全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 1期
2008年 2月
Vol. 20, No. 1
Feb., 2008
文章编号 ：1004-0374(2008)01-0003-11
特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术
陈　磊，姚祝军*
(中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室，上海 200032)
摘　要：活体蛋白荧光标记技术已经被广泛应用于蛋白质功能的可视化研究中。荧光蛋白常被用来研究
蛋白质在生物体内的表达和定位，但由于它本身体积比较大，往往会影响目标蛋白的生物活性。特异
性的小分子荧光探针以其体积小、膜透性好、背景噪音低以及制备方便的优点成为蛋白质研究的一个有
力工具。本文将简要介绍近几年来各类特异性小分子蛋白荧光探针的研究进展。
关键词：蛋白质；特异性标记；蛋白标记；小分子荧光探针
中图分类号：Q51; Q816　　文献标识码：B
Small-molecule fluorescent probes and their specific labeling
protocols for proteins
CHEN Lei, YAO Zhu-jun*
(State Key Lab of Bio-organic and Natural Products Chemistry, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese
Academy of Sciences, Shanghai 200032,China)
Abstract: Site-specific fluorescent labeling of proteins in vivo remains one of the most powerful techniques for
imaging complex processes in live cells. Although fluorescent proteins in a variety of colors are useful tools for
tracking expression and localization of fusion proteins in cells, these relative large tag can perturb protein
folding, trafficking and function. Site-specific small-molecule fluorescent probe with advantages of small size,
membrane permeability, low background and simple preparation will be an ideal tool in various studies of protein
functions. This article summarizes the advances in selective labeling of proteins by using small-molecule fluo-
rescent probes in recent years.
Key words: protein; imaging; site-specific labeling; small-molecule fluorescent probe
蛋白质是细胞功能的主要执行者。在许多情况
下，一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作
用的结果。许多重要的生命过程，如多亚单位蛋白
质复合体形成、细胞内信号转导、基因转录、蛋
白质转运、蛋白质修饰和降解等，都依赖于蛋白质
之间相互作用。因此，研究蛋白质的结构、功能
及其相互作用是理解细胞生命过程中各种内在机制
的关键。
近年来，随着蛋白质标记技术的不断发展与成
熟，对蛋白质的研究进入了一个高速发展的阶段。
蛋白荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、动态响
应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境的
优点，并且能够实现活体可视化分析，它在蛋白质
分析中得到了广泛应用。
1　天然蛋白荧光探针——绿色荧光蛋白(GFP)
谈到蛋白质的荧光标记，在这里不得不提一个
具有里程碑意义的事件——绿色荧光蛋白(green fluo-
rescent protein, GFP)[1]及其变体(如 CFP, YFP等)的
发现和它们在各种细胞事件的实时可视化研究中的
应用 [ 2 ]。作为一种良好的天然蛋白质荧光探针，
GFP具有操作简单，不需要任何外加底物或辅酶因
收稿日期：2007-10-29；修回日期：2007-11-27
基金项目：“973”项目(2002CB0713808); 国家自然
科学基金杰出青年基金(20425205)
*通讯作者：E-mail: yaoz@mail.sioc.ac.cn
4 生命科学 第 20卷
子，表达几乎不受种属范围的限制，易于得到性质
不同的突变体，具有特异性高、荧光稳定、无毒
害性等优点；但是由于 GFP体积较大(由 238个氨
基酸组成)，它在活体标记中可能会影响被标记的
蛋白质或细胞的正常生理功能[3,4]，而且它的中等光
稳定性也限制了它在单分子研究中的应用[5]。小分
子荧光探针以其立体位阻小、量子产率高、稳定性
强、标记速度快并且能够提供除了荧光之外的读出
的优点，成为更理想的蛋白质荧光探针[6-8]。
2　小分子蛋白荧光探针的发展
根据研究体系的需要，蛋白荧光探针对蛋白质
的标记可以分为定点荧光标记和非定点荧光标记。
非定点的荧光标记一般是通过目标蛋白上一些裸露的
氨基、巯基或羟基与一些带有活性反应基团的荧光
试剂(FITC、罗丹明绿、E-118、DTAF、Alexa488、
mBBr、5-IAF、Cy3TM)反应而实现(图 1)。经实践
证明，这些方法在目标蛋白的可视化及示踪检测中
是有效的[9-11]，但是，本身不具备专一的化学选择
性，有的甚至会将细胞破坏。在一些复杂的体系
中，如研究蛋白质之间的相互作用，酶与底物之间
的相互作用以及蛋白质结构的测定，特别是利用
FRET技术来研究蛋白质，用前面所提到的一些常
规的方法就无法实现目标蛋白特异性地定点标记，
