全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 18 卷 第 2期
2006年 4月
Vol. 18, No. 2
Apr., 2006
RNA 干扰分子的制作
荀恒杰，于源华*，蔡林君
(长春理工大学生物工程系，长春 130022)
摘　要：小干扰 RN A 是一种能够在各种生物体和细胞(包括蠕虫、果蝇、植物、哺乳动物)中减弱基
因表达的有效工具。在哺乳动物中转染的 siRNA 能够抑制特殊基因的表达，这已经证明是探索基因功
能、基因敲除、抗病毒研究、基因治疗的有效方法。简单、有效、特异性地抑制基因的表达具有
巨大的科学、商业和医学治疗价值。如何设计和制作 siRNA 是影响 RNA 干扰效率的一个很重要的方
面。本文就 s iR NA 的设计和制作等方面作扼要的介绍。
关键词：T7 启动子；小干扰 R NA；小发夹 R NA；小干扰 R NA 表达框；U6 聚合酶 I II 启动子
中图分类号：Q756 　　文献标识码：A
Process of the RNA interfering molecules
XUN Heng-Jie, YU Yuan-Hua*, CAI Lin-Jun
(Department of Bioengineering, Changchun University of Science and Technology,
Changchun 130022, China)
Abstract: Small interfering RNA (siRNA) is an extremely effective tool for reducing gene expression of target
genes in a variety of organisms and cell types (e.g., worms, fruit flies, plants, and mammalian cells). The ability
of transfected siRNAs to suppress the expression of specific transcripts has proved a useful technique to
probe gene function, gene knockout, antiviral research, and gene therapy in mammalian cells. The ability to
simply, effectively and specifically down-regulate the expression of genes in mammalian cells holds enormous
scientific, commercial, and therapeutic potential. How to design and make good siRNAs is an important factor
of efficiency of RNA interference. This article introduces some ways to design and make siRNA.
Key words: T7 promotor; siRNA; shRNA; siRNA expression cassette; U6 Pol III promotor
收稿日期：2005-08-23；修回日期：2005-11-17
项目基金：吉林省科技厅项目(200505-5)
作者简介：荀恒杰(1970 －)，男，硕士研究生；于源华(1962 －)，女，博士，副教授，硕士生导师，* 通讯作者；
蔡林君(1979 —)，男，硕士研究生。
文章编号 ：1004-0374(2006)02-0190-05
RNA 干扰，也称为转录后基因沉默，是双链
RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子阻断或者降
低同源基因表达的现象。1998年华盛顿卡耐基研究
院的 Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的 Craig
Mello证实，1995年 Su Guo博士在线虫中发现的正
义 RNA 和反义 RNA 都能够特异性地阻断基因的表
达，其实是 dsRNA 阻断整个线虫的同源基因表达，
并且把这种现象称为 RNA 干扰(RNA interference，
RNAi)。从此，RNA 干扰成为热门领域，相关科
学论文及报道爆炸性增长。RNAi 沉默机制主要体
现在抗病毒、基因调控、染色质浓缩、转座子沉
默、基因组重组等领域，它主要用于高通量的基因
功能研究、基因敲除、基因治疗及药物筛选探索等
方面。而沉默机制和应用方面的研究都离不开如何
设计以及制作特异性的高效 RNA 干扰分子。
1　小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)的设
· 技术与应用 ·
191第2期 荀恒杰，等：R N A 干扰分子的制作
计
长dsRNA引入果蝇、线虫等大部分生物中能够
诱导 RNAi，但在哺乳动物细胞中却不行，因为长
片断的dsRNA在哺乳动物细胞中诱发强烈的抗病毒
