strategies not only for improving catalytic activity but also expanding its
promiscuity. The successful directed evolution depends on the diversity of mutant library and the high efficacy
of screening method. This review briefly introduces the random mutation strategy，and the high-throughput
screening（HTS） for the selection of positive mutants. The methods include a cell-based screening system,
fluorescence-based acceptor HTS and pH-indicator HTS.
Key words: glycosyltransferase; directed evolution; high-throughput screening
收稿日期：2008-12-25；修回日期：2009-01-21
基金项目：国家自然科学基金(30672558)
*通讯作者：Tel: 025-83271395; E-mail: minwang@cpu.
edu.cn
在自然界中存在的许多含糖小分子物质(糖苷类
化合物) 具有生物活性，在目前临床应用的药物
中，很多都来自这类小分子物质。而这些小分子结
构中的糖基的多样性和在分子中的不同位置，往往
对这类化合物的生物活性是至关重要的。改造糖分
子的结构，使其具有生物活性、药用价值，这为
含糖药物筛选工作提供了一条重要途径。
糖基转移酶(glycosyltransferase, GTs) 参与糖苷
类化合物生物合成，是对糖分子进行生物学方法改
造的重要对象[1] (表1)。GTs催化不同的糖基与特定
的受体分子结合，从而产生大量的寡糖、多聚糖和
其他结构多样性的糖苷类化合物。但是，由于糖基
转移酶独特的结构和作用机制，决定了该酶具有高
度的底物特异性而限制了多样性糖基的转移，以致
难以获得结构多样性的糖苷类化合物。因此，提高
糖基转移酶催化底物的宽泛性，使它能够将更多种
类的糖基引入多种具有重要价值的小分子中，丰富
糖苷类药物的多样性，成为研究的重点。
酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略，它
主要包含两个基本步骤：(1)建立目的基因的突变体
库;(2)对不同突变基因表达的蛋白进行筛选，找到
有益突变体。
389第3期 吴佳茜，等：糖基转移酶定向进化研究进展
在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然
酶，这在短期内可以在试管中完成，而在自然界需
要几百万年的进化过程，因此，可能是发现新型酶
和新的生理生化反应的重要途径。
1 GTs的结构及作用机制
尽管GT 的序列千差万别，但出人意料的是如
此众多的家族却只采用了两种相类似的折叠方式——
Rossmann 卷曲，形成GT-A 和 GT-B 两大超家族。
GT-A家族中的蛋白由两个紧密相邻的β/α/β折叠构
成，而GT-B家族中的蛋白由两个β/α/β结构域彼此
相对且自由连接。与GT-A 超家族不同的是GT-B 超
家族中没有“D X D ”功能域，“D X D ”是一种
具有高度保守性的模体，它的作用是将糖基与另外
的糖基、磷酸盐和蛋白结合。先进的分子生物学手
段使得越来越多的折叠形式被我们所知，第三种折
叠方式GT-C 就是通过BLAST 等迭代序列查找技术
而发现的[17]，其跨膜蛋白的拓扑学结构还没有通过
实验来证明。
根据异头碳的立体构型，糖基转移酶分为构型
翻转型(inverting)和构型保持型(retaining)。构型翻转
型糖基转移酶是通过酶催化激活路易斯酸，使之脱
去一份磷酸盐，完成一个类似 SN2 亲核取代反应。
构型保持型糖基转移酶，被认为符合由Breton等[18]
