全 文 ：第25卷 第11期
2013年11月
Vol. 25, No. 11
Nov., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)11-1135-09
DNA拼接技术研究进展
张双华，孙　源，张治洲*
(哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院，山东省海洋船舶防污工程技术研究中心，威海 264209)
摘　要：基因组合成是合成生物学的一个重要环节，其发展将会对未来的生物、医药、农业、能源等方面
的发展产生巨大的推动作用，同时 DNA拼接作为基因组合成所需要的一种关键技术也日臻完备。回顾了
多种 DNA拼接技术，并对其中最具发展潜力的几种方法作了综述，探讨不同 DNA拼接技术的原理和特点。
关键词：基因组合成；DNA拼接；Gibson拼接；酵母同源重组
中图分类号：Q78 文献标志码：A
Research progress in DNA assembly technologies
ZHANG Shuang-Hua, SUN Yuan, ZHANG Zhi-Zhou*
(School of Marine Science and Technology, Marine Antifouling Engineering Technology Center of Shangdong Province,
Harbin Institute of Technology, Weihai 264209, China)
Abstract: Genome synthesis constitutes an important part of synthetic biology, and its development will bring huge
impact on many disciplines such as biology, medicine, pagriculture, energy and so on. By now DNA assembly is a
key technology for genome or long DNA synthesis. Some DNA assembly technologies have acquired strong
functional progress. In this review, a series of DNA assembly techniques are described and discussed in the context
of their principles, potentials and characteristics.
Key words: genome synthesis; DNA assembly; Gibson assembly; yeast homologous recombination
收稿日期：2013-03-15； 修回日期：2013-05-15
基金项目：国家自然科学基金项目(31071170)；GRED-
BIO基金, HIT (hitwh200904)；985基金和 HITNSRIF
(2011101)
*通信作者：E-mail: zhangzzbiox@hitwh.edu.cn
21世纪伊始，人工合成基因组方面的研究成果
紧紧抓住了世人的目光。2002年，Wimmer研究组
用化学方法合成了脊髓灰质炎病毒的全长 cDNA [1]，
开创了以无生命的化合物合成感染性病毒的先河；
2003年，Smith等 [2]仅用 2周时间便合成了噬菌体
φX174的基因组；2007年，Venter 团队将蕈状支原
体的整个基因组分离为“裸露”的 DNA，并将其
移植到山羊支原体中，实现了不同物种间的基因组
转输 [3]；2008年，Venter团队成功完成生殖支原体
Mycoplasma genitalium的全基因组 JCVI-1.0合成 [4]；
2010年，Venter研究组构建了一个能够繁殖的人造
细胞“Synthia”[5]；2010年，他们又发明了简单有
效的体外基因合成技术——Gibson等温一步拼接
法 [6]；2011年，Dymond等 [7]取得了酿酒酵母基因
组人工合成计划 (SC2.0 Project)的第一个成果——
成功设计合成了酿酒酵母的部分染色体，该项目的
最终目标是人工合成构建酿酒酵母基因组。
众多的科研成果表明，基因及基因组的合成是
当前合成生物学的主要内容之一。通过基因合成，
可以获得自然界中存在或者不存在的基因，为人类
改造生命开辟了一个全新的方向，在可预见的未来，