反应，导致整体基因表达模式的改变和非特异的基
因沉默反应。最新实验表明，哺乳动物细胞中导入
小分子 dsRNA不会引发类似的抗病毒反应，而且能
够有效地切割特异的目标靶 RNA 导致基因沉默。
siRNA设计时应该遵循的原则：(1)靶区应在靶基因
cDNA的启始密码子(ATG)下游和终止密码子之间，
寻找含有AA (N19)TT或者NA (N21)，或者 NAR (N17)
YNN的基序(N为任意碱基 ，R为嘌呤，Y为嘧啶)，
而且 N19 不应该为重复的或者低复杂度的序列，也
不应该为核苷酸多态性位点。(2)序列中 G+C 的含量
应不超过 60%，也不低于 30%[1] 。(3)避免长度超过
4 个的连续碱基，例如 AAAA、CCCC，这样会影
响转录的效果，同时突出端碱基也不应该为 C，因
为相应转录产生的 G 很容易被 RNase 切除。(4)避免
在 3UTR 和 5UTR(untranslation region)进行 siRNAs
的设计，因为这些地方有丰富的蛋白结合区，会影
响 siRNAP 核酸酶复合物与 mRNA 的结合(图 1)。(5)
应在 mRNA靶的 3和5以及中部进行几种设计，从而
选择对 siRNA介导的降解更为敏感的mRNA序列[2]。
(6)设计阴性对照，作为阴性对照的 siRNA应与最适
siRNA上具有相同的碱基组成和长度，但是与目的
序列的mRNA和该生物的其他基因mRNA没有同源
性。在设计阴性对照的 siRNA 时，最适 siRNA 序
列被打乱，并且至少 4~5 个碱基不配对。(7)要检查
所选序列是否与其他基因具有同源性，将所选序列
和相应的基因组数据库进行比较，避免碱基配对的
数量在15对以上，以排除那些与其他编码序列或者
与 EST同源的序列，使用BLAST或者 FASTA搜索
工具就可以做到。当然在使用 siRNA 表达载体和
siRNA表达框架时，还有其他一些因素要考虑。现
在也出现了一些设计软件，例如 s i R N A D N A
designer、rational siRNA design template、siRNA tar-
get finder、siRNA design、siRNA construct builder
等等[3]。设计之后的小分子 RNA，应该能够在生物
体中被加工成含有 21~23 碱基的双链 siRNA 或者
45~50 nt 的小发夹 RNA(short hairpin RNA, shRNA)。
2　制备 siRNA的方法
2.1　化学合成　尽管化学合成是最贵的方法(平均每
个碱基 200 元左右)，但却是最方便的，Ambion 和
Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学
合成 siRNA。Qiagen公司利用专利的TOM-amidited
技术，使得每一步碱基耦联效率高达 99.5% 以上，
经过去保护和脱盐，纯度为 80%~85%，如果选择
阳离子交换 HPLC 纯化，纯度超过 97%。该公司提
供的 siRNA 是已经退火的，在灭菌重悬缓冲液中，
即可进行 RNA转染，非常方便。 Ambion公司可以
帮助合成两条互补的，末端补加 TT 或者 UU，或
者其他需要的 3 突出端的 RNA 单链，同时还免费
提供去保护和反向脱盐纯化、PAG E 胶纯化等服
务。一对冻干的 RNA 连同退火 Buffer、无 RNase
水一起提供，方便实验的进行。由于化学合成价格
比其他方法高，特别是在哺乳动物中 siRNA的效率
不一，为一个基因合成 3~4 对 siRNA，成本就更高
了，所以不适宜用于筛选 siRNA。比较常见的做
法：先用其他方法筛选出最有效的序列，再进行化
学合成。
2.2　体外转录　通过体外转录的方法可以合成
siRNA，是性价比较高、能够较快地得到筛选siRNA
的好方法，目前已有 Ambion公司的 Silencer siRNA
Construction Kit 和 NEB 的 HiScribe RNAi Transcrip-
tion Kit 等。一般过程为：首先合成两段 29-mer 的
DNA 作为模板(如 Operon，一个碱基 7~8 元)，它
包括 8 个与 T7 启动子引物 3 端匹配的碱基(引导序
列，leader sequence)和 21个设计的 siRNA序列，将
这两个模板和对应的 T7 启动子引物分别混合，引
物末端和 D N A 模板退火结合，用 D N A 聚合酶
Klenow大片断补平成为双链DNA模板，分别用T7
R N A 聚合酶进行体外转录，将产物混合形成
dsRNA，新的dsRNA包含 5端单链的引导序列和中
间互补的 1 9 个碱基序列以及 3 端两个重复的 U
(UU)，通过 DNA 酶降解模板，同时用单链专一的
核酸酶消化 5 的引导序列，由于 RNase 不能切开 U
碱基也不能切 dsRNA，所以得到的产物就是我们需
要的 21-mer 的双链 siRNA，通过柱纯化，去除引
物、碱基、盐和蛋白质等杂质，得到的就是可以
立即转化用的 siRNA。整个过程不超过 2 天，却可
以得到 15种产量很高的 siRNA，足够做上百次转染
图1　siRNA分子的设计
192 生命科学 第18卷