且无法保证被标记的蛋白保持其原有的活性，这就
更需要发展一类特异性的小分子蛋白荧光探针来定
点标记蛋白。
特异性的小分子蛋白荧光探针一般包括两个部
分：有机小分子荧光团和对目标蛋白具有特别专一
性识别作用的特定配体或是化学官能团。通过基因
工程的手段对目标蛋白进行简洁的修饰，融入一个
能与荧光探针上的配体或是官能团发生专一高效作
用(成键相互作用或是非成键相互作用)的接受体，
通过两者的相互作用实现蛋白的定点荧光标记。受
体配体的相互作用一般包括半抗原 -抗体、生物素 -
抗生物素、酶 -底物、双砷染料 -四半胱氨酸标签
体系、荧光团 -镍离子 -六组氨酸标签体系和细胞友
好的化学连接反应。
现将从小分子荧光探针和目标蛋白的融合方式
来分别介绍近年来各类特异性蛋白荧光探针的发展
情况。
2.1　通过共价成键连接方式实现的蛋白荧光标记
2.1.1　正交有机化学反应在蛋白质荧光标记中的应
用
2.1.1.1　双砷染料-四半胱氨酸标签体系　Griffin等[12]
发展了一种很有前途的活细胞单分子标记方法。这
种方法所用的荧光标记探针为一类能够穿透细胞膜
和含有双砷基团的荧光分子(如 FlAsH-EDT2)。双砷
荧光标记分子进入细胞后，与连在重组目标蛋白质
末端的六肽标签CCXXCC序列(简称TC，其中X是
除了半胱氨酸以外的其他氨基酸)特异作用，生成
强荧光的共价结合的双砷 -四半胱氨酸体系(荧光强
度约为 FlAsH-EDT2的 5 0000倍)。在这个体系中，
活细胞表达的重组蛋白能够被可透膜的双砷染料特
异性标记(图 2 )。在这个体系中加入的乙二硫醇
(EDT)是一种解毒剂，它能够保护内源性的半胱氨
酸对，同时使染料在遇到最终的 TC靶之前保持不
发荧光。
目前已经开发出可产生蓝色(ChoXAsH)、绿色
(FlAsH)或红色荧光(ReAsH)的双砷染料。其中，基
于罗红素开发的红色标记染料ReAsH特别有用。如
用不同的双砷染料进行的程序标记可以指示蛋白质
分子的生长期[13]。钙调蛋白(CaM)[14]是一种 Ca2+结
合蛋白。活细胞中 C端带有 TC标签的重组钙调蛋
白(CaM-TC)被BarNile-EDT2特异性地标记后，它的
图 1　常用的蛋白荧光标记试剂
5第 1期 陈　磊，等：特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术
构象因为 Ca2+的浓度发生变化，相应地引起荧光强
度的变化。
Tsien等将人体GPCR蛋白A2A用 CFP(C端)和
FlAsH标记(位于细胞内的第三个环处)，通过检测
两个荧光团之间的 FRET效应来监测它的构象变化
以及在细胞内的激活过程：而同样的研究思路用
CFP和YFP组合代替上述的CFP和FlAsH组合就得
不到满意的结果，而且影响了A2A蛋白的AMP信号
传导。
双砷染料不仅可以与蛋白质的N-端和 C-端相
结合，它也能融入到蛋白质的内环或是α-螺旋的外
表面，并且基本不影响目标蛋白的生物活性。它已
经被用于研究酵母菌的微管蛋白[3]、受体与G蛋白
的相互作用[4]、染色体的移位[15]以及细菌在真核细
胞中分泌的病原体蛋白[16]。FlAsH-EDT2对蛋白的标
记还可以实现蛋白的亲和作用纯化，荧光团协助的
光失活[17](FALI)，而这是 GFP无法实现的。由于
双砷染料和目标蛋白是牢固的共价结合，这种标记
策略被用于蛋白的脉冲跟踪多色连续标记[18]，在这
样的实验中可以研究多蛋白复合体的组装、转移及
其动力学机制。
由于双砷染料结构上的特殊性(分子设计时既要
考虑分子本身的荧光性质，又要兼顾它与 TC标签
的反应性)，目前能够被应用于生物体系的染料仅
仅局限于两类分子骨架：荧光素和罗红素。基于荧
光素骨架的氟代双砷染料也被用于生物体系[19]；而
具有高亮度和光稳定性的罗丹明还不能直接改造成
为理想的双砷染料。Bhunia和Miller[20]发展了一种
通用制备方法，能够将一些常见的有机荧光小分子
转变为双砷染料。他在常见的荧光素双砷染料母体
上进行合理的化学修饰连上所需的其他荧光团，成
功制备了一系列具有不同荧光发射波长的新型双砷
染料，并进行了体外蛋白标记的研究(图 3)。
双砷染料 -四半胱氨酸标记体系具有背景噪音
低、母体蛋白功能影响小、荧光团共价连接牢固等
优点，并且整个体系可以通过电子显微镜监测。双
砷染料体系也存在一些缺点，当双砷染料用于含有
较多半胱氨酸残基的体系，它存在非特异性的连接
作用，而且这样的作用没法简单地通过加入过量的
乙二硫醇避免，所以检测的背景荧光较高。为了减
少非特异性的连接作用，Hoffman等[4]在原有的标
签的两侧连上了特定的氨基酸，得到了一个新的标
签(FLNCCPGCCMEP)，大大增加了它与 ReAsH的
特异性连接。此外，目标蛋白上 TC标签中的半胱
氨酸必须处于还原态，所以它比较适合应用在处于
还原环境的细胞质和细胞核中，而在氧化环境中，
如分泌器通道或是细胞膜则无法发挥其作用。
2.1.1.2　Staudinger-Bertozzi反应　经典的Staudinger
反应是一个叠氮化物和膦生成氮叶立德(aza-ylide)的
反应。氮叶立德在水的存在下可以自发生成一个胺
和一个膦氧化物。这个反应具有化学专一、产率
高、与水相容以及细胞环境友好等特性。Bertozzi
小组对上面的反应给予一定修饰，使之生成一个酰
胺键而不是产生胺[21](图 4A)。他们小组证明了这些
改良的Staudinger反应能够在 jurkat细胞表面很好地
进行：将 jurkat细胞放在含叠氮乙酰甘露糖胺的培
养液中生长，叠氮基团可以通过唾液酸生物合成途
径引入到细胞表面的糖蛋白上。此细胞和水溶性的
生物素化的膦作用，细胞上的叠氮基和膦反应生成
一个稳定的的肽键，从而形成了非天然的生物素化
图2　FlAsH-EDT2对活细胞中含有四半胱氨酸标签蛋白质的定点标记
图3　连有各种荧光团的双砷染料
6 生命科学 第 20卷
的细胞表面，加入连有抗生物素的荧光探针，就实
现了细胞表面的可视化(图 4B)。Bertozzi等[22]又将
上述的标记策略运用到老鼠细胞中。
2.1.1.3　Huisgen成环反应——Click反应　Kolb和
Sharpless[23]则发展了另一类水溶性的化学反应，称
为点击化学 (Click Chemistry)。这类反应是在 Cu(I)
的催化下，末端炔和叠氮化物高产率的生成 1，4
二取代的 1，2，3三唑(图 5)。反应物和产物在诸
多化学物质和反应条件下都能稳定存在。该反应的
高选择性、水兼容性和高产率的特点使它在细胞生
物学研究中具有巨大的应用前景。最近，Cravatt小
