全 文 ：第24卷 第1期
2012年1月
Vol. 24, No. 1
Jan., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)01-0095-05
外显子组测序技术在人类疾病研究中的应用
林正伟，赵晓航*
(中国医学科学院/北京协和医学院肿瘤研究所，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021)
摘　要：外显子组测序是针对基因组中的蛋白质编码区，靶向富集外显子区域测序，以发现疾病相关遗传
变异的技术。该技术近年越来越多地应用于发现人类基因组低频变异、鉴定单基因遗传病致病基因和肿瘤
等复杂疾病易感基因研究，成为人类疾病相关变异研究的重要工具。综述了外显子组测序技术的基本原理
及其在人类疾病相关基因研究中的应用。
关键词：外显子组测序技术；遗传疾病；易感基因
中图分类号：R394; R446.9 文献标志码：A
Application of exome sequencing in research of human diseases
LIN Zheng-Wei , ZHAO Xiao-Hang*
(State Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Chinese Academy of Medical
Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)
Abstract: Whole exome sequencing (WES), which focuses on the protein coding region of the whole genome, aims
to identify diseases related coding variants through sequencing the enriched exons of the genome. In recent years,
WES is increasingly applied in several research fields, such as to identify novel low frequency variants, find causal
genes of single gene inheritance diseases, in research of complex diseases like cancer. It has become one of the most
important strategies in identifying diseases associated genes. Here we reviewed the basic technical principal of WES
and its application in research of human diseases related genes.
Key words: exome sequencing; genetic disease; predisposing genes
收稿日期：2011-07-29； 修回日期：2011-09-11
基金项目：国家自然科学基金项目 ( 9 1 0 2 9 7 2 5，
81021061)；国家重点基础研究发展计划(“973”
项目)(2011CB910703)；国际科技合作与交流专项
(2008DFA31130)
*通信作者：E-mail: zhaoxh@cicams.ac.cn; Tel: 010-
67709015
目前，运用高通量二代测序技术已完成多种动
植物和微生物的全基因组序列测定。但由于全基因
组测序技术成本较高 [1]，近年主要应用外显子组测
序 (whole exome sequencing, WES)技术开展单基因
遗传病致病基因和复杂疾病易感基因的鉴定研究。
1　外显子组测序
外显子 (exon)是真核生物基因的一部分，可翻
译成相应的氨基酸，人类基因组大约含 180 000个
外显子 (约 30 Mb)，占人类基因组 1%，全部外显
子称为外显子组 (exome)[2-3]。外显子组测序一般先
应用靶向富集技术捕获基因组的外显子区域，再通
过高通量测序获得编码区序列，进而发现疾病遗传
特征 [3]。人类大约 85%的致病突变位于基因组的蛋
白编码区 [4]。
1.1　靶向富集
针对基因组中整个蛋白质编码区域的靶向富集
称为外显子组捕获 [5]。常用靶向富集方法有聚合酶
链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)、分子倒
