全 文 :生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 1期
2008年 2月
Vol. 20, No. 1
Feb., 2008
生物过程化学机制的单分子荧光探测
杨新星,赵新生*
(北京大学化学与分子工程学院化学生物学系,北京 100871)
摘 要:单分子荧光检测越来越广泛地被应用于生命科学领域。这项技术可以对生物过程的化学机制
进行定量、仔细的探究,与传统系综实验形成很好的互补。本文简介近几年单分子荧光检测研究的若
干典型实例,以此展示这项技术的特点、优势及其可能的应用。它们涉及从简单的生化反应到复杂的
蛋白表达调控等重要的生物过程。
关键词:单分子检测;荧光;生物过程;化学机制
中图分类号:Q-33 文献标识码:A
Probing chemical mechanism in biological processes via
single molecule fluorescence detection
YANG Xin-xing, ZHAO Xin-sheng*
(Department of Chemical Biology, College of Chemistry and Molecular Engineering,
Peking University, Beijing 100871, China)
Abstract: Single molecule fluorescence detection has been more and more broadly applied in life sciences.
Complementary to traditional ensemble experiments, this technique can quantitatively and carefully explore the
chemical mechanism behind a biological process. We present some typical systems studied by single molecule
fluorescence detection to demonstrate its feature, advantage, and application. These examples involve impor-
tant biological processes, from simple to complex reactions.
Key words: single molecule detection; fluorescence; biological process; chemical mechanism
文章编号 :1004-0374(2008)01-0022-07
1 背景
探索生物过程的化学性质及其运作机制是化学
生物学家和生物化学家的目标。在人类基因组计划
完成,蛋白质组学蓬勃发展的今天,生物体的化学
组成和静态结构逐渐明晰起来。接下来的任务是要
揭示这些化学物质在生物体内的动态行为和运动机
制,这项充满挑战和具有开拓性的课题为生物单分
子检测提供了一个大显身手的舞台。
单个分子检测的概念早在1959年就由Feynman
提出,而第一个真正意义上的单个分子实验就是和
生物学研究联系在一起。1 9 7 6 年,N e h e r 和
Sakmann[1]发明了膜片钳技术并记录了单个离子通道
产生的电信号。20世纪 90年代之后,随着室温条
件下溶液相中单分子荧光成像术的发展和成熟[2],
收稿日期:2007-11-22;修回日期:2007-12-19
基金项目:国家自然科学基金(20333010, 30490172);
“973”项目(2006CB910300)
*通讯作者:E-mail: zhaoxs@pku.edu.cn