组利用此反应，发展了一个两步策略用于活细胞和
动物体内的蛋白质的荧光标记[24]。
Beatty等[25]应用Click反应在E. Coli细胞中进行
一个新合成蛋白的荧光标记。他们通过改造 t-RNA
合成酶将含有末端三键的非天然氨基酸 Eth或Hpg
(蛋氨酸和苯丙氨酸类似分子)(图 6)引入到一个新合
成 barstar蛋白中，然后通过一个 Cu(I)催化的高效
的环化反应将包含叠氮官能团的 7-羟基香豆素 3[26]
(形成三唑环后荧光强度大大增强)连接到目标蛋白
上，荧光显微镜观测发现这种新合成的蛋白主要分
布在细菌细胞的内质体中。为了证明这一结论，
Beatty等[25]又将内质体分离出来进行凝胶电泳分析，
发现其主要成分确实是标记的 barstar蛋白。
2.1.1.4　天然化学链接反应　Wieland小组和Brenner
小组第一次完整地建立了利用天然化学链接反应的
化学体系，并于 1994年被Dawson小组证明其是天
然蛋白质半合成的通用方法(图 7)。这个反应的重
要特征是它的高化学选择性，它只发生在肽的N-端
半胱氨酸残基上，即使其他未保护的边链的内部含
有半胱氨酸残基也不会干扰。
Yeo等[27]将含有半胱氨酸氮端的目标蛋白通过
内蛋白介导的蛋白剪接在活细胞中表达后，与含有
硫酯的小分子荧光探针发生天然链接反应，从而得
到了所需的荧光标记蛋白。只有很少一些内源性的
含N-端半胱氨酸残基的蛋白质存在于各种各样细菌
和哺乳动物的基因库中，这使得基于天然链接反应
的标记方法可在不同的活细胞成像实验中得到应用。
2.1.1.5　Diels-Alder反应　Diels-Alder反应具有很高
的化学选择性，尤其当它在水相中进行时，它的反
应速率和选择性比在通常的有机相中还高。它的反
应组分双烯体和亲双烯体在细胞内都是惰性的。因
此，Diels-Alder反应可以作为一个理想的连接反应
用于蛋白的荧光标记。利用这个反应，Palomo等[28]
实现了囊泡控制酶——Rab GTP酶的定点荧光标记，
并研究了它在REP-1蛋白以及异戊烯基转运酶的协
同作用下在细胞壁上的定位，得出的结论和以前
用 GFP荧光标记法是一致的。关键的 D-A反应是
图5　Click反应用于蛋白的标记
图4　Bertozzi-Staudinger反应的反应机理以及它在活细胞标记中的应用
图6　连有末端三键的非天然氨基酸和叠氮香豆素
7第 1期 陈　磊，等：特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术
在 25℃，40µmol/L蛋白浓度，24h的条件下完成
的 (图 8)。
2.1.2　酶参与的细胞反应在蛋白质荧光标记中的应
用
2.1.2.1　AGT和受体组合荧光探针　Johnsson等
在研究人体 DNA修复蛋白(hAGT，相对分子质量
25 000，与GFP相近)时(图 9A)，发现了一种新的
融合蛋白策略[29]。它将 hAGT蛋白融合到目标蛋白
上，然后利用 hAGT蛋白本身的活性(将DNA上的
氧上被烷基化的鸟嘌呤的烷基转移到它本身的半胱
氨酸的硫原子上)，在硫原子上进行细胞友好的烷
基化反应，将标签分子连结到目标融合蛋白上(图
9B)。hAGT蛋白能够识别的鸟嘌呤底物类型非常
多，其中以苄基鸟嘌呤衍生物最为常见，到目前
为止，已经有 20多种苄基鸟嘌呤底物被用于蛋白
标记[8]。Johnnson等将此策略应用于大鼠卵巢细胞
(本身无AGT酶) 中 hAGT融合蛋白的荧光标记。在
随后的研究中，各种各样的细胞蛋白(包括哺乳动
物、酵母菌、细菌等)被标记 [ 30 , 3 1]。
hAGT和苄基鸟嘌呤衍生物的反应相对来说是很
快的，最近分离到的高活性hAGT突变体和BGFL反
应的二级速率常数为 8 000 s-1 mol/L-1。这种标记策
略的一个局限性是生物体内大量存在的野生型的
AGT会影响标记的特异性。酵母菌和E. coli的AGT
不会和苄基鸟嘌呤衍生物反应，但是哺乳动物细胞
中的 AGT能与苄基鸟嘌呤衍生物反应。Johnsson
等[32]合成了一种野生型AGT酶的抑制剂并得到了一
系列AGT的突变体，这种野生型AGT的抑制剂对
AGT突变体没有作用。在目标蛋白和AGT突变体
(182个氨基酸，对烷基化的DNA没有作用)融合蛋
白所在的细胞中，事先注入野生型AGT抑制剂，然
后再注入苄基鸟嘌呤衍生物，就可以实现蛋白的特
异性标记，这样一种改良方法拓展了AGT标记策略
的应用范围。目前已经有多种野生型AGT抑制剂和
AGT突变体可以很方便地购买到。
基于AGT的标记策略可以实现对标记的蛋白进
行体内长达几个小时的实时跟踪，最后随着融合蛋
白的降解，探针失效。由于融合 AGT蛋白本身体
积较大，可能会影响目标蛋白的活性。
2.1.2.2　脱卤酶和受体组合荧光探针　普洛麦格公
司(Promega)的研究者利用脱卤素酶的特性提出了一
种与AGT融合蛋白类似的新的蛋白标记策略。野生
型的脱卤素酶能够使脂肪族卤代物脱卤变成醇，这
个过程可能通过两步完成：脱卤酶先发生亲核取代
反应，脂肪族底物与天门氨酸盐形成酯，接着酯水
解断裂生成最终产物醇。对脱卤酶结构进行一些改
变就能使它催化的脱卤反应停留在酯的阶段。将这
样变异的脱卤酶和目标蛋白融合与各种连有不同报
告基团的氯代物进行反应，就能实现蛋白的特异标
记(图 10)。这种方法专一性好，无论在真核生物细
胞或是 E. coli细胞都能得到应用，但是脱卤酶本身
由 293个氨基酸组成，体积是目前所报道的蛋白标
签中最大的。
2.1.2.3　PPtase和受体(PCP、ACP)组合荧光探针　
生物体内的磷酸泛酰巯基乙酰转移酶(PPtase)可以将
磷酸泛酰巯基乙胺基团从辅酶A(CoA)上转移至酰基
载体蛋白ACP的一个丝氨酸侧链上，形成专一性的
共价结合。进一步研究发现，在辅酶A的巯基上进
行化学修饰后(连上生物素、荧光素等其他小分子)
它仍然能够实现 PPtase催化下的基团转移反应[33, 34]，
这就为它用于蛋白质的特异性标记打下了基础(图
11)。由于ACP蛋白序列中没有半胱氨酸残基，这
种策略可以被应用于氧化环境细胞表面GPCR蛋白
图7　天然化学链接反应用于蛋白荧光标记
图8　Diels-Alder反应用于蛋白荧光标记
图9　hAGT融合蛋白标记策略
8 生命科学 第 20卷
的各种标记。George等[35]将这种思路首先用于酵母
菌细胞表面 a-凝集素受体蛋白Avga2p的荧光标记。
他们先将Avga2p蛋白与酰基载体蛋白ACP融合，融
合蛋白在6×His-PPtase以及荧光团修饰的辅酶CoA-