基因 (组 )合成将在生命科学领域发挥巨大作用。
那么目前长达几万碱基对 (base pair, bp)甚至上百万
bp的基因组 DNA片段是如何获得的，实际上，目
前基因的合成过程就是由短的 DNA片段到长的
DNA片段的拼接过程，可见拼接技术在基因组合
成中起着至关重要的作用。
本文就目前基因人工合成过程中采用的各种拼
∙ 技术与应用 ∙
生命科学 第25卷1136
接方法的原理和特点展开试述。
1　体外拼接方法
DNA体外拼接是指在生物体外通过连接而实
现的两个及两个以上的 DNA短片段到长片段的过
程。实现体外拼接的方法有很多种，根据其原理可
以分为：寡核苷酸链的拼接方法，基于限制性内切
酶和连接酶的连接方法，基于重叠序列和聚合酶延
伸的方法，以及基于核酸外切酶活性的连接方法等。
值得注意的是，大多数的体外拼接方法存在拼接效
率低的缺点，因此，往往要结合基因克隆技术，将
体外拼接获得的目的片段插入到能够承受巨大
DNA片段的载体中，如细菌人工染色体 (bacterial
artificial chromosome, BAC)或酵母人工染色体 (yeast
artificial chromosome, YAC)，然后转化到受体细胞
中，以获得稳定的、高拷贝量的目的产物 [8-11]。
1.1　寡核苷酸链的拼接方法
1.1.1　聚合酶链式拼接(polymerase chain assembly,
PCA)
PCA 法是一种基于聚合酶链式反应 (poly-
merase chain reaction, PCR)原理的方法，实现的是
由单链寡核苷酸到几百至几千 bp的双链 DNA的拼
接。用于PCA法的单链寡核苷酸彼此之间部分重叠，
并覆盖整个目的基因序列的双链。拼接时，这些部
分重叠、等摩尔量的寡核苷酸片段彼此互为引物互
为模板，在嗜热性 DNA聚合酶的作用下，通过退火、
延伸变成更长一些的双链 DNA；然后，再通过与
其他寡核苷酸片段或延伸产物之间的变性、退火及
延伸的循环，逐步实现寡核苷酸片段的拼接 [11-17](图
1A)。
PCA法中参与拼接的寡核苷酸片段不需要磷
酸化，且允许寡核苷酸片段之间有间隔，因此这个
方法的合成费用较低而得到广泛使用。
1.1.2　连接酶链式反应(ligase chain reaction, LCR)
与 PCA法相似，LCR法的作用对象也是寡核
苷酸链，合成的双链 DNA长度也在几百到几千
bp。与 PCA法不同的是，LCR法要求用于拼接的
寡核苷酸的 5-端磷酸化，因此，相邻片断之间不
能有间隔。这种方法利用嗜热性 Taq连接酶在高温
下修复缺刻和连接 DNA的功能，将首尾相连、重
叠杂交的 5端磷酸化的寡核苷酸片段连接起来 [2,8-10]
(图 1B)。
LCR法的优势是 Taq 连接酶对有错配的末端
不能连接，可以降低连接产物的突变率；同时由于
反应是在较高温度下进行的，因此，可以排除
DNA二级结构的干扰，但由于这种方法要求用于
A：聚合酶拼接法(PCA)；B：连接酶拼接法(LCR)，5端磷酸化，两种方法获得的DNA片段长度在几百到几千bp
图1　常用的寡核苷酸链的拼接方法
张双华，等：DNA拼接技术研究进展第11期 1137
拼接的寡核苷酸片段磷酸化，因此，合成费用较
PCA法高。
1.2　基于限制性内切酶和连接酶的连接方法
基于限制性内切酶和连接酶的连接方法将限制
性内切酶的酶切活性，以及 DNA连接酶的“基因
针线”活性完美地结合在一起，并借助于克隆载体
实现整个拼接过程。其原理：待拼接的 DNA片段
插入到含有选择性标记的载体中；然后利用限制性
内切酶酶切载体，以产生用于连接的含有黏性互补
末端的两部件，一种只含有 DNA片段，另外一种
则是仍然与质粒相连的 DNA片段；之后利用 DNA
连接酶将两部件在黏性末端处重新连接；连接后的
产物仍然存在于质粒中，因此，通过转化、阳性克
隆筛选、提取质粒、酶切等过程，就可以获得变长
的目的产物 [18-19]。
这种依赖限制性内切酶活性的连接方法，不允
许待拼接的 DNA片段序列内部含有相应的限制性
内切酶识别位点，因此，在应用方面有很大的局限
性。合成生物学中的 Biobrick连接法和选择性连接
法 (ligation by selection, LBS)就是很典型的基于限
制性内切酶和连接酶的连接方法。
1.2.1　Biobrick连接法
合成生物学的基本出发点之一是将复杂的生命
系统拆分为各个功能元件， 通过对生物元件进行标
准化、模块化定义，以实现对生物元件的逐级组装，
直至构建一个新的功能系统。Biobrick就是为了实
现能够在活细胞体内搭建上面描述的相应的生物系