单分子检测技术迅速成为研究生命活动机制的有力
手段。进入 21世纪以来,单分子的概念越来越为
人们所重视,这一领域的突飞猛进使我们对生命过
程的机制有了更深入的了解。
关于单分子检测的综述很多。本实验室也曾于
1999年、2005年在《大学化学》,2007年在《物
理》上对单分子光学检测及其在生物学上的应用作
过介绍[3-5]。本文将从最近的研究事例出发对单分子
荧光检测在揭示生物运动的动态过程和机制方面的
作用及优势进行介绍。限于篇幅,本文不涉及其他
2 3第1期 杨新星,等:生物过程化学机制的单分子荧光探测
单分子检测技术,如近场光学检测、原子力显微
镜、磁共振等。我们也不详细描述单分子荧光检测
的技术细节,对此可以参阅我们以前的文章[3-5]或
Bohmer和 Enderlein比较全面的综述[6]。
2 单分子检测与系综实验相比的特色
传统生物学技术主要在大量分子(或细胞)的水
平上和较长的时间尺度内(即系综水平)研究生命活动
的过程,对于化学结构的鉴定则主要基于X射线晶
体衍射和NMR。正是这些实验使得人们对生命的化
学本质有了深刻的认识,为进一步的研究奠定了基
础。然而,系综水平的研究本身也存在以下缺陷。
首先,系综条件下的实验是对许多分子(或细
胞)在一段时间内的系综平均。从统计意义上说,
它只得到分子行为的期望值(平均值),大量隐藏着
的分布的信息被忽略了,微观机理和结构上的异质
性也容易被掩盖。最早利用单分子荧光研究酶反应
构象动力学的 Rigler 小组就发现辣根过氧化物酶
(horseradish peroxidase)与底物结合的反应速率常数
呈很宽的分布,与产物裂解反应的单指数分布不
同,从而推测出酶与底物结合时的构象并不单一,
而是存在多种异质形式,不同形式具有不同结合速
率 [ 7 ]。
其次,对于很多生物体内的微量物质,比如低
拷贝低表达的蛋白,其行为或被其他分子掩盖或因
数量太少难于检测。最重要的是对于低含量的分
子,其偏离平均值的涨落可能会对功能有很大的贡
献,但在系综实验中,这种涨落很难体现出来。Yu
等[8]通过对大肠杆菌中被抑制的低表达蛋白的单分子
荧光信号检测验证了该蛋白的表达确实是随机的。
最后,生物过程中很多分子并非同时行使功
能,它们受控于复杂的信号网络;而在系综实验中
一般假设了比较一致的开始反应时间,但这种假设
在相当程度上是不合适的,如系综实验发现 α肾上
腺素受体在受到刺激后 20min左右开始内化进入细
胞,但我们实验室通过单分子成像实验确认,内化
在很短时间内就开始。系综实验无法分辨同时发生
的由内向外的其他受体分子的干扰,故而认为较长
时间后才有内化产生[9]。
单分子检测可以克服系综实验所存在的上述问
题。根据各态遍历假设(Ergodic Hypothesis),对于
处于热平衡的体系,关于单个分子的某个物理量足
够长时间的观察,统计平均与系综平均等效。对单
个分子性质的统计不仅得到平均值,也得到其分布
形式、涨落情况和少量分子的特异性,从而获得生
物过程的更全面的信息。对于非平衡体系,单分子
检测的优势则是独树一帜的,它提供了分子真实的
动态行为和动力学过程。
3 单分子荧光检测在生物研究中的最新进展
3.1 最基本的生化反应机理的研究
近年来很多的实验室采用单分子荧光的手段重
新审视生物体一些最基本的反应机制,在验证系综
结果的同时也得到了很多令人惊喜的发现。下面将
分几个方面给出一些比较有意思的例子。
3.1.1 DNA杂交解链动力学 单分子荧光检测的方
法于1996首先被Rigler小组应用于DNA杂交动力学
研究,得到了DNA 分子的扩散以及杂交的特征时
间[10]。Bonnet等[11]用类似的方法研究了标记有荧光
分子和淬灭剂的发卡型DNA的解链过程。Klenerman
小组则引入了 FRET的方法[12],并用拉伸的势能面
模型对DNA解链模式进行解释。之后他们更发展了