Cy3的作用下实现定点专一性荧光标记。运用类似
方法，George等[35]实现了人类细胞表面G蛋白结合
受体 NK1的荧光标记。
与ACP/PPtase组合类似，Walsh等发展了多肽载
体蛋白 PCP与 PPtase组合用于蛋白的生物素标记[36]。
此后，Walsh等又将此标记策略结合 FRET技术应
用于细胞从环境摄取铁的内吞机制研究[37]。他们将
转铁蛋白受体 TfR1与 PCP融合，然后应用 PPtase/
CoA-Alexa Fluor 488组合对 TfR1进行特异荧光标
记，转铁蛋白用 Alexa Fluor 568标记，通过检测
两个荧光团之间的 FRET效应，来对细胞摄取铁的
过程进行实时跟踪。
Burkart等运用CP/PPtase/CoA-stilbene组合对VibB
蛋白进行标记，从而对它进行荧光和亲和作用双重分
析[38]。Walsh等将 PCP融合到抗菌素表面，利用各
种CoA底物，在抗菌素上连上了不同的报告分子[39]。
基于PCP或ACP和PPtase组合的蛋白标记策略
主要具有以下优点：(1)PPtase协助的共价连接标记
策略具有高效专一性，10—20min即可完成标记(无
论在活细胞内或是体外)，这样有利于实时观测细
胞事件；(2)ACP或是 PCP标签体积小(由 80个左右
的氨基酸组成)，对目标蛋白本身的生物活性影响
很小；(3)PPtase能够对多样的修饰 CoA底物实现高
效的基团转移作用，使蛋白标记多样化。
2.1.2.4　生物素连接酶和受体组合荧光探针　生物
素连接酶能够对连有它的受体的融合蛋白进行生物
素化，蛋白的特异性生物素化本身也具有重要的生
物学价值，同时运用现在已有的各种连有抗生物素
的荧光探针就可以对生物素化的蛋白进行荧光可视
检测。Ting等利用 E. coli生物素连接酶实现了细胞
表面蛋白的定点荧光标记[40]。E. coli细菌的生物素
连接酶BirA能够高效地将生物素连接到一种由15个
氨基酸组成的多肽序列CP(acceptor peptide)的赖氨酸
残基上。利用这一特性，巧妙将一个生物素的类似
物(其中的两个氮原子换成了两个亚甲基)在 BirA和
ATP协助下，与HeLa细胞的跨膜蛋白血小板生长
因子受体上(事先通过细胞转染的方法连上CFP-CP)
的 CP相连接，紧接着用含有酰肼的生物素探针 BP
对生物素类似物上的游离羰基进行成腙连接，完成了
跨膜蛋白的标记(图12)。为了研究这个标记策略的效
率，通过链亲和酶素——亚历山大 568(strepavidin-
Alexa 568)来对 BP探针荧光显色。结果表明转染成
功的细胞(通过检测 CFP的荧光)的跨膜蛋白被成功
标记(检测 Alexa 568)，而且标记速度非常快，整
个过程约为 20min。
EGFR蛋白(epidermal growth factor receptor)在
细胞内的运输行为以及配体参与的二聚或是多聚具
有重要的生物学意义。Ting等在 EGFR蛋白的N端
连上了 CP标签，然后在 BirA和生物素类似物下完
成了 CP标签的生物素化，最后加入BP探针实现了
EGFR蛋白的标记。他们通过免疫荧光检测的方法
(检测标记 EGFR蛋白在细胞中的分布)以及 EGF分
析手段，证明了 CP肽段的引入对 EGFR蛋白的活
性几乎没有影响，这为以后用各种其他探针研究
图11　ACP/PPtase组合用于蛋白标记 图12　生物素连接酶BirA用于蛋白标记
图10　脱卤酶融合蛋白标记策略
9第 1期 陈　磊，等：特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术
EGFR蛋白的生物功能创造了条件。这种基于生物
素连接酶的蛋白标记策略的最大优点在于它与目标
蛋白融合的标签比较小(15个氨基酸)，对目标蛋白
影响较小，而且用到的各种酰肼的衍生物也可以很
方便的制备，但是第二步的成腙反应比较慢，在pH
为 7的条件下，它的二级速率常数小于 1 s-1mol/L-1，
较AGT或是ACP标记反应小了三个数量级。为了
使标记反应能够在几分钟内完成，酰肼探针的浓度
往往要达到毫摩尔级，而且由于腙的形成反应是可
逆的，限制了它在一些酸性环境如内涵体中的应
用。
2.1.2.5　转谷氨酰胺酶(TGase)和受体组合荧光探针
　转谷氨酰胺酶(TGase)能够催化蛋白质肽链中受体
谷氨酸残基中的γ-酰胺基团转移到一个外加供体伯
胺的氨基上。TGase对发生反应的谷氨酸周围的蛋
白序列以及空间结构因素要求比较高，一些能够暴
露在溶剂中的谷氨酸才能作为酶底物，而对供体伯
胺的结构则没有太多要求。Sato[41]和 Taki等[42]发现
在一个蛋白的C端或是N端连上这样一段具有特定
序列的肽段(Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Met)，在
TGase催化下Gln4是优先作为反应的受体与外来的
胺反应。Weiss等[43]用已有的方法在胰凝乳蛋白酶
抑制剂 CI2(有 64个氨基酸组成)中引入 Cys40，并
在它的 N端引入一段多肽标签(Pro-Lys-Pro-Gln-
Gln-Phe-Met)，新引入的 Cys40由于裸露在蛋白表
面，所以它的巯基反应性最高。通过加入 Alexa
488的马来酰亚胺实现了 CI2的化学荧光标记。然
后在 TGase的催化下和荧光探针Alexa647-(CH2)6-
NH2反应，在多肽标签的Gln4处特异性地实现了连
接反应。虽然 CI2本身含有三个Gln残基，但由于
蛋白本身四级结构立体因素的影响，它们没有参与
酶反应。在得到了特异性的双荧光标记 C I 2 后，
Weiss等[43]利用单分子FRET技术研究了它的折叠性
质。
实验证明短肽标签(Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-
Met)的引入基本上不会影响蛋白本身的活性，在
TGase的催化下，酶反应高选择性的在标签上的
Gln4发生。对于本身Gln含量高的蛋白一般也有很
高的选择性，在特殊情况下可以对蛋白本身的某些
Gln用等排体Asn或是Glu代替。这样一种两步的
GTase参与的高专一性的蛋白双荧光标记策略为蛋
白单分子 FRET研究创造了有利的条件。
2.1.2.6　蛋白 -蛋白相互作用用于蛋白荧光标记　
Jäger等[44]巧妙地利用了蛋白 -蛋白相互作用实现了
CI2蛋白的双染料标记并通过FRET技术研究该蛋白
的结构。由于 CI2蛋白本身没有半胱氨酸，通过基
因的方法他们在N端Met1和 Lys2之间插入了一个