统而建立的标准。标准的 Biobrick 由 3部分组成：
前缀 (prefix)、主体 (body)和后缀 (suffix)。主体部
分是一段有特定功能的 DNA序列，可以是调控基
因、蛋白质编码基因、终止子等，也可以是它们的
组合；前缀和后缀则是两个含特殊酶切位点的序列，
起到类似于传统机械制造中接口的作用 [8,10,18]。
标准的 Biobrick连接法中的 biobrick是一种标
准化的质粒，其前缀含有限制性内切酶 EcoRI 和
XbaI的识别位点，后缀中具有限制性内切酶 SpeI
和 PstI的识别位点，其中前缀中的 XbaI和后缀中
的 SpeI是同尾酶。同尾酶的使用是 Biobrick连接法
的特殊要求，也是后续拼接能够获得成功的必要条
件。拼接时，将待拼接的 2个 DNA片段 1和 2，分
别插入到标准化的质粒的预定位置；然后两重组质
粒分别经 EcoRI 和 SpeI以及 EcoRI和 XbaI酶切，
分别得到片段 1以及仍旧连在质粒上的片段 2；随
后将纯化后获得的等比例的两部件以及 DNA连接
酶混匀于同一体系中，利用连接酶的连接活性将两
部件连接起来，从而获得含有目的产物的重组质粒，
所获得的目的产物中片段 1和片段 2是由一段 “疤
痕”序列连接在一起的，其本质是质粒上与同尾酶
的结合位点 (图 2A)。最后通过筛选阳性克隆、提
取质粒、酶切等过程获得目的产物 [18]。 Anderson
A：标准的Biobrick连接法；B：内融合Biobrick连接法。B中的AF和BR为载体引物，BF和AR为接头引物
图2　Biobrick连接法
生命科学 第25卷1138
等 [19]对标准的 Biobrick进行了修改，修改后用同
尾酶 BglII和 BamHI分别替换标准的 Biobrick中的
XbaI和 SpeI。他们将这种修改后的生物模块称为
BglBrick，其连接的原理与标准的 Biobrick连接法
相同，连接产物中也含有“疤痕”序列。
还有一种特殊的 Biobrick连接法——内 -融合
(In-Fusion)BioBrick连接法 [18]。目前已有多家公司
研发成功专门的 In-Fusion BioBrick连接试剂盒，如
TaKaRa的 In-Fusion® HD Cloning System。与标准
的 Biobrick连接法的不同之处在于：这种方法并不
是通过限制性内切酶的酶切作用，而是通过设计特
殊的引物经 PCR获得两种中间产物的。引物的设
计是拼接的关键，此法所用引物共 4条，其中 2条
引物 (如图 2B中的 AF和 BR)是根据载体序列设
计获得的，称为载体引物。另外 2条引物 (如图 2B
中的 BF和 AR)的序列包括三部分，5→3方向依
次为：与之拼接的 DNA片段的一段碱基序列、“疤
痕”序列 (5-TACTAGAG-3)、待拼接片段的引物序
列。连接时，首先将待拼接的两 DNA片段 1和 2
插入到标准化的载体的特定位置，然后利用上述引
物组合扩增获得两中间产物，随后利用 In-Fusion
试剂盒进行组装即可获得含有目的产物的重组质粒，
与普通的 Biobrick连接法的目的产物相同，In-Fusion
BioBrick连接产物也含有一段“疤痕”序列 (图 2B)。
1.2.2　选择性连接法 (ligation by selection, LBS)
LBS法在利用限制性内切酶、连接酶活性的基
础上，还巧妙地应用了具有抗生素抗性基因的载体，
拼接过程中两载体上的抗生素抗性基因进行了重新
的组合，因此，可以通过筛选新的抗生素组合来筛
选含目的基因的载体。
2004 年，Kodumal 等 [20]用此法将 8 条长约
3.4 kb的短片段连接在一起，最终获得长达 32 kb
的聚酮合酶 (polyketide synthase)基因。该项研究中
用到的两种质粒，一种具有氨苄青霉素抗性
(ampicillin resistance, ApR)、氯霉素抗性 (chloram-
phenicol resi stance, CmR)及四环素抗性 (tetracycline
resistance, TetR)，另一种则具有氨苄青霉素抗性、
卡那霉素抗性 (kanamycin resistance, KmR)以及链
霉素抗性 (streptomycin resistant, StR)。连接时，首
先通过 PCR方法在待拼接的两 DNA片段 1和 2的
两端添加上限制性内切酶 BsaI和 BbsI的识别位点；
然后将片段 1和 2分别插入到上述两种质粒中；随
后分别用 BbsI和 XhoI以及 BsaI和 XhoI将两质粒
酶切开，这样就得到与具有 TetR和 ApR的质粒相