单个分子双色标记,双激发的 coincidence技术,可
以较容易地标记并对分子间反应进行检测。这项
技术已经应用在研究发卡型的 DNA、RNA解链反
应上[13]。在单个或几个分子的水平上,DNA反应
的更多细节逐渐被揭示出来,科学家发现其机制可
能是相当复杂和多通道的,绝非传统的两态模型所
能解释。
3.1.2 蛋白质的折叠及构象变化的过程 科学家们
早先利用X射线衍射、磁共振确定了多种蛋白质在
不同条件下的静态结构。同时在系综水平的动力学
实验也揭示了部分蛋白质折叠过程机制,指出了蛋
白质的折叠是在粗糙的沙漏状势能面上进行,趋于
沙漏的底部(自由能最低处)的过程[14]。最近单分子
检测也被应用到蛋白质折叠动力学研究这一领域。
2006年的Chemical Review杂志上Weiss等专门就这
一方面研究进行了深入的总结[15]。
最早关于蛋白质折叠的单分子 FRET研究来自
于Deniz等[16],他们统计单个胰凝乳蛋白酶抑制因
子 2(CI2)在不同变性剂浓度下统计单分子 FRET效
率分布,得到了与系综结果一致的两态折叠模型
(图 1),验证了单个分子检测蛋白质折叠模式的可
行性。随后在研究冷休克蛋白(Csp)的两态折叠时,
发现随变性条件的加剧,无规态的 FRET分布峰值
有持续的移动,而分布的宽度也超出预计。Groll等[17]
认为可能是蛋白质去折叠时伴有某一多肽链的二级
结构坍塌,而这种现象在系综条件下未被发现。
Guan等[18]在宽场条件下利用 FRET技术对热休
克蛋白MjHSP16.5的裂解机制进行了研究。通过轨
2 4 生命科学 第20卷
迹追踪,直接观测到了单个蛋白质聚集体在升温过
程中裂解成碎片的过程,并分析了该蛋白聚集体裂
解的多步反应机制:产物以偶数亚基为主,在不同
温度下解离决速步也并不相同,对于热休克蛋白在
高温下的保护机制有了更深入的了解。
非平衡态下的单分子研究将提供更多关于蛋白
质非折叠态的信息。Lipman和 Schuler[19]利用微流
体技术检测逐步复性的 Csp蛋白,验证了 FRET效
率峰值的快速位移和缓慢变化到高 FRET值的两个
过程,明确了 Csp折叠过程中快的坍塌和慢的折叠
两种过程,印证了 Schuler等[20]的猜想。另外,单
个分子检测与分子动力学(MD)计算相结合,会极大
地帮助了解蛋白质在体内的折叠机制。
3.1.3 酶反应动力学 酶作为一种蛋白质,与研究
蛋白质折叠时类似,可以利用荧光信号随时间的变
化来进行研究。Xie小组利用黄素酶核心反应位点
上色氨酸与FAD的ET(电子传递)作用对其酶反应动
力学做了一系列研究[21]。通过荧光寿命的相关分
析,他们发现酶反应过程中的构象变化势能面是粗
糙的,而且具有记忆效应。在之后对 β - 半乳糖苷
酶[22]的研究验证了酶的记忆效应,并得到了单分子
条件下的米式方程。Zhang等[23]利用荧光涨落谱和
荧光寿命分布对二氢叶酸还原酶与不同底物结合的
正逆反应速率进行了研究,发现底物存在时酶的构
象波动不同。
2006年,Chemical Review杂志专门推出了酶
反应动力学的单分子检测综述[24]。单分子检测对静
态和动态的异质性酶中间状态的甄别力将促进对酶
催化机制的深入理解。
3.1.4 膜表面扩散动力学及膜结构的研究 细胞膜
结构是生化反应、物质运输、信号转导等多种功能
集中的区域。由于细胞膜结构中含有多种非均匀分
布的脂质、蛋白,对于膜结构的模型一直还有争
论。即便是得到很多支持的脂筏模型(lipid raft)也没
有决定性的证据,更缺乏对脂筏性质(如尺寸、稳
定性、生理功能)的了解。最近的一篇综述[25]给出
了很多对膜上微结构的研究进展,但也认为还需要
更多新技术的帮助才能完全了解膜结构的本质。
单个分子荧光检测,尤其是全内反射荧光成像
技术恰好可以应用到这个方面来。Mayer等[26]通过