半胱氨酸，又将处于内环中心的Met40(对蛋白活性
不起作用)换成了 Cys40。CI2和枯草杆菌蛋白酶
(BPN)存在强烈的亲和作用，而 Cys40恰好处于亲
和作用的区域，在作用体中它的巯基反应活性被屏
蔽。在 CI2和 BPN的作用体中，加入 Alexa647，
它定点地与N端的 Cys相连，然后将CI2/BPN作用
体破坏，裸露的 Cys40再用Alexa488进行标记[45]。
通过简洁的三步操作，Jäger等[44]完成了对CI2蛋白
的双染料标记(图 13)。
2.2　非共价连接的蛋白荧光标记
2.2.1　六组氨酸标签 -镍 -荧光团络合物体系
Ebright等[46]首先报道了一种定点标记方法，这
种方法所用的短肽标签为 6个组氨酸，Cy3或 Cy5
荧光团通过两个连接臂，并经由两个镍离子与六组
氨酸标签通过强配位键络合，从而实现蛋白的定点
标记(图 14)，并证明了它在 FRET研究中应用的可
行性。与双砷染料 -四半胱氨酸标签体系相比，这
种体系可以应用于氧化性的细胞环境中，六组氨酸
标签可通过生物学方法连接到目标蛋白的 C-末端，
或者 N- 末端，也可以插入蛋白质肽链的中间。
Guignet等[47]将探针上的发色团部分改为荧光
素，合成了两个类似的小分子荧光探针 NTA-I和
图13　利用蛋白-蛋白相互作用实现蛋白的荧光标记
A = Alexa647, D = Alexa488
图14　镍-荧光团络合物对含有六组氨酸标签蛋白质
的定点标记
1 0 生命科学 第 20卷
NTA-II(图 15), 它们能够可逆地定点标记蛋白(可以
通过加入 EDTA实现蛋白的去荧光标记)。Guignet
等[47]在速激肽受体蛋白(一类G蛋白结合受体)的位
于细胞外的N端和细胞内的C端分别连上GFP和六
组氨酸标签，然后加入NTA-I型探针，检测到GFP
的荧光大大减弱，通过研究两个荧光团之间的
FRET效率，计算出两个荧光团之间的空间距离为
5.7nm[48]。类似的研究思路，他们用这种探针对活
细胞连有六组氨酸标签的5-羟色胺受体5HT3R跨膜
蛋白[49]进行标记后，通过 FRET技术来研究该跨膜
蛋白的结构。
Piehler等设计了 3-NTA-F型荧光探针，它们具
有三个Ni离子中心，对 6-His标签识别的特异性较
传统的双Ni离子中心探针又有增强(图 16) [50]。由
于存在三个配位点，它与蛋白的结合能力增强。他
们将其用于四蛋白相互作用体系的研究。
基于 6-His/NTA的标记策略可以在活细胞中实
现对蛋白的快速、可逆、专一的荧光标记，而不
会伤害母体细胞，而且这类探针制备简单，但这类
标记是通过非共价相互作用实现的，所以探针寿命
比较短(几分钟)，一般仅适用于膜外蛋白的标记。
最近，Tsien等[51]又设计了基于六组氨酸标签
的荧光探针(图 17)。和前面所提到的 6-His/NTA探
针的主要差别在于它选用了对细胞无毒性的，反应
惰性的 Zn2+。由于 Zn2+不具有荧光淬灭作用，所以
整个荧光探针可以设计得比较紧凑。与传统的 6-
His/NTA探针比，新型的 Zn2+中心探针与六组氨酸
标签之间的作用较强，可能是由于两个配位的 Zn2+
之间的距离缩短了。运用这种新型的荧光探针，
Tsien等[51]揭示了STIM1蛋白(控制钙离子通道激活)
包含钙离子受体域的N端是暴露在质膜外的。而以
前的各种荧光探针如荧光蛋白、HA标签以及辣根
过氧物酶都没有得出此结论。
2.2.2　F36V型荧光探针
Clackson等利用 FKBP12蛋白(含有 108个氨基
酸)与一种合成的配体因子(SLF)的高亲和力相互作用
研究了蛋白的二聚化。Marks等[52]提出了一种利用
FKBP12的变体(F36V)与相应的联有荧光团的配体
(FL-SLF’)存在高亲和力的特性来荧光标记牛乳糖
酶，在 3T3纤维原细胞中实现了光诱导产生单线态
氧的定点蛋白失活(图 1 8 )。在哺乳动物细胞中，
FL-SLF与 F36V融合的蛋白质连接，可以用来检测
蛋白的亚细胞定位，并且在 F36V融合的蛋白质表
达水平很低的情况下也能容易地检测出两者之间地
结合。另外，荧光的强度与 F36V融合蛋白的表达
水平成比例。
2.2.3　抗体、抗生物素型荧光探针
Farinas和Verkman[53]报道了基于半抗原－抗体
的结合作用设计的分子探针。他们选择单链的抗体
sFv作为受体，连有荧光素的抗原 phOx作为配体，
测量了高尔基体内腔的 pH值(荧光素的光谱性质受
pH值影响)。与他们的研究相似，Wu等[54]将融合
到目标蛋白的抗生物素蛋白在哺乳动物细胞中表
达，这些细胞随后与有着膜透性的连有生物素的荧
光探针一起培养，利用生物素－抗生物素蛋白的作
用实现了蛋白的荧光标记，并测量了细胞内分泌路
径的 pH值。然而，通过抗体或抗生物素蛋白对普
通的细胞内蛋白质进行标记时，效果不是很理想。
图15　小分子蛋白荧光探针NTA-I和NTA-II
图16　3-NTA-F型荧光探针
1 1第 1期 陈　磊，等：特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术
在胞质溶胶中表达抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋
白对胞质溶胶有毒性，而且生物素衍生的探针需要
和天然辅因子竞争才能结合到标签上，这两点大大
限制了该技术的应用范围。Farinas和Verkman[53]也
指出，自己所研究的抗体在还原环境的细胞中不能
很好地表达；另一方面抗生物素蛋白是相对分子质
量为 63 000的四聚体，它过大的体积会对目标蛋白
质的功能有所影响。
2.2.4　DHFR型荧光探针
Cornish等[54]提出一种以二氢叶酸还原酶(DHFR)
作为受体的蛋白质活体标记方法。DHFR是一种含
有 157个氨基酸的单体酶，DHFR抑制剂甲氨蝶呤
(Mtx)与 DHFR的结合具有很高的亲和力。另外，
Mtx能够抑制DHFR的蛋白水解，并且Mtx在 γ-羧
基处被化学修饰后并不改变其与 DHFR结合的性
质。因此在 γ-羧基连有荧光团的甲氨蝶呤常被用于
荧光标记DHFR，检测细胞中DHFR的浓度水平(图
19)。Remy和Michnick[55]在哺乳动物细胞中，将
DHFR与目标蛋白融合后，用连有荧光素的Mtx对
蛋白质进行标记，用于监测它的亚细胞定位。Miller
等[56]进一步在大鼠卵巢细胞中用Mtx-Texas RedTM选
择性标记与 E. coli. eDHFR融合的蛋白质(位于质膜
或是细胞核)，反应显示出很低的背景荧光值和快
速的动力学性质。