连的片段 1以及与具有 KmR的质粒连在一起的片
段 2。最后用 DNA连接酶将纯化后的两片段连接
在一起，获得含有目的产物的重组质粒，该重组质
粒同时具有 TetR和 KmR，因此，通过筛选 TetR
和 KmR阳性克隆就可以获得目的产物 (图 3)。与
Biobrick连接的产物相同，用 LBS法拼接获得目的
产物也含有 8~13 bp的“疤痕”序列。
2008年， Engler等 [21]对 LBS法进行了改进，
改进后的方法称为“Golden Gate”克隆连接法，此
法是一种由 IIS型限制性核酸内切酶 (IIS restriction
enzyme)介导的，因此也称为“IIS”克隆连接法。
IIS型限制性内切酶能够特异性识别双链 DNA上
图3　选择性连接法(LBS)
张双华，等：DNA拼接技术研究进展第11期 1139
的靶位点，并在靶位点下游非特异性地对 DNA双
链进行切割，在 DNA双链的 5或 3端产生黏性末
端。“Golden Gate”克隆连接法是在同一反应体系中，
利用 IIS型限制性内切酶，在识别位点之外切开
DNA，产生含黏性末端的 DNA片段，同时用连
接酶将几个 DNA片段按照既定的顺序连接，拼接
成不含酶识别位点的 DNA片段，因此，“Golden
Gate”克隆连接法获得的目的产物是“无缝”连接
产物。
1.2.3　“ MASTER”连接法
“MASTER”为methylation-assisted tailorable ends
rational的缩写，于 2013年由 Chen 等 [22]发现，是
一种新颖的基于限制性内切酶的 DNA拼接方法。
“MASTER”连接法所用到的限制性内切酶 MspJI
是一种甲基化修饰依赖性核酸内切酶，能够识别
mCNNR(R=A或 G)位点并能够在修饰的胞嘧啶 3
一侧 N9/N13处切割双链 DNA，能够识别的胞嘧啶
修饰包括：C5-甲基化胞嘧啶 (5-mC)和 C5-羟甲基
化胞嘧啶 (5-hmC)。这种方法不仅适用于 PCR扩增
产物之间的组装，也适用于限制性内切酶酶切片段
之间的拼接。连接时 PCR扩增产物或者酶切片段
分别经甲基化的引物或者甲基化适配器的作用进行
甲基化修饰，然后在 MspJI的作用下切割双链
DNA并进行连接，从而获得目的产物。
1.3　基于重叠序列和聚合酶延伸的连接方法
重叠延伸 PCR (overlap extension PCR, OE-PCR)
和环形聚合酶延伸法 (circular polymerase extension
clone, CPEC)是常见的两种基于重叠序列和聚合酶
延伸的连接方法 [20-27]。
1.3.1　OE-PCR
OE-PCR法的原理是具有重叠序列的寡核苷酸
片段经变性、退火后形成互补双链，然后在嗜热性
DNA聚合酶的作用下进行延伸，最后利用两末端
引物将其扩增出来，以获得连接产物。该方法方便
有效，但依赖于聚合酶的高保真度，合成的大片段
长度约在 20 kb以下 [1-2,20-24]。
在 OE-PCR法中，引物的设计对 OE-PCR 反应
的成功与否起着决定性的作用。目前通常按照
Donato 等提出的核心模板方式来设计用于 OE-PCR
法的引物，该模式的主要原理是从目的基因的中间
开始设计引物，在每一轮的 PCR反应中都以中间
合成的片断为模板，以两端片段为引物，逐步实现
目的基因由中间到两头的延伸，这样经过一次 PCR
反应可以获得长度在 400 bp以内的短产物，而经过
多次的 PCR反应就可以获得长度在 20 kb以下的目
的产物 (图 4A)。
1.3.2　CPEC
CPEC法原理与 OE-PCR类似，但是这种方法
不需要扩增引物，而是直接将末端重叠的多个片段
和载体一步连接成完整的环状质粒，然后转化进入
受体细胞，在体内实现克隆扩增 (图 4B)[25-27]。
1.4　Gibson体外同源重组拼接法
Gibson体外同源重组拼接法是一种基于核酸外
切酶活性的连接方法，更准确的说是一种依赖于重
叠序列、核酸外切酶、聚合酶以及连接酶的拼接方
法。该法原理：具有 20~80 bp末端重叠序列的、等
A：重叠延伸PCR(OE-PCR)，原理同PCA法；B：环形聚合酶延伸法(CPEC)
图4　常用的基于重叠序列和聚合酶延伸的连接方法
生命科学 第25卷1140
摩尔量的两个或者多个双链 DNA片段经核酸外切
酶酶切后，DNA双链中的一条链的部分碱基被切
去，在两 DNA片段之间暴露出互补的黏性末端，
使待拼接的两片段的重叠区之间可以通过退火而互
补，然后在 DNA聚合酶和 DNA连接酶的作用下
将缺口补齐，实现片段间的连接而获得目的产物。