多色标记或 FRET的方法标记一些膜蛋白或脂类的
方法发现神经激肽 1受体,一种 G蛋白偶联受体,
定位在大约 10nm尺度的胆固醇敏感的膜上微区内。
单分子的轨迹追踪可以得到膜上分子的运动情况、
图1 单分子FRET检测蛋白质折叠[16,17]
注:右侧图,蛋白质通过一定方式固定在表面,确定其仍有活性后进行实验,在一定的变性剂浓度下蛋白质在折叠态和
非折叠态间达到平衡。而这两种状态下染料分子之间距离不同而分别为高 FRET效率态和低 FRET效率态。左侧图即是CI2
蛋白在不同变性条件下的 FRET效率分布图。从上到下,蛋白质逐渐变性,天然状态的高 FRET峰(0.95)逐渐消失,无规
状态的低 FRET处(0.65)出现一峰值。证实了 CI2的折叠是两态过程。
2 5第1期 杨新星,等:生物过程化学机制的单分子荧光探测
扩散性质,而在不同组成的微结构里,分子扩散行
为的差异就会体现出来。Douglas 和Vale[27]在研究
TCR的信号通路时发现某些蛋白扩散系数很小,很
可能局限在某些区域内,某些则很大,同时扩散系
数的大小并不像预计的那样与微区是否溶于表面活
性剂相关。
3.2 分子马达的工作机制
细胞内更复杂、更有序的结构的生化过程也是
单分子荧光检测的重要研究领域。某些复杂体系,
比如分子马达、膜表面受体很难用传统的手段深入
了解其化学机制。下面将简介分子马达的研究。所
谓生物体内的分子马达,包含了几类的蛋白质复合
体,都是将化学能高效率转化成机械能的分子器
件。这里分别介绍与核酸有关的马达、ATP酶以及
与细胞骨架有关的马达。
3.2.1 DNA马达在其解旋、复制、转录中的作用
核酸马达几乎在所有DNA、RNA参与的生物过程
中起很重要的作用,这类马达大都利用水解ATP或
其他三磷酸核苷酸(NTPs)的能量帮助 DNA、RNA
进行复制、转录、组装以及修复[28]。从晶体结构
和系综实验中很难得到核酸马达水解ATP,沿DNA
或 RNA运动,解开超螺旋等过程的动力学机制。
Seidel和Dekker[28]的综述介绍了近年来该领域单分
子检测的进展。
很多核酸马达可以沿DNA、RNA的轨道运动,
为DNA、RNA聚合酶复合物行使功能提供动力。对
这种运动细节的单分子研究目前一般使用光、磁镊
等方法拉伸DNA链再观察马达在其上的运动模式。
2006年,Herbert等[29]在单个碱基对的空间分辨率下
观察到RNA聚合酶的单步运动。而Plye小组以乙肝
病毒的NS3 RNA解旋酶为模型,观测单个DNA上
FRET信号在解旋时的逐步变化,发现了该马达沿
一条链前进并解开DNA双链,这种过程由包含每次
移动一个碱基的子步的“大步子”组成[30, 31]。
生物体内,马达 -马达、马达 -蛋白的相互作
用同样引人注目,Lee等[32]发现 DNA复制时,迟
滞链上合成RNA引物的原始酶(primases)可能阻止马
达继续向前的移动,保证迟滞链上 DNA的合成。
直接在更复杂的体内环境下进行研究,揭示马
达在ATP等的作用下,如何通过构象变化将化学能
转化成机械能将会更具挑战性。
3.2.2 ATP酶与离子通道的作用 质子泵是一类旋
转式分子马达,在高能化合物(如ATP)的偶联反应
下会产生类似定子,转子体系的转动,将质子泵入
或泵出,比较经典的转动马达有 F1-ATP酶。这种
酶含有中心的一个 γ亚基和周围 3对对称的α、β亚
基,三个β亚基上有ATP结合位点利用水解ATP的
能量带动 γ亚基旋转,在逆过程中,γ亚基的旋转
催化ADP生成ATP。Noj等[33,34]几十年来一直研究
F1-ATP酶的工作机制,他们利用Cy3标记的ATP确
认了 F1-ATP 酶的旋转机制:其旋转一周分为三
步,分别消耗一个ATP,120°的大步分为结合ATP
转动的 80°小步和ADP解离时的 40°的小步(图 2)。