提出的双置换机理，即首先产生糖基- 酶中间复合
物, 接着再与受体完成第二步取代反应，但由于一
直无法找到对应的糖基-酶中间复合物，所以其反
应机制目前尚属推测。
2 GTs的定向进化
体外定向进化是改造酶的一种有效的新策略，
主要是模拟自然进化进程，在一种酶的特定位置引
入随机变异，再经由 D N A 改组、交错延伸过程、
随机引导重组等进行突变基因的体外重组，最终经
筛选获得所需活性的酶。
2.1　突变库的构建　
定向进化首先需要构建包含大量突变的基因文
库，通常采用随机突变和基因重组的方式来进行。
随机突变包括易错PCR(epPCR)和饱和突变(saturation
m u t a t i o n ) 等；基因重组包括 D N A 重组( D N A
Shuffling)、渐进式切割产生杂合酶(incremental trun-
cation for the creation of hybrid enzymes, ITCHY)、
交错延伸法(staggered extension process, StEP)、随
机引物体外重组(random-priming in vitro recombination,
RPR)、临时模板随机嵌合生长( random chimera gen-
esis on transient templates, RACHITT)、外显子改组
(exon shuffling)和酵母增强组合文库(combinatorial li-
braries enhanced by recombination in yeast, CLKRY)，
表1　部分参与天然产物合成的糖基转移酶[1]
糖基转移酶 菌种 用途 参考文献
Ak n K S．galilaeus 参与阿克拉霉素A 的生物合成 [2]
AknS
Asm25 Actinosynmema pretiosum 功能未知 [3]
subsp.auranticum
AveBI S.avermitilis MA-4680 参与阿维菌素的生物合成 [4]
ChaGT S.chartreusis 参与教酒菌素生物合成 [5]
C o u M S.rishiriensis DSM 40489 参与香豆霉素生物合成 [6]
CosG S.olindensis 参与宇宙霉素生物合成 [7]
CosK
EryBV Saccharopolyspora erythraea 参与红霉素的生物合成 [8]
GilGT S.griseoflavus Gö3592 参与褐黄癌菌素生物合成 [9]
LanGT4 S.cyanogenus S136 参与竹桃霉素生物合成 [10]
MegDI Micromonospra megalomicea 参与巨霉素生物合成 [11]
M e g B V
MegC Ⅲ
NcsC6 S.carzinostaticus ATCC 15944 参与新抑癌蛋白生物合成 [12]
Neo8 S.fradiae NCIB 8233 参与新霉素生物合成 [13]
N o v M S.spheroides NCIMB 11891 参与新生霉素生物合成 [14]
PlaA6 S.sp.TÜ6071 参与phenalinolactones生物合成 [15]
StfG S.steffisburgensis NRRL 3193 参与司替霉素生物合成 [16]
390 生命科学 第21卷
以及随机片段交换法(random insertional-deletional
strand exchange mutagenesis, RAISE)[19]等9种方法。
构建糖基转移酶突变库最为常用的是易错PCR、饱
和突变和DNA 重组等3 种方法(表 2)。
2.2　筛选技术　
定向进化的基本规则：“所筛即所得。”定
向进化的成功与否就在于筛选庞大的突变体文库。
对于糖基转移酶来说，虽然我们掌握了大量糖基转
移酶的结构以及生物化学信息，但是主要因为糖基
转移酶在催化糖基形成糖苷键的过程中，没有产生
一个明显的、可供筛选的信号，例如吸光度和荧光
吸收，所以仍然缺乏合适的筛选手段。表3 列举了
糖基转移酶常用的筛选手段，但由于存在明显的缺
点，极少符合高通量筛选。针对以上筛选手段的不