位探针 (molecular inversion probes, MIP)、芯片杂交
∙ 技术与应用 ∙
生命科学 第24卷96
捕获 (on-array hybrid capture)和液相捕获 (in-solution
hybrid capture)等 [6-7](表 1)。
1.2　高通量测序
将靶区域富集后再进行高通量测序，目前的
高通量测序平台原理主要包括焦磷酸测序、可逆
荧光终止和双碱基编码几种，分为边合成边测序
(sequencing by synthesis, SBS)和边连接边测序 (sequenc-
ing by ligation, SBL)模式 [9]。不同平台的读长、单
位时间读取数据量、技术原理和仪器成本等方面具
有不同特点 (表 2)。
2　外显子组测序与疾病相关基因研究
继人类基因组计划后，研究者开始运用高通量
技术开展遗传变异与人类疾病的关联研究，目前主
表1 常用靶向富集方法比较[8]
聚合酶链式反应 分子倒位探针 芯片杂交捕获 液相捕获
成本 高 高 (<10个样本) 中 中 (<10 个样本)
低 (>100个样本) 低 (>10 个样本)
DNA用量 (μg) ~8/Mb 0.2 10~15/30 Mb 3/30 Mb
敏感度 (%) >99.5 >98 >98.6 >99.5
特异度 (%) >70 >98 >70 >80
覆盖度 (%)/重数(×) 80/2 88/100 60/0.5~1.5 61/ 0.5~1.5
表2 二代测序平台比较
Roche/454 GS FLX Illumina/Solexa Genome Analyzer Ⅱ Applied Biosystem/SOLiD 4
仪器成本 低 中 高
读长 (bp) 450 35~300 35~100
通量 (Gb)/天 1 6.5 (2×100 bp) 6
准确度(%) >99 >90 (2×50 bp) >99
技术原理 焦磷酸测序 可逆荧光终止法 双碱基编码
测序模式 SBS SBS SBL
PCR模式 油包水 桥式 油包水
图1 基于外显子组测序的易感基因筛选策略
要涉及全基因组关联分析 (genome-wide association
study, GWAS)、外显子组测序和全基因组测序等
研究策略。基于全基因组单核苷酸多态性 (single
nucleotide polymorphism, SNP)芯片的 GWAS技术
流程和数据分析相对成熟， 但芯片上的杂交探针是
基于已知 SNP位点设计，不能发现新的多态性位
点 [6]。理论上，全基因组测序可以鉴定人类基因组
序列的所有变异 [10]，但因目前成本较高，暂未得到
广泛应用。外显子组测序在一定程度上解决了杂交
分型芯片和传统测序技术的局限性，相对成本低，
可以详细分析编码区域的遗传变异，成为目前疾病
相关基因研究的重要工具 [11-12]。
目前发现与人类疾病相关的基因突变位点已超
过10万个，但仍为人类基因组遗传变异的一小部分，
尚有很多重要变异有待鉴定。外显子组测序是高效
鉴定编码区变异的方法之一，其技术流程主要涉及
病例和对照样本准备、靶向富集外显子组、高通量
测序、数据分析并获得变异基因列表、与 dbSNP
数据库比较排除常见变异等 [13-14](图 1)。2008年以
来，PubMed数据库收录的外显子组测序研究工作
呈逐年递增趋势 (图 2)。
2.1　人类基因组中低频变异
通常把人类基因组中最小等位基因频率 (minor
allele frequency, MAF)低于 5%的 SNP称为低频变
异。位于蛋白质编码区的 SNP称为编码单核苷酸
多态 (coding SNP, cSNP)，包含仅涉及基因编码序
列改变而不引起氨基酸序列改变的同义编码单核苷
酸多态 (synonymous cSNP)和同时涉及基因编码序
列与氨基酸序列改变的非同义编码单核苷酸多态
(non-synonymous SNP, nsSNP)。GWAS基于“常见
疾病，常见变异”的原则，主要研究MAF>5%的
林正伟，等：外显子组测序技术在人类疾病研究中的应用第1期 97
SNPs与疾病的关联性，不涵盖人类基因组中重要
的低频变异，会引起部分遗传度缺失。外显子组测
序可以发现基因编码区的低频变异及对疾病具有不
同效应的稀有变异，在人类疾病相关基因研究中具
有重要作用。
对单个个体的外显子组序列分析发现，10 400
个 nsSNPs位点中 15%~20%属于低频 SNP (MAF <
5%)，在所鉴定的 700个插入 /缺失突变中，50%
影响到编码蛋白质的氨基酸序列 [15]。除 SNP外，
基因组中还存在频率较低的涉及两个或两个以上核
苷酸的变异，即多核苷酸多态性。通过联合分析外
显子组和全基因组测序数据，发现数个与恶性胶质