3.2.3 骨架蛋白的运输机制 细胞骨架相关的分子
马达在生物体内起着运输物质、支撑结构以及肌肉
运动等多方面的作用。在许多种分子马达中,驱动
蛋白(kinesin)、肌球蛋白 5,6(myosinV,myosinVI)
的单个分子研究最引人注目。
这类蛋白在生物体内沿微丝或微管骨架运动,
带动绑定的分子、囊泡等物质运送到细胞各处。晶
体结构表明这类分子大多为二聚体,结构依次可分
为与骨架结合的头部、连接头部的颈部、螺旋缠绕
部分和货物绑定结构域等四部分组成。在系综水平
上研究这些蛋白在骨架上如何运动十分困难,而利
用单个荧光分子的成像和高斯拟合定位的方法,观
察到了myosinV[35]、myosinVI[36]、kenisin[37]的一步
一步(step-by-step)运动模式。这种运动消耗 ATP,
并且随ATP浓度增大速度加快,直到最大速度。确
定运动模式之后,科学家们进一步讨论了关于马达
运动是类似于步行的交臂式(hand over hand)行走还
是类似于尺蠖似的蠕动模式( i nchworm)的问题。
Selvin小组利用颈部荧光标记的myosinV进行单分子
轨迹追踪,得到了步长不同于 37nm的双峰分布,
证明了交臂式运动的模型[38]。利用相似的方法他们
发现myosinVI[39]、kenisin[40]同样按这一方式行走。
Shiroguchi 和Kinosita[41]最新的工作利用标记单个微
丝或微管的手段直接观察到myosin的每一步前进运
动的细节:先是后一条臂定向向前转动,然后随机
转动找到下一个 actin结合位点。另一问题是,多
个马达分子运送同一货物时的情况又会如何?Selvin
小组提出,多个 kinesin在同时工作时速度可以数倍
于单个马达,并很少后退[42],这可能支持多个分子
马达同时搬运一个货物时是协同而非竞争关系的假
设。
上述实验均在体外进行,有效地控制了不可预
知因素的影响,但是马达在活细胞内的工作是否也
是如此呢?Liang等[43]在研究荧光标记的α1A肾上腺
素受体在体内的运动时也观察到了 step-by-step的运
2 6 生命科学 第20卷
动,从运动步长和速度判断其马达为myosin,而
步长的分布支持 hand-over-hand的交臂式模型,停
留时间的分布分析得到的反应速度常数与体外实验
也比较符合(图 3),但并没有多个马达竞争的效应
存在,很可能是单个马达运输或是多个马达协同工
作。从而为myosin在细胞内的运动模式提供了证
据。
3.3 活细胞内生命活动的单分子检测
单个分子检测不但可以得到生化反应动力学机
制,还能有效地描述复杂的网络结构行为。传统的
系综实验处理过程时间长,难以鉴别非同时发生的
事件。利用单个分子荧光检测的手段可以同时独立
检测多个位置的多个分子,利用统计学的手段对整
个网络作比较全面的描述和分析。
3.3.1 α肾上腺素受体刺激后内化过程的研究 α
肾上腺素受体(α-adrenergic receptor)作为G蛋白偶联
受体( G P C R )家族的一员,对心脏活动、血压调
节、激素分泌、神经调控有重要的作用。传统的
观点认为:受体在接受外界刺激后会立即引起下游
信号传导,一段时间后还会发生受体的内化;刺激
消失后,受体重新回到表面,但这一解释仅基于静
态或半静态实验,其实际过程并未完全确认。
图2 F1-ATP酶ATP绑定与转动关系的单分子荧光检测[34]
注:A: 实验示意图:ATP酶 β 亚基连接在玻片上,γ亚基通过 biotin-streptavidin体系连接磁性小球,小球在电磁场作用
下定向旋转,溶液中有 Cy3标记的ATP,当 Cy3-ATP与ATP酶结合时可以被全内反荧光显微镜检测到,而磁珠的转动直
接用光学显微镜观察;B: 光学显微镜下转动的磁珠的相(靠上的行)和 Cy3-ATP荧光的相(靠下的行)随时间的变化;C: 不同