实验(图2)。体外转录的siRNA的转染效率要比化学
法合成的同序列的 siRNA至少高20倍，估计原因是
由于化学合成每一步的合成和纯化效率都不能达到
100%，20 步反应后经过 HPLC 纯化后纯度才 97%。
MEGAscriptTM RNAi Kit试剂盒可合成长dsRNA，主
要适用于果蝇、线虫等非哺乳动物。它是用两端带
有 T7 启动子序列的目的基因质粒载体或带有 T7 序
列的引物扩增的 PCR 产物作为模板(如果 200 nt 以
上，也可以选用一个叫 Lign Scribe Kit，可以将 T7
Promoter 序列直接连接到 DNA 片断的两端)，将模
板和试剂盒提供的 dNTP、酶等混合，根据模板的
长短进行体外转录反应，每次反应可以合成50~100
µg，甚至更多的 dsRNA(800 nt 以上的需要先加热
变性并退火形成双链)，产量是常规的 10~50倍，整
个试剂盒总产量可达 2 mg(20 次反应，每次 100
µg)。合成的产物经过DNase I 消化去除DNA模板，
特殊的单链RNase除去单链的RNA，柱纯化就得到
纯的 dsRNA，即可用于 RNAi 实验。体外转录法适
用于筛选和制备多种 siRNAs。
2.3 　长片断dsRNA 经RNase III 类降解　这种方法
不需要设计多个 siRNA序列，以便找到一个最适的
siRNA，而是制备一份混合有各种 siRNAs 的“混
合鸡尾酒”(即 siRNAs 混合库)。RNase III 可以参
与各种来源的 dsRNA的降解，一个酶单位在37℃ 1
h的条件下可将 1mg dsRNA 降解到 30 bp 以下，主
要为 12~15 bp siRNA 混合物 ，突出端带有 2~3 个
碱基，主链的 5 为磷酸，3 为羟基，产物突出端
相似于体内 Dicer 降解产物，通过改变酶切条件可
以提高降解产物长度达 21 bp，不过有实验结果显
示 12~15 bp 的 siRNAs 具有同样的抑制效果。它的
过程是：选择通常是 200~1 000 碱基的 DNA 为模
板，用体外转录的方法制备长片断 dsRNA，然后
用 RNase III 在体外消化，得到众多的、针对同一
靶基因多位点的 siRNA 混合库[4]。在除掉没有被消
化的dsRNA后，这个 siRNA混合物就可以直接转染
细胞，方法和单一的 siRNA转染一样。由于 siRNA
混合物中有多种不同的 siRNA，能够保证目的基因
被有效地抑制，但是需要的浓度较高。dsRNA 消
化法的主要优点在于省略检测和筛选有效 siRNA序
列的步骤，为研究人员节省时间和费用(因为RNase
III 比 Dicer 要便宜)，它简单粗放、快速、性价比
高[5]; 缺点就是有可能引发细胞毒素的增加和同源或
者密切相关的基因的非特异基因沉默，但现在多数
研究显示这种情况通常不会造成影响。Ambion公司
曾用Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III)试剂盒成
功关闭 c-fos、GAPDH、La 等几个基因。这种方
法不适用于长时间的或者对一个特定的 siRNA的研
究，例如基因治疗 [ 6 ]。
2.4　siRNA表达载体　有多个报道说，通过载体表
达的 siRNA 同样可以抑制特定基因的表达，载体
大都是用 RNA 聚合酶 III(Pol III)启动子启动编码
shRNA的序列。它需要将编码一小段对应目的基因
特异序列的、RNA 能形成发夹结构的 DNA 序列插
入载体中启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体
就能表达出发夹结构的 RNA，这种 RNA 很快在细
胞中被加工成为 siRNA。以 pSilencer siRNA 表达载
体系列为例，它是由一种 Pol III 启动子、氨苄抗
性基因和大肠杆菌复制子组成。载体 pSilenceT 1.0-
U6 是采用小鼠 U6 Pol III 启动子，经过了 Apa I 和
EcoR I 酶切线性化和纯化，只需要合成一对带有 4
个碱基的突出端(为对应 Apa I 和 EcoR I 酶切位点)
和位于中部由 8个碱基组成的茎环区的 55-mer的寡
核苷酸，一起退火、快速连接就可以转化了[7](图
3)。pSilencer2.0-U6、2.1-U6、3.1-H1 或者 3.0-H1
则是用 H1 RNA 启动子(RNase P 的一个组成部分)，
用 BamH I 和 Hind III 线性化和纯化的，方便定向
克隆。而 pSilencer adeno 1.0-CMV 和 pSilencer 4.1-
CMV(巨细胞病毒启动子) 载体是以 SV40 polyA ter-
minator 为终止信号，分别具有 Xho I 、Spe I 和
BamH I 、Hind III 限制位点[8](图 4)。另外还有
图2　用Silencer siRNA Construction Kit进行体外转录
图3　 pSilencer 1.0-U6 载体的插入部分设计
注：为定向克隆入载体，含有合适的几个 3 突出端，环状
部分的序列和长度可以按照需要有所变化
193第2期 荀恒杰，等：R N A 干扰分子的制作
Stratagene 的长效抑制基因表达新产品——Gene-