瘤显著相关的多核苷酸多态性 [16]。针对 200个丹
麦人个体的外显子组分析发现，低频变异对疾病的
发生发展具有重要作用。在所鉴定的 121 870个
SNPs中，包括 53 081个 cSNPs。通过对 SNP响应
值和基于人群的等位基因频率分析发现，MAF在
2%~5%范围内的 cSNP有害突变和非同义突变是同
义突变的 1.8倍，多数低频变异多态性会引起编码
蛋白改变，有可能引发疾病 [17]。外显子组测序对等
位基因频率相关研究具有重要意义，尤其是那些芯
片平台中不涵盖的稀有和低频变异。
2.2　孟德尔单基因遗传病致病基因
多数孟德尔单基因遗传病是由基因组中蛋白编
码区的碱基突变导致蛋白功能和表型改变所致。对
这些疾病致病基因的研究会受到样本数、外显率和
位点异质性等因素影响 [3]，通过连锁分析通常很难
找到致病基因。理论上，外显子组测序可发现同一
基因座上外显子区域的所有突变，因而能快速直接
地鉴定致病基因。
对 4位相互独立的 Freeman-Sheldon综合征个
体的外显子组测序数据及 8位 HapMap正常个体
的数据进行分析，同时结合变异数据库进行过滤，
发现在所有病例样本中都可鉴定到已知致病基因
的变异，该项研究是高通量测序研究单基因病的
早期尝试，证明了外显子组测序技术能有效发现
单基因病致病基因 [2]。另外一项在 3个独立家系中
寻找Miller综合征遗传变异的研究发现，DHODH
基因变异在 3个家系中均存在，可能为新致病基因，
提示对少量样本进行外显子组测序分析是鉴定单基
因病致病基因的有力手段 [3]。对 10名独立的
Kabuki综合征先证者进行外显子组测序，通过已有
的 SNP数据库进行最严格条件过滤后，并没有在
患病个体中发现包含未知突变的候选基因。次严格
条件过滤会出现中度遗传异质性，但同时也鉴定到
了多个候选基因。通过基因型和表型的分层分析发
现，编码组蛋白甲基转移酶的 MLL2基因在 7位先
证者中存在突变。通过 Sanger测序法进一步在另外
43个病例的 26个个体中检测到该基因突变，通过
变异个体父母 DNA分析，确认该基因突变是新发
现的遗传变异，遗传传递与表型一致。因此，对于
遗传异质性强的疾病表型，采用散发病例进行研
究时，需要适当处理可能由异质性带来的假阳性
问题 [18]。皮质发育畸形致病基因定位受多因素影响，
如位点异质性明显、亲缘关系弱和诊断分类边界不
清楚等。针对此遗传特点，首先对两名患病个体进
行全基因组基因分型鉴定出两个体的同源区段，再
通过基于捕获芯片的外显子组测序，发现 WDR62
隐性突变是一系列重型大脑皮层畸形的致病原因，
包括小脑畸形、巨脑回伴皮质肥厚和胼胝体发育不
全等。这一结果提示在定位策略受到位点异质性、
诊断边界不清等问题阻碍时，外显子组测序技术对
于基因鉴定意义显著 [19]。
中国科学家近年在该领域也取得了一定的成
果。研究者通过外显子组测序和连锁分析相结合的
策略对一个 4代家系中的 4名常染色体显性小脑共
济失调患者进行了分析。鉴定到 TGM6基因第 10
外显子的 1个错义突变 (L517W)，连锁分析所定位
区域与该结果吻合，而且在另外一个家系中鉴定到
TGM6基因第 7外显子的另一个错义突变 (D327G)，
但是在 500例健康对照个体中均未检测到这两个
错义突变，进一步验证了该基因的致病性。该研究
提示与连锁分析相结合可以有效减少研究所需样
本量 [20]。逆向性痤疮 (化脓性汗腺炎 )是一种常染
色体显性遗传病，通过 1个典型家系的全基因组连
注：数据更新截至2011年9月10日。
图2 PubMed数据库收录外显子组测序文章发表趋势
生命科学 第24卷98
锁分析发现，其致病区域位于 1p21.1~1q25.3区段 [21]。
对同一家系中的 2个病例和 1个正常个体的外显子
组测序，发现 2个病例共有 85个基因突变，而
1p21.1~1q25.3区域包含了其中 8个突变基因 [22-23]。
可见，外显子组测序技术往往能够更加具体地重复
连锁分析的结果，同时鉴定到之前未知的相关区域
变异。
研究提示，利用外显子组测序技术在小样本中
可以鉴定已知和新的致病基因，尤其对于罕见孟德
尔疾病的研究，可以对一个家系中的患病个体做外
显子测序，是一种相对高效低成本的策略。并且通
过与连锁分析等策略相结合的方式在提高结果可信
度的同时也减少了研究所需样本量。
2.3　癌症等复杂疾病相关基因变异
通常，来源于父母的肿瘤遗传易感基因具有以
突变形式遗传、经常突变产生终止密码、在肿瘤
发生过程中另一个未突变的等位基因在体细胞中
发生突变失活等特征。对 1名有家族史的胰腺癌
患者外显子组测序分析，发现 15 461个种系基因