足之处，目前针对糖基转移酶设计的高通量筛选手
段主要利用定向进化的酶各自特有的性质作为筛选
依据发展起来的。
2.2.1　基于细胞的筛选法(a cell-based screening
system)　Aharoni 等[20]首先通过易错PCR 得到约
106Cst Ⅱ突变库，然后利用一种基于细胞的筛选技
术来定点进化一种唾液酸转移酶(sialyltransferase,
STs)Cst Ⅱ。他们利用监测细胞中带荧光标记的反
表2　常见糖基转移突变库构建方法
方法 原理 优点 缺点
易错PC R 通过改变P C R 的条件，通常降 对父本基因的限制条件不多； 相当慢；仅引入点突变；涉及
　低一种 d N T P 的量，使 P C R 　全部操作简便；周期短； 　的基因片段太短(少于800 碱基
　易于出错，达到随机突变的 　而且可以和其他突变方法搭 　对) 。
　目的。 　配使用；可以说易错 P C R
　是最基础的方法。
饱和突变 通过对目的蛋白的编码基因进 可以用来鉴定蛋白质功能位点， 饱和突变的关键问题在于活性部
　行改造，短时间内获取靶位 　提高酶比活力，改善酶热稳 　位的选择，这主要依赖蛋白质
　点氨基酸分别被其他19 种天 　定性、底物结合特异性及立 　的结构信息，包括实验测定的
　然氨基酸所替代的突变子。 　体异构特异性等多方面性质。　　　三维结构和计算机模拟的同源
　模型。以磁共振或 X- 射线晶
　体衍射测定的结构为基础来确
　定的靶位点，但多数G T 的结
　构尚未测定，应用上有一定的
　限制。
D N A 重组 将D N A 拆散后重排，它是模仿 可以在无同源性或低同源性的 重组一定是在两个不同的亲本之
　自然进化的一种D N A 体外随 　两个基因间产生重组；引入 　间产生；亲本基因序列的同源
　机突变方法。这种方法不仅 　了重组、缺失、重复等多种 　性要求较高，常常不小于90%；
　可以对一种基因人为进化，而 　突变类型；可以迅速积累有 　子代中功能杂合子的比率很
　且可以将具有结构同源性的 　益突变，使表达蛋白的平均 　低。
　几种基因进行重组，共同进 　活性明显提高；加速积累有
　化出一种新的蛋白质。 　益突变；可实现目的蛋白多
　种特性的共进化。
表3　常用筛选方法优、缺点总结
方法 优点 缺点
化学发色及荧光测定法 灵敏度高。 难于自动化操作，供体需要放射性标记。
免疫学法 高灵敏性，识别不同的反应产物。 需要昂贵的特异性抗体及外源凝集素，不适用于大
　 　多数酶的检测。
分光光度计法 通过检测反应产物UDP 和糖基转 不能筛选细胞粗提物，因为这会干扰 N A D H 的氧化
　 　移酶作用，并同时需要NA D H / 　作用。
　 　N A D 辅助因子参与酶促反应，
　 　这个方法已经用于微量滴定板。
色谱法 将产物鉴定和酶鉴定两者结合。 底物需要荧光标记。
质谱-光谱联用法 速度快，准确度高。 所需设备昂贵。
391第3期 吴佳茜，等：糖基转移酶定向进化研究进展
应产物来筛选 Cst Ⅱ突变体库。这种检测的原理
是：生理条件下，唾液酸是唯一带电的糖，带荧
光基团标记的受体，由于带中性电荷，可以自由地
出入细胞。当带负电荷的唾液酸与受体结合时，形
成带电荷的产物，只能留在细胞内，这样细胞就被
带上了荧光标记，通过荧光激活细胞分类技术
(FACS)就可以进行细胞筛选。FACS 的原理是：待
测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞
排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。
当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前
向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)，它们分别反映
细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分
类。如今的荧光激活细胞分类仪器能在一个小时中
分选 107 个细胞。
从图1我们可以看到，用荧光标记的受体糖基