这种标记策略要面临这样一个主要问题：在洗
掉过量的荧光探针的同时，融合蛋白也会根据它与
荧光探针结合的牢固程度慢慢地失去它的荧光标记
标记物，因此这类标签的应用也受到了明显的限
制。
2.2.5　内蛋白介导的蛋白标记策略
Giriat和Muir [57]运用内蛋白介导的方法在活细
胞中成功实现了蛋白荧光标记。运用蛋白重组方法
先在目标蛋白 C端上融入 Ssp DnaE内切蛋白的一
半，然后将连有另一半内切蛋白的荧光探针以及蛋
白转导域肽(PTD)加入到细胞培养液中，内切蛋白
被分割的两半自连接后进行剪接，实现了目标蛋白
的荧光标记(图 20)。这样的标记过程往往需要几个
小时。
3　总结
后基因组时代的到来给生物学家和化学家们带
图 18　FKBP12（F36V）和其配体组合用于蛋白荧光标记
图19　DHFR/Mtx组合用于蛋白荧光标记 图20　内蛋白介导的蛋白标记策略
图17　锌-荧光团络合物对含有六组氨酸标签蛋白质
的定点标记
1 2 生命科学 第 20卷
来了新的挑战，对蛋白质功能的研究成了众多研究
领域的重要组成部分。近年来在蛋白质的特异荧光
标记方面，尤其是分子小、量子效率高的荧光探针
分子设计与应用方面的研究取得了较大进展，出现
了各种适用于不同体系的新颖的特异性标记策略。
ACP-PPTase组合体系、生物素连接酶 /受体组
合体系以及镍离子-六组氨酸标签体系仅仅适用于细
胞表面蛋白的标记，而细胞内蛋白的标记则需要借
助其他的标记策略。
在还原性环境中如内质网双砷染料 -四半胱氨
酸体系则可以发挥其优势，同时 F36V、DHFR、
hAGT型荧光探针也可以适用于还原性体系。而镍
离子-六组氨酸标签体系和单链抗体型荧光探针则可
以在氧化环境中实现蛋白的特异性标记。
基于融合蛋白的标记策略往往会因为融合蛋白
本身表达水平低而影响其检测的灵敏度，F36V型
探针，改良的 hAGT体系和DHFR型探针可以在融
合蛋白表达水平很低的体系中应用，并具有较高的
信噪比。双砷染料 -四半胱氨酸体系和生物素连接
酶体系对目标蛋白本身的生物功能影响较小。
实现不同的生物学目的，各种荧光探针也具有
不同的应用场合。到目前为止只有双砷染料 -四半
胱氨酸体系、ACP-PPTase体系以及 hAGT型探针
被应用于蛋白的多色标记定位以及脉冲追踪试验
中。在荧光团协助光失活研究中，F36V型探针以
及双砷染料－四半胱氨酸体系是最理想的。长时间
标记示踪试验(24h或更长)中，共价连接的标记策
略是比较理想的。hAGT型探针虽然是一种共价连
接的策略，但 hAGT融合蛋白的降解限制了它在长
时间示踪试验中的应用，而双砷染料 -四半胱氨酸
体系是细胞内蛋白长时间示踪的理想标记策略。生
物素连接酶和ACP-PPTase体系则可以运用于细胞表
面蛋白的长时间示踪。双砷染料 -四半胱氨酸体系
也是电镜分析的良好标记策略。到目前为止，在
FRET技术在生物体系的应用中，最为成熟的是双
砷染料 -四半胱氨酸体系，已有研究表明，CFP和
双砷荧光素之间 FRET效率是CFP和YFP之间效率
的5倍。
在各种生物环境复杂的细胞中实现目标蛋白的
特异性标记仍具有挑战性，尚未在真正意义上实现
运用多种参数对生物活体内各类蛋白质进行实时观
测，动态研究。在以后的研究工作中，我们要开
发出更多能用于活体内不同种类蛋白分析的特异性
小分子荧光探针，灵活采用不同的荧光探针与目标
作用方式，并结合激光共聚焦等荧光成像技术对蛋
白分子进行活体实时检测追踪。
[参　考　文　献]
[1] Shimomura O, Johnson FH, Saiga YJ. Extraction, purification,
and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the
luminous hydromedusan, Aequorea. Cell Comp Physiol,
1962, 59, 223-39
[2] Zhang J, Campbell RE, Ting AY, et al. Creating new fluores-
cent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, 3
(12): 906-18
[3] Andresen M, Schmitz-Salue R, Jakobs S. Short tetracysteine
tags to β-tubulin demonstrate the significance of small labels
for live cell imaging. Mol Biol Cell, 2004, 15(12): 5616-22
[4] Hoffmann C, Gaietta G, Bunemann M, et al. A FlAsH-
based FRET approach to determine G protein-coupled re-
ceptor activation in living cells. Nat Methods, 2005, 2(3):
171-6
[5] Steinmeyer R, Noskov A, Krasel C, et al. Improved fluores-
cent proteins for single-molecule research in molecular track-
ing and co-localization. J Fluoresc, 2005, 15(5): 707-21
[6] Miller LW, Cai Y, Sheetz MP, et al. In vivo protein labeling
with trimethoprim conjugates: a flexible chemical tag. Nat
Methods, 2005, 2(4): 255-7
[7] Los GV, Wood K. High content screening[M]// Methods in
molecular biology. Totowa: Humana Press, 2007, 356, 195
[8] Keppler A, Pick H, Arrivoli C, et al. Labeling of fusion
proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Natl
Acad Sci USA, 2004, 101(27): 9955-9