Eraser shRNA表达载体可用，两个互补的寡核苷酸
需带有 5BamH I 和 3Xba I 接头，互补的寡核苷酸
长度为 29 个碱基，在 BamH I 位点下游紧连一个 C
使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的
发生(图 5)。
shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保
RNA 聚合酶转录，如果选择的目的序列不以 G 开
头，必须在紧连正义链的上游加一个G。shRNA插
入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大
小核苷酸序列的茎环都被成功的运用过，其中包含
一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有
shRNA 插入片段的克隆，如图 5所示的茎环序列就
包含一个 Hind III 酶切位点。5TTCG3 通常作为茎
环序列。而在比较了众多不同长度和序列的茎环，
5TCAAGAG3序列最为有效。之所以采用RNA Pol
III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多
的小分子RNA，并且总是在离启动子一个固定距离
的位置开始转录合成 RNA 而且通过添加一串(3~6
个)U 来终止转录的。当这种带有 Pol III 启动子和
shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种
能表达 siRNA的质粒确实能够抑制包括相关的外源
基因和内源基因在内的表达[9]。siRNA 表达载体的
优点在于：带有抗生素标记的载体可以在细胞中持
续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，而且
可以复制扩增，与化学合成相比，这就能够显著降
低制备 siRNA 的成本。腺病毒、逆转录病毒及慢
病毒等病毒载体也可用于 siRNA表达，其优势在于
可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避
免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转
染效果更加稳定。它适用于已知一个有效的 siRNA
序列，需要维持较长时间的基因沉默，不适用于筛
选 siRNA 序列[10]。
2.5　siRNA 表达框架　siRNA 表达框架(siRNA ex-
pression cassette, SEC)是一种由 PCR 得到的产物，
包括一个 RNA Pol III 启动子，一段发夹结构(以 5-
UUUGUGUAG-3为环部)的shRNA模板，一个RNA
Pol III 终止序列，能够直接导入细胞进行表达而无
需事前克隆到载体中。Silencer express kits 能够以
含有 EcoR I 和 Hind III 限制性酶切位点的引物，通
过重叠延伸的PCR方法，非常简单方便地制得带有
人源 H1 或者 U6(人源或鼠源)启动子的 SEC(图 6)。
与 siRNA 表达载体不同的是，SEC 不需要载体克
隆、测序、抗生素筛选等颇为费时的步骤，而且
转染效率高，可以直接由 PCR 在一天中得到。因
此SEC成为筛选 siRNA的最有效工具，甚至可以用
来筛选特定的细胞株中启动子和 siRNA 的最适搭
配，例如 Silencer express kit 对于不同的 siRNA 模
板，采用三种不同的启动子与之搭配[11]。如果在
PCR两端添加酶切位点，那么通过SEC筛选出的最
有效的 siRNA可以直接克隆到载体中构建 siRNA表
达载体，这样构建好的载体可以用于稳定表达
siRNA 和长效抑制的研究。由于没有进行序列测
定，PCR 和 DNA 合成时可能产生的误读不能被发
现导致结果不理想，所以必须用高保真的 Taq 酶，
另外 siRNA中也不应该连续出现三个以上的T或者
A，否则容易被 Pol III 当作终止信号，提前停止转
录。siRNA表达框架可以用于筛选 siRNA序列以及
筛选在不同细胞株中最佳启动子，但不能够直接用
于长期抑制研究，如果用于长期研究，必须克隆到
载体中，以保存和扩增 siRNA[12]。
尽管真正在临床上运用RNA干扰机制对疾病进
行治疗还有诸如靶向性、用药量等需要解决的问
题，但是随着研究的深入，相信相关问题将逐步得
到克服。我们可以根据实验条件、对象、目的等，
选择合适的RNA干扰分子制作方法，通过特异性地
高效表达RNA干扰分子，为我们的实验和应用打下
良好的基础。
[参　考　文　献]
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图4　pSilencerTM adeno 1.0-CMV 载体的插入部分设计
注：为定向克隆入载体，含有合适的几个突出端，环状部
分的序列和长度可以按照需要有所变化
图5　GeneEraser shRNA表达载体插入部分设计
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