可以自由的进出细胞，如果突变体酶能够催化唾液
酸与受体结合，那么细胞就获得了荧光(上) ；如果
突变体酶的催化效率低，那么就不能获得荧光
(下)。最后根据每个细胞的光散射和荧光特征，就
可以将特定的细胞从细胞群体中分选出来[21]。
Withers 等发现一种新的唾液酸转移酶突变体
F91Y。F91Y 可以提高对糖供体 CMP-KDN 的转化
效率；将荧光探针 BODIPY 标记的乳糖、半乳糖、
3H-乳糖作为受体， F91Y与野生型酶催化活性相比
较，分别提高了153、367、407 倍。更重要的是，
他们还发现这个酶可以合成含寡糖的唾液酸，能够
抑制糖苷酶的硫连接，这是在先前的实验中从未发
现的性质。
细胞筛选法的局限性在于它只能分析那些在细
胞中能形成含有唾液酸产物的糖基转移酶，比如说
唾液酸转移酶和半乳糖转移酶。而对于其他更多的
酶，还需要通过其他的手段来实现高通量筛选。
2.2.2　基于荧光受体的高通量筛选(fluorescence-based
acceptor HTS)　竹桃霉素糖基转移酶(oleandomycin GT,
OleD)可以催化一些小分子的酚类化合物。Williams
等[22]首先将野生型的OleD通过易错PCR突变1—2
个氨基酸，得到约1 000 个突变体，然后找到其中
一种荧光香豆素(4-甲基-7-羟基香豆素)作为受体，
可以通过遮蔽其7 位的羟基来淬灭荧光，从而根据
荧光的减少量来筛选突变体库。反应式见图 2。
通过定向进化的突变体酶转化效率明显高于野
生型酶：三突变体P67T/S132F/A242V 对底物7/
UDP-Glc 的催化效率提高了60 倍；不仅如此，对
底物的宽泛性也大大增强。在22个供体底物中这个
三突变酶可以结合其中15 个，而其中的12 个供体
不能作为野生型酶的底物被检测。在这些被成功筛
图1　基于细胞的筛选法检测唾液酸转移酶[21]
图2　利用 4-甲基-7-羟基香豆素定向进化竹桃霉素糖基转移酶[23]
392 生命科学 第21卷
进行酶切，获得依次相差一个碱基的 DNA 片段库，
随后将gtfE 的 N 端与kanE 的 C 端连接，建立杂合
酶突变体文库。通过 pH 指示剂法筛选到其中一种
杂合酶HMT31(N-KanF-669bp和756bp-C-GtfE)，其
催化效率可达每分钟163mmol/L。
(甲酚红pKa 等于8.32，pH7.2－8.8时，从紫
色变成黄色)
分别用GtfE、KanE、HMT31 作底物宽泛性实
验，以2-脱氧链霉胺(2-DOS)作为受体，9个NDP-
糖基作为供体。其中GtfE 对 2-DOS 没有任何催化
活性，对不同的供体dTDP-D- 葡萄糖、GDP-D- 甘
露糖、UDP - D - 果糖、HMT3 1 的催化活性分别是
Ka n E 的 16、7、3 倍。
pH 指示剂法的优势：(1)灵敏度很高，两个新
发现的突变酶的kcat仅为野生型酶的两倍；(2)不需
要与之共反应的酶及标记过的底物，具有发色团及
荧光的底物可能会因为大量的发色团引入反应后，
导致底物活性及特异性发生巨大改变，从而造成错误
结果；(3)由于糖基转移酶发生催化反应时都伴随着
H+ 的释放，pH 指示剂分析法具有广阔的应用前景。
这种分析方法的缺点是不适用于酶比活性的测
定，那是因为测定所用的溶液的缓冲能力较低，当
酶加入到反应混合液中，很难准确测定吸光度，从
而其初反应率也相应难得到。当反应开始后，指示
剂的吸光度也会相应发生改变。所以通过适当的改
变反应条件，选择一个恰当的pH 指示剂和缓冲液，
并且考虑酶的最佳反应pH，成为指示剂高通量筛选
是否成功的重要因素。
3 结语及展望
定向进化对于糖基转移酶的改造是一种非常有
效的策略，不仅可以改变糖单元和配基的底物特异
性，扩大底物及受体的宽泛性，还可以大大提高糖
苷类化合物的结构多样性，为筛选到新活性糖苷类
化合物奠定基础。
图3　pH值指示高通量筛选原理
选出的受体中不乏有可以作为药物的前体，譬如：
大环内酯类、黄酮类、异黄酮类、蒽醌类、吲哚
咔唑类、聚烯类、甾类、内酰胺类、生物碱类等。
这项技术的不足之处在于筛选过程需要依靠含
有荧光团的底物。为了能改进这个缺点，Williams
