全 文 ：第24卷 第6期
2012年6月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 24, No. 6
Jun., 2012
文章编号：1004-0374(2012)06-0518-03
编者按：DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传调控方式，在基因印迹、X染色体失活、转座子与外源DNA的沉默及组织特异
性基因的表达调控中发挥着重要的作用。在哺乳动物的配子发生过程及从受精到着床的早期胚胎发育阶段，基因组DNA发生
大规模的主动去甲基化。但去甲基化的分子机制一直是表观遗传领域的谜题。2009年，Anjana Rao及其同事发现一种DNA双
氧化酶TET蛋白能够将5-甲基胞嘧啶氧化成5-羟甲基胞嘧啶，这为DNA去甲基化的机制研究开拓了新的思路。在此基础上，徐
国良实验室展开了深入研究，发现TET蛋白能够进一步将5-羟甲基胞嘧啶氧化成5-羧基胞嘧啶，并发现糖苷酶TDG能够特异性
地识别并切除DNA中的5-羧基胞嘧啶，进而启动碱基切除修复途径完成DNA去甲基化，从而提出了氧化作用与碱基切除修复途
径协同介导的DNA主动去甲基化机制。
DNA主动去甲基化的Science之路
李滨忠
(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031)
收稿日期：2012-01-09
*通信作者：E-mail: bzli@sibs.ac.cn
5- 甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine, 5mC) 被认为
是哺乳动物基因组中除腺嘌呤 (adenine)、胸腺嘧啶
(thymine)、胞嘧啶 (cytosine) 及鸟嘌呤 (guanine) 之
外的第五种碱基。它与染色质的另外一种重要组分
组蛋白及其翻译后修饰的组合决定了特定基因组区
域染色质的结构及基因转录活性，从而形成了一层
叠加于碱基序列上的表观遗传信息。胞嘧啶甲基化，
也称为 DNA 甲基化，参与了诸多生物学过程，包
括基因印迹、X 染色体的失活、基因组稳定性的维
持、转座子及逆转录转座子的沉默及组织特异性基
因的沉默等 [1-2]。
在哺乳动物的个体发育中，DNA 甲基化谱式
主要经历了两次大规模的重编程过程，一次发生在
从受精至着床的早期胚胎发育时期，另一次发生在
配子发生过程中 [3-4]。这两次重编程都涉及了基因
组范围的主动去甲基化反应 (global demethylation)。
相对于基因组范围内的大规模主动去甲基化，在体
细胞中会发生局部的、高度位点特异性的主动去甲
基化 [5-6]。DNA 的去甲基化与 DNA 甲基化这两个
过程相互平衡，维持了 DNA 甲基化谱式的稳定。
任何一方的失调都会导致 DNA 甲基化谱式的紊乱，
进而引起多种神经退行性疾病、免疫系统疾病以及
癌症 [7-8]。特别是两次基因组范围的主动去甲基化
事件对于生命的起始以及生命的传承具有非常重要
的意义。
DNA 甲基化是由 DNA 甲基转移酶 (DNA methyl-
transferase) 催化完成，那 DNA 去甲基化是如何完
成的呢？也存在类似于 DNA 甲基转移酶的 DNA
去甲基化酶 (DNA demethylase)，抑或是其他的机制
呢？就此，著名的华人生物学家、美国科学院院士
朱健康教授在一篇综述中提出以下几种 DNA 去甲
基化的可能方式 ( 图 1) [5]。(1)存在特异性识别并切
除 5mC 的糖苷酶 (glycosylase)，切除 5mC 产生 AP
位点 (apurinic/apyrimidinic site)，进而启动碱基切
除修复途径 (base excision repair, BER)，用没有修
饰的胞嘧啶取代原有的甲基胞嘧啶，最终完成
