全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ００１
收稿日期：２０１３－１２－１０
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＡＡ０２Ａ２１１）；国家自然科学基金（２１２０６０５５）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１２１２７）
作者简介：付珍珍（１９８９—），女，湖北宜昌人，硕士研究生，研究方向：发酵工程； 李　 会（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｈｕｉ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １羟基化去氢表雄酮的工艺
付珍珍１，李　 恒２，李　 会２，许正宏２
（１􀆰 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 ２１４１２２； ２􀆰 江南大学 药学院，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：利用 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １对甾体化合物去氢表雄酮（ＤＨＥＡ）进行 Ｃ７α 羟基化反应研究。 用单因
素实验的方法考察接种量、装液量、转速、有机溶剂助溶、投料浓度以及底物投加时间对产物 ７α 羟基去氢表雄酮
（７α ＯＨ ＤＨＥＡ）生成的影响。 最终确定最适工艺条件：接种量 ６％，装液量 ３０ ｍＬ（２５０ ｍＬ 三角瓶），转速 ２２０
ｒ ／ ｍｉｎ，体积分数 ６％丙二醇助溶，接种时即添加底物，底物 ＤＨＥＡ质量浓度 １ ｇ ／ Ｌ，转化时间 ３６ ｈ。 采用优化后的转
化条件，７α ＯＨ ＤＨＥＡ摩尔得率为 ７２􀆰 ３４％。
关键词：生物转化；７α 羟基化；去氢表雄酮；甾体；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
中图分类号：ＴＱ９２０􀆰 ６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－０００１－０５
Ｃ７α⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ ｂｙ
Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３⁃１
ＦＵ Ｚｈｅｎｚｈｅｎ１，ＬＩ Ｈｅｎｇ２，ＬＩ Ｈｕｉ２，ＸＵ Ｚｈｅｎｇｈｏｎｇ２
（１􀆰 Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃ７⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ （ ＤＨＥＡ） ｂｙ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３⁃１． Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｃ７⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ａｓ ｔｈｅ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ６％ （Ｖ ／ Ｖ）， ｍｅｄｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ ３０ ｍＬ （ｐｅｒ ２５０ ｍＬ ｆｌａｓｋ），
ｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ ２２０ ｒ ／ ｍｉｎ， ＤＨＥＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ １ ｇ ／ Ｌ， ｃｏ⁃ｓｏｌｖｅｎｔ ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （６％， Ｖ ／ Ｖ）， ａｄｄｉｎｇ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｗｉｔｈ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ３６ ｈ． Ｔｈｅ ｍｏｌａｒ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ７α⁃ＯＨ⁃
ＤＨＥＡ ｆｒｏｍ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＤＨＥＡ ｗａｓ ７２􀆰 ３４％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；７α⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ；ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ；ｓｔｅｒｏｉｄ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
　 　 自开展甾体化合物研究以来，甾体药物在医疗
领域的应用范围便不断扩大，被用于治疗多种疾
病［１］。 其中，甾体化合物去氢表雄酮（ＤＨＥＡ）及其
羟化物被证实具有重要的生理活性和药理作用，是
甾体药物研究领域的重点。 国外研究报道，ＤＨＥＡ
及其代谢产物能够促进机体的免疫应答［２］。 进一
步研究发现，ＤＨＥＡ 的 ７α 羟基衍生物 ７α ＯＨ
ＤＨＥＡ具有抗氧化、抗肿瘤以及免疫调节等重要的
药理作用［３］。 ７ 羟基甾体化合物已经被证实对治
疗癌症和阿尔茨海默病有一定疗效，此外它还具有
增强机体免疫功能、抗糖皮质激素作用和促进减肥
的功效［４］。
微生物对甾体底物的羟基化反应是利用微生物
代谢过程中的某一种酶或一组酶对外源性化合物进
行催化反应［５］，具有立体选择性、区域选择性、反应条