[9] Bell SP, Curran PK, Choi S, et al. Site-directed fluorescence
studies of a prokaryotic ClC antiporter. Biochemistry, 2006,
45(22): 6773-82
[10] Dong SY, Zhao ZW, Ma HM. Characterization of local
polarity and hydrophobic binding sites of β-lactoglobulin
by using N-terminal specific fluorescence labeling. J Proteome
Res, 2006, 5(1): 26-31
[11] Musse AA, Wang J, deLeon GP, et al. Physical interaction
and mutual transrepression between CCAAT/enhancer-bind-
ing protein β- and the p53 tumor suppressor. J Biol Chem,
2006, 281(1): 885-95
[12] Griffin BA, Adams SR, Tsien RY. Specific covalent labeling
of recombinant protein molecules inside live cells. Science,
1998, 281(5374): 269-72
[13] Adams SR, Campbell RE, Gross LA, et al. New biarsenical
ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro
and in vivo: Synthesis and biological applications. J Am Chem
Soc, 2002, 124(21): 6063-76
[14] Nakanishi J. Imaging of conformational changes of proteins
with a new environment-sensitive fluorescent probe designed
for site-specific labeling of recombinant proteins in live cells.
Anal Chem, 2001, 73(13): 2920-8
[15] Dyachok O, Isakov Y, Sagetorp J. Oscillations of cyclic
AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells.
Nature, 2006, 439(7074): 349-52
[16] Enninga J, Mounier J, Sansonetti P. Secretion of type III
effectors into host cells in real time. Nat Methods, 2005, 2
(12): 959-65
[17] Tour O, Meijer RM, Zacharias DA. Genetically targeted
chromophore-assisted light inactivation. Nat Biotechnol,
2003, 21(12): 1505-8
[18] Gaietta G, Deerinck TJ, Adams SR. Multicolor and electron
microscopic imaging of connexin trafficking. Science, 2002,
296(5567): 503-7
[19] Spagnuolo CC, Vermeij RJ, Jares-Erijman EA. Improved
1 3第 1期 陈　磊，等：特异性的蛋白小分子荧光探针及其标记技术
photostable FRET-competent biarsenical-tetracysteine
probes based on fluorinated fluoresceins. J Am Chem Soc,
2006, 128(37): 12040-1
[20] Bhunia AK, Miller SC. Labeling tetracysteine-tagged pro-
teins with a SplAsH of color: a modular approach to bis-
arsenical fluorophores. ChemBioChem, 2007, 8(14): 1642-5
[21] Saxon E, Bertozzi CR. Cell surface engineering by a modi-
fied Staudinger reaction. Science, 2000, 287(5460): 2007-10
[22] Prescher JA, Dube DH, Bertozzi CR. Chemical remodelling
of cell surfaces in living animals. Nature, 2004, 430(7002):
873-7
[23] Kolb HC, Sharpless KB. The growing impact of click chem-
istry on drug discovery. Drug Discov Today, 2003, 8(24):
1128-37
[24] Speers AE, Cravatt BF. Profiling enzyme activities in vivo
using click chemistry methods. Chem Biol, 2004, 11(4): 535-
46
[25] Beatty KE, Xie F, Wang Q, et al. Selective dye-labeling of
newly synthesized proteins in bacterial cells. J Am Chem
Soc, 2005, 127(41): 14150-1
[26] Sivakumar K, Xie F, Cash BM. A fluorogenic 1,3-dipolar
cycloaddition reaction of 3-azidocoumarins and acetylenes.