DNA 的去甲基化。(2)存在特异性识别 5mC 的脱氨
酶 (deaminase)，通过脱氨作用将 5mC 转变成胸
腺嘧啶，形成 G/T 错配。进而由识别 G/T 错配的
糖苷酶，如 TDG、MBD4 等，启动 BER 途径，完
成 DNA 的去甲基化。(3) 通过核苷酸切除修复途径
(nucleotide excision repair, NER)切除含有 5mC的一
段 DNA，并用含有未修饰胞嘧啶的同样序列进行
替换，进而完成 DNA 的去甲基化。(4) 通过氧化作
用将甲基基团氧化成羧基基团，再通过脱羧作用完
成 DNA 去甲基化。(5) 通过水解作用直接将甲基基
团去掉。朱健康教授实验室发现在拟南芥中存在着
一种由 DNA 糖苷酶 (DME、DML2、DML3 和 ROS1
等)介导的主动去甲基化机制。ROS1等可以切除 5-
甲基胞嘧啶，启动碱基切除 - 修复途径 (base excision
repair, BER) 完成 DNA 去甲基化 [5]。但在哺乳动物
· 发现的历程 ·
李滨忠：DNA主动去甲基化的Science之路第6期 519
中并没有鉴定到这些糖苷酶的同源蛋白，提示哺乳
动物中可能存在不同的 DNA 去甲基化机制。
长期以来，DNA 主动去甲基化的机制一直是
表观遗传领域的一个最基本的问题。但由于 DNA
主动去甲基化事件只限于卵子受精后分裂前和生殖
细胞生成过程，时间窗口很短，细胞来源有限，无
法获得足够数量的细胞或组织进行分子生物学操作
来鉴定基因，更无法进行生化操作去纯化酶，因此
研究起来极其困难。但这个难题从来没有缺少过关
注，很多实验室试图用其他方法来解决这个问题，
也包括本实验室。1999 年，加拿大 McGill 大学的
犹太裔生物学家 Moshe Szyf 教授在 Nature 上发表
文章，声称他们实验室鉴定到了 DNA 去甲基化酶，
这个酶含有甲基化 CpG 结合结构域，能够在体外
将 5mC 转变成 C[9]。这在表观遗传领域引起了一时
的轰动，但其他实验室重复不出来这个结果。直到
2007 年，德国海德堡的 Christof Niehrs 实验室利用
大规模筛选的方法鉴定能够重新激活被 DNA 甲基
化沉默的荧光素酶 (luciferase) 报告基因的蛋白。他
们发现 DNA 损伤诱导蛋白 Gadd45a(growth arrested
and DNA-damage-inducible protein 45 alpha) 能够促
进修复途径介导的 DNA 去甲基化 [10]。但 Gadd45a
基因敲除并不妨碍胚胎发育，也不影响受精卵分裂
前雄原核的主动去甲基化过程。另外，Gadd45a 只
是启动一种 DNA 修复机制，并不是真正的去甲基
化酶。2008 年，美国犹他大学的 David Jones 实验
室与 Bradley Cairms 实验室合作，将甲基化的 DNA
注射入斑马鱼的胚胎中来研究 DNA 去甲基化。他
们提出脱氨酶 AID (activation induced deaminase)、
糖苷酶 MBD4 及 Gadd45a 蛋白相互协作，通过脱
氨偶联的碱基切除修复途径完成 DNA 去甲基化 [11]。
2010 年，英国剑桥大学的 Wolf Reik 教授实验室报
道 AID 蛋白的缺失影响了原始生殖细胞中的去甲基
化事件 [12]。这为 AID 蛋白通过脱氨作用参与 DNA
去甲基化提供了进一步的证据。但还是不能完全解
释基因组范围的主动去甲基化事件。在 2009 年，
DNA 去甲基化研究出现了一个全新的突破。美国
科学院院士 Anjana Rao 实验室发现 DNA 双加氧
酶 Tet1 蛋白在体外可以将 5- 甲基胞嘧啶氧化成 5-
羟甲基胞嘧啶 (5-hydromethylcytosine, 5hmC)[13]，且
5hmC 稳定存在于胚胎干细胞及浦肯野细胞中 [14]，
这提示 5mC 可能通过氧化途径经由 5hmC 最终转