件温和、催化效率高、反应类型多、污染环境小等特
点，在甾体的生物转化中具有重要的地位和意
义［６－７］。 ＤＨＥＡ用 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ 和 Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ ＡＭ２１２进行生物羟化的产物是 ７α ＯＨ
ＤＨＥＡ和 ７β ＯＨ ＤＨＥＡ［８］。 Ｒｏｍａｎｏ 等［９］也研究
证实 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｉ 可以同时使 ＤＨＥＡ发生 ７α
和 １５α 羟基化。 根据已报道的文献，ＤＨＥＡ 最大投
料质量浓度为 １ ｇ ／ Ｌ，７α ＯＨ ＤＨＥＡ的最高收率为
６０􀆰 ２％，且转化周期为 ４ ｄ［１０］。 筛选具有羟化 ＤＨＥＡ
生成 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ的菌株，并且提高其底物添加
浓度和转化效率有重要的意义。
赤霉菌 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １是笔者所在实
验室筛选得到的具有羟化 ＤＨＥＡ生成 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ
的菌株，但目前该菌株转化能力仍然偏低。 文中笔者对
Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １羟化ＤＨＥＡ生成 ７α ＯＨ
ＤＨＥＡ的条件进行优化，以期提高产物得率。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
赤霉菌 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １由笔者所在
实验室成员筛选得到，保藏在中国微生物菌种保藏管
理委员会普通微生物中心，编号为 ＣＧＭＣＣ Ｎｏ􀆰 ４９０３。
１􀆰 １􀆰 ２　 试剂
ＤＨＥＡ、７α ＯＨ ＤＨＥＡ均为分析纯，由浙江仙
居君业药业有限公司提供；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、
Ｎ，Ｎ 二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）、乙醇、丙三醇、甲醇、丙
二醇、丙酮，均为化学纯，国药集团化学试剂苏州有
限公司；乙腈，色谱纯，国药集团化学试剂苏州有限
公司；其他试剂为市售分析纯。
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基
斜面培养基（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ５、酵母粉 １０、ＮａＣｌ
５、ＫＨ２ＰＯ４ １５、琼脂 ２０，ｐＨ ７􀆰 ０。
种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ５、酵母粉 １０、ＮａＣｌ
５、ＫＨ２ＰＯ４ １５，ｐＨ ７􀆰 ０。
转化培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 １５、酵母粉 １５、玉米
浆 ２􀆰 ０、ＮａＣｌ ５，ｐＨ ６􀆰 ５。
１􀆰 ２　 培养和转化方法
１􀆰 ２􀆰 １　 种子培养
在 ５００ ｍＬ三角瓶中加入 ５０ ｍＬ培养液，１２１ ℃
灭菌 ２０ ｍｉｎ，然后将活化后的菌种接入三角瓶，在
３０ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 的恒温摇床上培养 ２４ ｈ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 菌体培养
在 ２５０ ｍＬ 三角瓶中装入 ３０ ｍＬ培养液，１２１ ℃
灭菌 ２０ ｍｉｎ，将种子液以体积分数为 ４％接种量接
种至发酵培养基中，在 ３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ的恒温摇床
上培养 ２４ ｈ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 生物转化
准确称取一定量的 ＤＨＥＡ 加入到已培养 ２４ ｈ
的菌液中，或者将底物溶于不同的有机溶剂中，超
声 ５ ｍｉｎ 以加速底物的溶解，然后加入到已培养
２４ ｈ的菌液中，在 ３０ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 的恒温摇床上转
化培养 ４８ ｈ，每隔一定时间取样检测转化效果。
１􀆰 ３　 分析方法
１􀆰 ３􀆰 １　 质谱分析
电离源 电喷雾电离（ＥＳＩ）；毛细管电压 ２􀆰 ８０ ｋＶ；
锥空电压 ４０ Ｖ；源温度 １１０ ℃；脱溶剂温度 ３５０ ℃。
１􀆰 ３􀆰 ２　 高效液相色谱法［１１］
取一定量发酵液，用等体积乙酸乙酯萃取 ４次，
合并萃取液并烘干。 用 ５ 倍体积的乙腈复溶，０􀆰 ２５
μｍ有机滤膜过滤，采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）进行
测定。 对照标准曲线计算含量。 测定条件：Ｃ１８ 柱，
流动相 Ｖ （乙腈） ∶ Ｖ （水） ＝ ７０ ∶ ３０；流速为 ０􀆰 ５
ｍＬ ／ ｍｉｎ；进样量为 １０ μＬ；柱温为 ３０ ℃。
１􀆰 ３􀆰 ３　 计算方法
产物得率 ＝ ρ（产物）
× Ｍ（底物）
ρ（底物） × Ｍ（产物）
（１）
式中：ρ（产物）为液相测得的产物质量浓度（ｇ ／ Ｌ）；
ρ（底物）为投加的底物质量浓度（ｇ ／ Ｌ）；Ｍ（底物）与
Ｍ（产物）分别为底物与产物的摩尔质量（ｇ ／ ｍｏｌ）。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 转化产物分析
２􀆰 １􀆰 １　 转化产物高效液相色谱分析
赤霉菌 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １ 对 ＤＨＥＡ