等[24]首先利用荧光受体高通量筛选新生霉酸(非荧光
团底物)，找到了关键氨基酸的热点(hot spots)即功
能性残基，这些突变点一般发生在受体结合位点的
“茎”的 N3 处和焦磷酸结合点，然后饱和突变三
个氨基酸(Pro67、Ile112、Ala242)，所得到的新
的突变体，就可以用低通量筛选得到。结果表明：
在糖基化过程中，这些突变株结合新生霉酸的能力
提高了200 — 300 倍，更可喜的是，由于扩大了底
物的宽泛性，从而形成了8 个新的含新生霉酸的天
然糖基化产物，这对于化学合成天然糖基化产物也
是强有力的补充。
2.2.3　pH值指示高通量筛选(pH-indicator HTS)　这
种检测方法是利用糖供体在转移一部分糖基到受体
时，由于质子的释放而引起pH 指示剂颜色的改变。
原理见下图3。
Persson和Palcic[25]对α-(1,3)-半乳糖转移酶
(GTB)的热点M214进行饱和突变后，得到350个候
选突变体。这些突变体催化受体二磷酸尿苷半乳糖
(UDP-Gal)和供体H 抗原时释放出H＋，使得pH 指
示剂溴酚蓝的颜色发生改变。反应式见下：
(溴酚蓝的pKa 等于7.1，pH 6.0—7.6时，从
蓝色变为黄色)
以UDP-Gal作为供体，墨角藻糖基乳糖作为受
体。具有活性的酶，其指示剂颜色从绿色变成了黄
色；活性低的酶为绿色；而没有活性的突变体酶
仍然为蓝色。
Park等[26]利用渐进式切割法(incremental trunca-
tion method)，即外切核酸酶Ⅲ对万古霉素糖基转移
酶基因(gtfE)和卡那霉素糖基转移酶基因(kanE)分别
393第3期 吴佳茜，等：糖基转移酶定向进化研究进展
糖基转移酶定向进化应该分两步走：第一步，
提高酶突变体库的容量和质量，就目前来说，有各
种无性突变、有性重组手段增强酶的优化潜力；第
二步，也是薄弱环节，就是在保证突变体质量的条
件下，缩小突变体库或者采用高通量筛选手段，这
是糖基转移酶定向进化中的重点发展方向，随着酶
高级结构进一步的阐明，可以利用新发现酶的特性
来设计筛选方案。
我们相信，随着基因工程技术、蛋白质工程
技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技
术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为
工业生产提供更多性能优良的酶制剂。
[参　考　文　献]
[1] Luzhetskyy A, Mendez C, Salas JA, et al. Glycosyl-
transferases, important tools for drug design. Curr Top Med
Chem, 2008, 8: 680-709
[2] Lu W, Leimkuhler C, Gatto GJ, Jr, et al. AknT is an activat-
ing protein for the glycosyltransferase AknS in L-
aminodeoxysugar transfer to the aglycone of aclacinomycin
A. Chem Biol, 2005, 12(5): 527-34
[3] Luzhetskyy A, Weiss H, Charge A, et al. A strategy for
cloning glycosyltransferase genes involved in natural prod-
uct biosynthesis. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(6):
1367-75
[4] Zhang C, Albermann C, Fu X, et al. The in vitro characteriza-
tion of the iterative avermectin glycosyltransferase AveBI
reveals reaction reversibility and sugar nucleotide flexibility.