化成非甲基化的胞嘧啶 [6]。
在粗糙脉胞菌 (Neurospora crassa) 中存在一种
尿嘧啶代谢补偿途径。胸腺嘧啶在胸腺嘧啶水解酶
(thymine-7-hydrolyase，T7H) 的催化下经三步氧化
反应被转变成 5- 羧基尿嘧啶，随后 5- 羧基胞嘧啶
在异乳清酸脱羧酶(iso-orotate decarboxylase, IDCase)
的作用下转变成尿嘧啶 [6,15]。那 Tet 蛋白是否具有
类似于 T7H 的功能，通过多步氧化反应将 5mC
转变成 5- 羧基胞嘧啶 (5-carboxylcytosine, 5caC)
呢？本实验室正是在这个假说的推动下开始了哺
乳动物 DNA 主动去甲基化机制的研究。首先，优
化了Tet蛋白的体外反应条件，除了加入辅因子 2-OG
(2-oxoglutarate) 及二价铁离子，还加入了 1 mmol/L
ATP。高效液相色谱(high performance liquid chroma-
tography, HPLC)及薄层层析 (thin layer chromatography,
TLC) 的结果显示 5mC 被转变成一种新的形式。经
质谱鉴定，这种新的修饰形式为 5caC。在 293T 细
胞中过表达 Flag-Tet2 蛋白可在基因组 DNA 中检测
到 5caC，而 Tet2 突变体蛋白则不能产生 5caC。这
些结果表明 Tet 蛋白确实可以通过氧化作用将 5mC
转变成 5caC。接下去的问题是 5caC 如何转变成
非甲基化的胞嘧啶的呢？是存在类似于 IDCase 的
图1 DNA主动去甲基化的可能机理[5]
生命科学 第24卷520
5caC 脱羧酶，还是其他途径，比如碱基切除修复途
径呢？ 2010 年，英国剑桥大学的 Azim Surani 实验
室的研究工作显示碱基切除修复途径参与了小鼠生
殖系的重编程 [16]。糖苷酶是 BER 途径最上游的蛋
白分子。本实验室纯化了目前已知的四种针对 G/U
错配的糖苷酶，即 TDG、MBD4、UNG1 及 SMUG1，
并检测这些糖苷酶是否可以特异性地切除 5caC，结
果显示这四种糖苷酶中只有 TDG 可以特异性地切
除 5caC。用 anti-TDG 抗体免疫去除 ES 核抽提物
中内源的 TDG 蛋白导致核抽提物中 5caC 切除活性
的大大降低。而共转染 TDG 和 Tet2 则可以消除基
因组中 Tet 催化产生的 5caC，丧失酶活的 TDG 突
变体蛋白则没有这种作用。Tdg knockdown 的 ES
细胞或者 Tdg knockout 的 iPS 细胞的核抽提物中
5caC 切除活性基本消失，同时在这两种细胞中均可
以用 HPLC-MS-QQQ 的方法检测到 5caC 的积累。
上述结果证明 5mC 可在双加氧酶 Tet 的催化下转变
成 5caC，而 5caC 则进一步通过 TDG 介导的 BER
途径转变成未甲基化的胞嘧啶 [17]。在本实验室开展
Tet 蛋白通过氧化作用将 5hmC 转变成 5caC 工作的
同时，美国北卡罗来纳大学、霍华德休斯医学研究
所的著名华人科学家张毅教授实验室也发现了同样
的生化机制。他们发现 Tet 蛋白可以在体外将
5hmC 顺序氧化成 5- 醛基胞嘧啶 (5-formylcytosine,
5fC) 和 5caC，并用质谱方法在 ES 细胞及多种小鼠
组织中检测到 5fC 和 5caC 的存在 [18]。但他们没有
继续深入研究 5caC 如何转变成未修饰的胞嘧啶。
所以，本实验室首次相对完整地提出了哺乳动物
DNA 主动去甲基化的一种全新分子机制 ( 图 2)。
致谢：感谢徐国良老师对工作的指导和支持！
[参 考 文 献]
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图2 氧化作用偶联碱基切除修复途径介导的DNA主动
去甲基化模型