组 DNA突变，含 7 318个同义突变、7 721个错义
突变、64个无义突变和 250个插入 /缺失突变 [24]。
其中，SERPINB12、RAGE和 PALB2基因为源于父
母的胰腺癌候选遗传易感基因。有报道称，PALB2
与乳腺癌易感性和贫血相关，进一步对 96个有家
族史的高加索人胰腺癌病例和 1 084个正常对照的
PALB2基因测序发现，该基因在 3例胰腺癌中发生
截短突变，而对照均未检测到突变。 遗传性胰腺癌
中 BRCA2是突变频率最高的基因，而 PALB2的突
变频率屈居第二。结合外显子组和全基因组测序对
38例多发性骨髓瘤组织样本及其外周血样本的遗传
变异分析，发现了几个具有原癌基因致病作用的体
细胞突变，涉及蛋白质翻译、组蛋白甲基化和凝血
功能等。除发现了大量不同形式的变异之外，该研
究的一个重要发现是鉴定到与 RNA处理、蛋白翻
译及蛋白去折叠响应相关基因的频繁突变，这类突
变在近一半的患者中都能鉴定到。结果提示其中突
变率最高的 DIS3突变可能导致蛋白质翻译失调，
是多发性骨髓瘤的一种致癌机制。通常认为肿瘤是
一种分子网络疾病，因此，研究者也进行了基因集
合突变情况分析，试图检测到有变异富集的通路，
其中涉及突变最多的基因集合编码的蛋白参与凝血
级联系统中纤维蛋白凝块的形成过程。这一研究中
不同的变异筛选策略对于肿瘤等复杂疾病提供了良
好的研究思路 [25]。
近几年中国研究者对于癌症的外显子组测序研
究也有了诸多新发现。对 9例急性单核细胞白血病
个体外周血和骨髓样本的外显子组测序，发现 266
个可能的体细胞变异，含 220个单核苷酸变异和 46
个插入 /缺失突变。其中，影响蛋白编码序列的非
同义突变 59个；影响 ORF表达的插入 /缺失突变
10个，其中 66个得到进一步验证。112例样本中
的 23个个体存在 DNMT3A基因的错义突变，均位
于进化保守的氨基酸残基。该突变改变 DNA甲基
转移酶活性，从而导致 DNA甲基化水平和基因表
达异常。DNMT3A突变型个体伴有 HOXB基因簇
CpG岛低甲基化 [26]。对 14例黑色素瘤及其配对正
常组织的外显子组测序分析，发现存在 1个 TRRAP
基因频发突变、GRIN2A基因突变率较高，此外，
大部分突变基因聚集在谷氨酸代谢通路 [27]。移行细
胞癌是膀胱癌的主要类型，对 9例患病个体的组织
样本及配对的外周血样本进行外显子组测序，通过
比较 dbSNP数据库及千人基因组先期亚洲人群数
据，筛选到 465个可能的体细胞突变，包括 329个
错义突变。共鉴定到 49个新候选易感基因，其中
以 UTX(突变率 21%)为代表的 8个基因涉及到染
色质重塑过程，提示这些突变可能与肿瘤的早期发
展相关 [28]。无独有偶，对 10名 HCV病毒相关的
肝细胞肝癌个体的肿瘤组织及对应的正常组织的外
显子组测序分析发现的新易感基因 ARID2，也是染
色质重塑基因之一。该研究同样也鉴定到上百个潜
在的体细胞突变，通过不同种族不同类型的肝癌样
本验证后发现，ARID2在 18.2%的研究个体中存在
失活突变，可能为新的抑癌基因 [29]。
上述研究发现的肿瘤相关基因突变大部分为非
同义突变，也发现了许多插入 /缺失突变，有的基
因同时存在两种以上突变形式，提示肿瘤遗传变异
形式复杂，频率较高。同时，染色质重塑基因在上
述两种肿瘤中的高突变率也再一次有力地提示遗传
改变与表观遗传的失调可能共同协作促进肿瘤的生
成和进展，显示了表观基因组学 (epigenomics)在肿
瘤研究中的必要性。另外，可认识到在不考虑非编
码区变异的情况下，外显子组测序还不能覆盖所有
编码区已知致病变异，可能因为对某些变异区测序
深度不够，或涉及重复区域以及存在数据拼接等问
题。在小样本量研究中，为避免由于测序错误而引
起假阳性结果，需保证足够的测序深度，30重以上
测序深度较为适宜。研究发现 5到 20重深度测序，
可以大幅提升发现遗传变异的敏感度；而 20至 50
林正伟，等：外显子组测序技术在人类疾病研究中的应用第1期 99
重测序，敏感度缓慢升高；大于 50重测序后进入
平台期 [4]。测序深度不仅会影响总测序量、发现新
变异几率和成本，更影响测序数据的准确度。
总之，外显子组测序是介于全基因组关联分析
与全基因组测序之间的基因分析策略 [30]。该技术能
较系统地发现基因组中蛋白编码区的主要遗传变
异，与全基因组测序相比，工作量与分析成本相对
较低。目前外显子组测序还不能覆盖所有编码区的
致病变异，需要通过选择不同富集与测序平台、提
高测序深度，以及改进数据分析与拼接方法等措施
进一步完善。
[参　考　文　献]
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