J Am Chem Soc, 2006, 128(51): 16420-1
[5] Xu Z, Jakobi K, Welzel K, et al. Biosynthesis of the antitumor
agent chartreusin involves the oxidative rearrangement of an
anthracyclic polyketide. Chem Biol, 2005, 12(5): 579-88
[6] Freitag A, Mendez C, Salas JA, et al. Metabolic engineering
of the heterologous production of clorobiocin derivatives
and elloramycin in Streptomyces coelicolor M512. Metab
Eng, 2006, 8(6): 653-61
[7] Garrido LM, Lombo F, Baig I, et al. Insights in the
glycosylation steps during biosynthesis of the antitumor
anthracycline cosmomycin: characterization of two
glycosyltransferase genes. Appl Microbiol Biotechnol, 2006,
73(1): 122-31
[8] Zhang C, Fu Q, Albermann C, et al. The in vitro characteriza-
tion of the erythronolide mycarosyltransferase EryBV and
its utility in macrolide diversification. ChemBioChem, 2007,
8(4): 385-90
[9] Liu T, Kharel MK, Fischer C, et al. Inactivation of gilGT,
encoding a C-glycosyltransferase, and gilOIII, encoding a
P450 enzyme, allows the details of the late biosynthetic
pathway to gilvocarcin V to be delineated. ChemBioChem,
2006, 7(7): 1070-7
[10] Luzhetskyy A, Fedoryshyn M, Durr C, et al. Iteratively acting
glycosyltransferases involved in the hexasaccharide
biosynthesis of landomycin A. Chem Biol, 2005, 12
(7): 725-9
[11] Peiru S, Menzella HG, Rodriguez E, et al. Production of the
potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escheri-
chia coli. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(5): 2539-47
[12] Liu W, Nonaka K, Nie L, et al. The neocarzinostatin biosyn-
thetic gene cluster from Streptomyces carzinostaticus ATCC
15944 involving two iterative type I polyketide synthases.
Chem Biol, 2005, 12(3): 293-302
[13] Li SM, Heide L. The biosynthetic gene clusters of aminocoumarin
antibiotics. Planta Med, 2006, 72(12): 1093-9
[14] Huang F, Haydock SF, Mironenko T, et al. The neomycin
biosynthetic gene cluster of Streptomyces fradiae NCIMB
8233: characterisation of an aminotransferase involved in
the formation of 2-deoxystreptamine. Org Biomol Chem,
2005, 3(8): 1410-8
[15] Durr C, Schnell HJ, Luzhetskyy A, et al. Biosynthesis of
the terpene phenalinolactone in Streptomyces sp. Tu6071:
analysis of the gene cluster and generation of derivatives.
Chem Biol, 2006, 13(4): 365-77
[16] Gullon S, Olano C, Abdelfattah MS, et al. Isolation,
characterization, and heterologous expression of the bio-
synthesis gene cluster for the antitumor anthracycline
steffimycin. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(6): 4172-83
[17] Lairson LL, Henrissat B, Davies GJ, et al. Glycosyl-
transferases: structures, functions, and mechanisms. Annu
Rev Biochem, 2008, 77: 521-55
[18] Breton C, Snajdrova L, Jeanneau C, et al. Structures and
mechanisms of glycosyltransferases. Glycobiology, 2006,
16(2): 29R-37R
[19] 袁宁, 胡又佳, 朱春宝. 蛋白定向进化及应用进展. 中国
生化药物杂志, 2008, 29(1): 65-8
[20] Aharoni A, Thieme K, Chiu CPC, et al. High-throughput
screening methodology for the directed evolution of
glycosyltransferases. Nat Methods, 2006, 3(8): 609-14
[21] Wang PG. The charged sialic acid exhibits its power again: a
new high-throughput screening technology. Nat Methods,
2006, 3(8): 589-90
[22] Williams GJ, Zhang C, Thorson JS. Expanding the promis-
cuity of a natural-product glycosyltransferase by directed
evolution. Nat Chem Biol, 2007, 3: 657-62
[23] Williams GJ, Thorson JS. A high-throughput fluorescence-
based glycosyltransferase screen and its application in di-
rected evolution. Nat Prot, 2008, 3(3): 357-62
[24] Williams GJ, Goff RD, Zhang CS, et al. Optimizing
glycosyltransferase specificity via “Hot spot” satura-
tion mutagenesis presents a catalyst for novobiocin
glycorandomization. Chem Biol, 2008, 15(4): 393-401
[25] Persson M, Palcic MM. A high-throughput pH indicator
assay for screening glycosyltransferase saturation mutagen-
esis libraries. Anal Biochem, 2008, 378(1): 1-7
[26] Park SH, Park HY, Sohng JK, et al. Expanding substrate
specificity of GT-B fold glycosyltransferase via domain
swapping and high-throughput screening. Biotechnol Bioeng,
2009, 102(4): 988-94