Org Lett, 2004, 6(24): 4603-6
[27] Yeo D, Srinivasan R, Uttamchandani M, et al. Cell-perme-
able small molecule probes for site-specific labeling of
proteins. Chem Commun, 2003, 23: 2870-1
[28] Palomo JM, Cramer J, Seitz O. Diels-Alder ligation of pep-
tides and proteins. Chem Eur J, 2006, 12(23): 6095-109
[29] Keppler A, Gendreizig S, Gronemeyer T. A general method
for the covalent labeling of fusion proteins with small mol-
ecules in vivo. Nat Biotechnol, 2003, 21(1): 86-9
[30] Keppler A, Kindermann M, Gendreizig S, et al. Labeling of
fusion proteins of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase
with small molecules in vivo and in vitro. Methods, 2004, 32
(4): 437-44
[31] Kindermann M, Sielaff I, Johnsson K. Synthesis and char-
acterization of bifunctional probes for the specific labeling
of fusion proteins. Bioorg Med Chem Lett, 2004, 14(11):
2725-8
[32] Juillerat A, Heinis C, Sielaff I, et al. Engineering substrate
specificity of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for
specific protein labeling in living cells. ChemBioChem, 2005,
6(7): 1263-9
[33] Belshaw PJ, Walsh CT, Stachelhaus T. Aminoacyl-CoAs as
probes of condensation domain selectivity in nonribosomal
peptide synthesis. Science, 1999, 284(5413): 486-9
[34] La Clair JJ, Foley TL, Schegg TR, et al. Manipulation of
carrier proteins in antibiotic biosynthesis. Chem Biol 2004,
11(2): 195-201
[35] George N, Pick H, Vogel H, et al. Specific labeling of cell
surface proteins with chemically diverse compounds. J Am
Chem Soc, 2004, 126(29): 8896-7
[36] Yin J, Liu F, Li X, et al. Labeling proteins with small mol-
ecules by site-specific posttranslational modification. J Am
Chem Soc, 2004, 126(25): 7754-5
[37] Yin J, Lin AJ, Buckett PD, et al. Single-cell FRET imaging of
transferrin receptor trafficking dynamics by sfp-catalyzed,
site-specific protein labeling. Chem Biol, 2005, 12(9): 999-
1006
[38] Shute TS, Matsushita M, Dickerson TJ, et al. A site-spe-
cific bifunctional protein labeling system for affinity and
fluorescent analysis. Bioconjug Chem, 2005, 16(6): 1352-5
[39] Yin J, Liu F, Schinke M. Phagemid encoded small molecules
for high throughput screening of chemical libraries. J Am
Chem Soc, 2004, 126(42): 13570-1
[40] Chen I, Howarth M, Lin W Y, et al. Site-specific labeling of
cell surface proteins with biophysical probes using biotin
ligase. Nat Methods, 2005, 2(2): 99-104
[41] Sato H. Enzymatic procedure for site-specific pegylation of
proteins. Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(4): 487-504
[42] Taki M, Shiota M, Taira K. Transglutaminase-mediated N-
and C-terminal fluorescein labeling of a protein can support
the native activity of the modified protein. Protein Eng Des
Sel, 2004, 17(2): 119-26
[43] Jäger M, Nir E, Weiss S. Site-specific labeling of proteins for
single-molecule FRET by combining chemical and enzymatic
modification. Protein Sci, 2006, 15(3): 640-6
[44] Jäger M, Michalet X, Weiss S. Protein-protein interactions
as a tool for site-specific labeling of proteins. Protein Sci,
2005, 14(8): 2059-68
[45] Radisky ES, Kwan G, Lu K, et al. Binding, proteolytic, and
crystallographic analyses of mutations at the protease-in-
hibitor interface of the subtilisin BPN´/chymotrypsin in-
hibitor 2 complex. Biochemistry, 2004, 43(43): 13648-56
[46] Kapanidis AN, Ebright YW, Ebright RH. Site-specific in-
corporation of fluorescent probes into protein: Hexahistidine-
tag-mediated fluorescent labeling with (Ni2+:Nitrilotriacetic
Acid) n-fluorochrome conjugatesfluorescent probes. J Am
Chem Soc, 2001, 123(48): 12123-5
[47] Guignet E G, Hovius R, Vogel H. Reversible site-selective
labeling of membrane proteins in live cells. Nat Biotechnol,
2004, 22(4): 440-4
[48] Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. Seven-transmem-
brane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, 3(9): 639-50
[49] Reeves DC, Lummis SC.The molecular basis of the struc-
ture and function of the 5-HT3 receptor: a model ligand-gated
ion channel. Mol Membr Biol, 2002, 19(1): 11-26
[50] Lata S, Gavutis M, Tampé R, et al. Specific and stable
fluorescence labeling of histidine-tagged proteins for dis-
secting multi-protein complex formation. J Am Chem Soc,
2006, 128(7): 2365-72
[51] Hauser CT, Tsien RY. A hexahistidine-Zn2+-dye label reveals
STIM1 surface exposure. Proc Natl Acad Sci USA, 2007,
104(10): 3693-7
[52] Marks KM, Braun PD, Nolan GP.A general approach for
chemical labeling and rapid, spatially controlled protein
inactivation. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(27): 9982-7
[53] Farinas J, Verkman A S. Receptor-mediated targeting of fluo-
rescent probes in living cells. J Biol Chem, 1999, 274(12):
7603-6
[54] Wu M M, Adams J, McCaffery J M, et al. Organelle pH
studies using targeted avidin and fluorescein-biotin. Chem
Biol, 2000, 7(3): 197-209
[55] Remy I, Michnick SW. Visualization of biochemical net-
works in living cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(14):
7678-83
[56] Miller LW, Sable J, Goelet P, et al. Methotrexate conjugates:
A molecular in vivo protein tag. Angew Chem Int Ed, 2004,
43(13): 1672-5
[57] Giriat I, Muir TW. Protein semi-synthesis in living cells. J
Am Chem Soc, 2003, 125(24): 7180-1