的转化液高效液相检测结果如图 １ 所示。 化合物 ３
为底物，１和 ２ 分别为转化产物。 图 ２ 为产物标准
品的高效液相检测结果。 由图 １ 和图 ２ 可以看出，
标准品和转化产物 ２ 的保留时间一致，可以初步确
定产物 ２为 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ。
２􀆰 １􀆰 ２　 转化产物质谱分析
赤霉菌 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １对 ＤＨＥＡ的
转化液质谱检测结果如图 ３所示。 通过分析可得到
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
结果：ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ ／ ｚ［２Ｍ＋ＮＨ４］
＋ ６２６􀆰 ３、［３Ｍ＋ＮＨ４］
＋
９３０􀆰 ６。 结果表明样品的相对分子质量为 ３０４􀆰 ２，与
７α ＯＨ ＤＨＥＡ（Ｃ１９Ｈ２８Ｏ３）的相对分子质量一致。
图 １　 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １转化 ＤＨＥＡ
的产物高效液相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＨＰＬＣ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＤＨＥＡ
ｂｙ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３⁃１
图 ２　 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ标准品的高效液相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＨＰＬＣ ｏｆ ７α⁃ＯＨ⁃ＤＨＥＡ ｓｔａｎｄａｒｄ
图 ３　 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １转化 ＤＨＥＡ产物的质谱
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ＭＳ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＤＨＥＡ
ｂｙ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３⁃１
２􀆰 ２　 接种量对转化的影响
选择不同接种量进行发酵培养，研究其对转化
的影响，结果如图 ４所示。 由图 ４ 可知：ＤＨＥＡ质量
浓度为 ３ ｇ ／ Ｌ、接种量为 ６％时，产物 ７α ＯＨ
ＤＨＥＡ得率最高，为 ２８􀆰 ３５％。 在发酵过程中，接种
量过大，生物量过大造成菌液黏稠，对转化过程溶
氧不利；接种量过小，菌体生长过慢，同样不利于转
化［１２］，故最佳接种量为 ６％。
图 ４　 接种量对生物量及产物得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ３　 装液量和转速对转化的影响
图 ５和图 ６是装液量和转速对转化的影响。 由
图 ５和图 ６可知，装液量和转速对 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ
的得率影响很大。 ２５０ ｍＬ三角瓶中装液量为 ３０ ｍＬ
时，产物得率最大。 甾体羟化是一个耗氧过程［１３］，
装液量较多，溶氧下降，进而导致转化效果不佳。
在一定范围内，增加摇瓶转速，溶氧水平相应增加，
可提高产物得率。 在 ２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 时，产物得率较高，
达到 ３０􀆰 ２２％，但继续增加转速，得率反而下降。 转
速过大，菌体受到较强的剪切作用，不利于菌体的
生长，生物量下降。 所以，装液量选择为 ３０ ｍＬ，转
速为 ２２０ ｒ ／ ｍｉｎ较佳。
图 ５　 装液量对生物量及产物得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎ ｆｌａｓｋ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ４　 底物助溶剂种类及添加量
２􀆰 ４􀆰 １　 底物助溶剂种类
甾体化合物 ＤＨＥＡ在水中的溶解度很低［１４］，属
于微溶或难溶化合物，而甾体羟化酶属于胞内酶，
底物只有通过扩散进入细胞才能与酶接触，从而进
３　 第 １期 付珍珍等：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １羟基化去氢表雄酮的工艺
图 ６　 摇床转速对生物量及产物得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｙｉｅｌｄ
行转化反应，这就限制了底物和胞内羟化酶的有效
接触和反应。 甾体底物的难溶性对生物羟化反应
的速率和产物得率有重要的影响，是导致转化效率
偏低的重要原因之一。 目前，在甾体生物转化中常
用添加助溶剂的方法提高底物在水相的浓度。 本
研究中笔者以有机溶剂对底物的溶解性以及其对
菌体的毒性为依据，选择 ７种常用的有机助溶剂，包
括 ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、乙醇、丙三醇、甲醇、丙二醇和丙酮
来提高底物 ＤＨＥＡ在转化液中的浓度和分散度，助
溶剂对 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ 得率影响如图 ７ 所示。 由
图 ７可见：与对照相比，在菌液中加入体积分数 ４％
的助溶剂丙二醇后，产物得率有明显提高，故选择
丙二醇作为最佳助溶剂。
图 ７　 不同有机助溶剂对产物得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ４􀆰 ２　 助溶剂添加量
助溶剂的加入量控制至关重要，考察丙二醇的