转速下,荧光出现时转过角度事件的统计图。
本实验室的梁璋仪与北京大学医学部的徐宁等利
用宽场激发的单分子荧光检测技术初步研究了α1A肾
上腺素受体内化,胞内运输,回复到膜表面这一循
环过程[9]。通过对膜表面受体的荧光标记排除胞浆内
受体的影响,以及刺激后受体进入细胞内的时间分
析发现刺激后很短时间内(10min内,早于系综结果)
受体就开始内化。在刺激后不同时间段内分析受体
的运动速度,发现内化初期受体移动较慢可能主要
沿微丝运输,30min后更多的受体转移到微管上运动
加快,通过打断微丝或微管的对照实验也得到了一
致的结果,并提出了受体持续内化,在胞内存在以
细胞骨架为基础的“受体储备池”的猜想。
利用单分子荧光检测对更多种肾上腺素受体内
化进行更全面的研究将很可能揭示出这类受体的作
用方式和功能机制,对基于肾上腺素受体的药物研
究很有帮助。
3.3.2 单个分子检测研究中心法则 基因的复制、
转录、翻译的过程(即中心法则)是生命现象最基本
的过程,但是 DNA如何生成 RNA,RNA如何翻
译,以及生物体如何定量调节蛋白的数量和分布都
是尚未解决的难题。
Xie的小组近年来在这方面开展了许多很有意义
2 7第1期 杨新星,等:生物过程化学机制的单分子荧光探测
的工作[8,44,45],他们直接观测到了单个蛋白分子在活
细胞内表达的情况。他们将荧光蛋白与膜锚定蛋白
的基因融合,在抑制表达的情况下观测细胞内表达
出的单个蛋白的发光随时间的变化情况[8] ;另一个
实验里,利用细胞中产生的β-半乳糖苷酶发生化学
反应产生荧光分子来分析这种酶的表达情况[44],统
计分析表明蛋白表达呈现随机的突跃,每一个这样
的突跃中包含了一系列基因表达的事件。最近,他
们用荧光蛋白标记了 Lac操纵子,观察其运动情
况[45],证实了转录抑制因子沿 DNA一维扩散,同
时伴随离开DNA的三维扩散这一猜想。
单个分子技术给与了足够的空间与时间分辨率,
同时追踪活细胞内的多个基因表达事件,从而为多
种蛋白表达的相互影响和调控的观察提供了可能。
3.3.3 细胞病毒相互作用的研究 病毒侵染细胞的
过程一直都是细胞生物学和医学上引人注目的问
题,但直到单个分子荧光检测技术出现,人类才有
幸真正观测到这一事实。2001年,Bräuchle等[46]利
用多色宽场激发与FCS联用第一次观测到病毒入侵
细胞的过程;Lakadamyali等[47]在 2003年利用对 pH
值敏感的染料标记流感病毒并对病毒从细胞膜至细
胞核的全过程进行了跟踪。
以上的例子仅仅是近年来单个分子荧光检测在
生命科学领域大量卓有成效应用的一部分,但是从
这些工作中我们已经可以看出单个分子检测在研究
生物过程的化学机制方面的独特优势。展望单分子
荧光检测技术的未来,它将在自身发展的同时与其
他先进技术结合,并且更好地应用数学和物理学的
理论,开拓研究的深度和广度,更加深入细致地揭
示生物过程的化学机制。
[参 考 文 献]
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图3 荧光标记的α1A肾上腺素受体在活细胞内的运动情况[43]
注:A: 宽场激发下,Cy3 标记的 α 1A肾上腺素受体运动的轨迹,插图中为直接观察到的荧光轨迹,大图为该分子在细胞
中的位置;B: 通过对亮点中心的高斯拟合定位,并进行MSD(均方根位移)计算的结果,插图中所示的一段轨迹分为三段
定向运动,中间一段的MSD曲线如右图,拟合得
素受体运动呈 step by step的示意图,图中所标距离即为各步的步长。C和 F分别为向微丝正端和负端移动的轨迹;D: 内
化后的 α1A肾上腺素受体荧光相示意图;E: 沿微丝运动速率分布统计, 和 分别是朝负端和正端的速度统计,朝两个方
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