添加浓度对 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ得率的影响，结果如图
８所示。 由图 ８ 可知：丙二醇体积分数由 ２％增至
６％，产物 ７α ＯＨ ＤＨＥＡ 得率由 ３５％增加到
４２􀆰 １２％，但过高浓度的丙二醇会对菌体生长产生影
响，抑制细胞中羟化酶的活性，导致产物得率明显
降低。 因此，丙二醇的体积分数应控制在 ６％。
图 ８　 丙二醇体积分数对产物得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ５　 投料浓度对转化的影响
底物 ＤＨＥＡ加入量过少会导致微生物的羟化能
力得不到充分利用，增加生物转化的批次和成本，而
过高浓度的底物对菌体有一定的毒害性，影响菌体正
常的生长和代谢，导致菌体对底物的转化能力下降，
故需要选择最适的底物添加浓度［１５］。 投料浓度对转
化的影响如图 ９所示。 由图 ９可知，７α ＯＨ ＤＨＥＡ
得率随底物浓度的增加而显著降低，底物质量浓度较
低时（１ ｇ ／ Ｌ），产物得率最高，达 ５６􀆰 ７８％。
图 ９　 底物投料质量浓度对产物得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ６　 底物投加时间对转化的影响
羟化酶为诱导酶，能被底物诱导，故底物的添
加时间往往对转化效果产生显著影响［１６］。
因此，分别在赤霉菌生长不同时期加入底物，转
化过程取样检测，以转化过程中的最高得率作为此条
件下的产物得率，结果如表 １所示（表中转化周期指
接种到转化结束的时间）。 由表 １ 可知：在０ ｈ时，即
菌体开始培养时添加质量浓度为 １ ｇ ／ Ｌ的底物，转化
３６ ｈ，此时产物得率最大，达到 ７２􀆰 ３４％，高于初始条
件下菌体培养 ２４ ｈ时添加底物。 在该条件下既能对
羟化酶进行预诱导，得到最高产物得率，同时也减少
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
菌体培养时间，从而缩短了整个转化周期，且菌体培
养和转化时间均短于文献报道水平［１０］。
表 １　 底物投加时间对产物得率的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｅｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｙｉｅｌｄ
底物投加时间 ／ ｈ 转化周期 ／ ｈ ７α ＯＨ ＤＨＥＡ得率 ／ ％
０ ３６ ７２􀆰 ５２±２􀆰 １０
６ ４３ ７０􀆰 ３４±１􀆰 １０
１２ ６２ ６５􀆰 ３２±１􀆰 ９５
１８ ６８ ５９􀆰 ０２±１􀆰 ７７
２４ ７２ ５６􀆰 ７８±１􀆰 ３０
３０ ８２ ４０􀆰 ４４±１􀆰 ５１
２􀆰 ７　 转化过程分析
在最佳工艺条件下，对 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
ＣＡ３ １转化 ＤＨＥＡ的过程进行分析，结果如图 １０所
示。 由图 １０可知：转化产物主要在对数生长期后期
至稳定期快速生成，在 ３６ ｈ 时，摩尔产物得率达到最
高（７２􀆰 ３４％）；转化 ３６ ｈ后产物得率开始快速下降，分
析其原因是由于产物继续被转化为其他副产物。 因
此，转化时间控制在 ３６ ｈ利于目的产物的生成。
图 １０　 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １转化 ＤＨＥＡ的过程曲线
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ＤＨＥＡ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｂｙ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３⁃１
３　 结论
通过单因素试验探讨了接种量、装液量、转速、
有机溶剂助溶、投料浓度以及底物投加时间对产物
７α ＯＨ ＤＨＥＡ 生成的影响，结果发现：６％接种
量、装液量 ３０ ｍＬ（２５０ ｍＬ三角瓶）、转速 ２２０ ｒ ／ ｍｉｎ、
底物质量浓度 １ ｇ ／ Ｌ条件下，用体积分数 ６％丙二醇
助溶，菌体开始培养时即投入底物，转化时间 ３６ ｈ，
此时产物收率最高，达到 ７２􀆰 ３４％，高于文献报道水
平。 作为 １ 株高羟化能力的新菌株， Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １ 的培养时间和转化周期短、投料
工艺简单、菌体形态均匀、副产物易分离，为工业化
生产奠定了基础。 然而，对于工艺的溶料方式及添
加因子、放大条件等因素还有待进一步确定和优化。
参考文献：
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ｓｕｌｆａｔｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｖｉａ
ｌｏｃａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ⁃ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ［Ｊ］．Ｊ
Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，１９９９，８４（３）：３２６０⁃３２６７．
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ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｎｄ ７α⁃ｈｙｄｒｏｘｙ⁃ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｒｅｒｏｎｅ
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（责任编辑　 管　 珺）
５　 第 １期 付珍珍等：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＣＡ３ １羟基化去氢表雄酮的工艺