Gibson体外同源重组拼接法在其发展过程中经
历了变温拼接法到等温一步拼接法的进化过程，两
种方法的原理相同，只不过由于所用核酸外切酶
类型不同，而导致反应时对温度的要求产生了差
异 [4-6,28-30]。
1.4.1　变温拼接法
变温拼接法是 Gibson等 [4]在合成M. genitalium
JCVI-1.0全长基因组时提出的，合成的 DNA片段
长度长达几十到几百 kb。此法中所用到的工具酶有
T4 3核酸外切酶、Taq DNA聚合酶以及 Taq DNA
连接酶。由于 T4 3核酸外切酶和 Taq DNA聚合酶
都具有 3→ 5核酸外切酶活性，两者存在对底物
的竞争关系，因此，在反应过程中要借助于温度的
变化，使得在某一温度下两者中只有一种存在酶活
性，而另一种酶的活性则是处于被抑制的状态，具
体的温度设置情况将在后续段落中详述。
变温拼接法分 3步进行：⑴用 3核酸外切酶
切去 DNA 3端的部分碱基，使得相邻的两片段的
重叠区之间可以通过退火互补，该步骤的反应条件
为 37 ℃反应 5~15 min，此后将反应体系放置于
75 ℃条件下 20 min，以终止反应 (T4失活 )；⑵采
用逐步降温的方式 (-6 ℃ /min)将温度降至 60 ℃，
并且保持此温度 30 min，以使黏性末端充分互补。
此后逐步降温 (-6 ℃ /min)将温度调至 4 ℃；⑶在
反应体系中加入 4种 dNTP，通过 Taq聚合酶将缺
口补齐，切去 5突出端，最后经 Taq连接酶进行连
接，从而获得目的基因 (图 5)。
1.4.2　Gibson等温一步拼接法(Gibson Assembly)
正如上述描述的那样，变温拼接法需要在温度
循环反应器中进行，因此，操作起来十分不便，这
样便限制了变温拼接法的推广应用，为了解除这种
限制，Gibson等迎头赶上，随即发明了一种在 50 ℃
恒温条件下进行的等温一步拼接法。此方法选用
T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶和 Taq 连接酶
三种高效率的酶实现连接反应，且不像 3核酸外切
酶与聚合酶那样，T5核酸外切酶和 Phusion聚合酶
之间不存在对底物的竞争，因此，这两种酶可以在
同一温度下同时保持酶活性。此外，Phusion DNA
聚合酶具有 3→5核酸外切酶的活性，扩增途中如
果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证
了扩增的准确性 [4,6]。
该法原理是利用 T5核酸外切酶的 5→3外切
酶活性，使 DNA片段双链中的一条链的 5末端被
酶切掉，从而暴露出互补黏性末端，然后两 DNA
片段在单链处通过碱基互补，形成具有缺口的长
DNA片段，最后利用 Phusion DNA聚合酶和 Taq
图中所示为Gibson变温拼接法的连接原理示意图，其中 代表两片段的重叠部分
图5　Gibson变温拼接法
张双华，等：DNA拼接技术研究进展第11期 1141
DNA连接酶将缺口补齐，获得完整的目的片段 (图
6)。Gibson等 [6]利用此法成功地将 4个大于 100 kb
的片段在体外组装成完整的 583 kb的生殖支原体基
因组。
2　体内拼接方法
2.1　枯草芽孢杆菌体内同源重组拼接法
2007年， Itaya等 [31]以枯草芽孢杆菌基因组
(Bacillus subtilis genome, BGM)为组装载体，完成
了小鼠线粒体基因组和水稻叶绿体基因组的组装。
BGM载体允许大型 DNA片段稳定存在于其基因组
序列中。他们将这种方法称为“Domino method”，
此法可以将多个 DNA片段按一定的顺序，通过它
们之间的重叠序列依次克隆进 BGM载体，从而获
得目的 DNA。
2.2　酵母体内同源重组拼接法
酵母体内同源重组拼接法是一种利用酵母细胞
内高效的同源重组系统来实现多个相互存在同源序
列的 DNA片段的组装的方法，其实早在 2002年利
用酵母进行 DNA装配已经有报道，但当时只是用
来组建小型 DNA分子 (长度 1 kb左右 )，而多个
DNA分子同时组装，且成功组建大型 DNA分子的
案例却未见报道 [4,32-34]。直至 2008年，Venter研究
组利用变温拼接法和酵母同源重组拼接法构建成长
达 582 bp、970 bp的 M. genitalium JCVI-1.0全基因
组，揭示多个 DNA片段能够一次组装成目标 DNA
片段 [4]。2009年，他们利用酵母同源重组拼接法，
将含重叠序列的 25条长约 24 kb的装配子一步组装
构建成 M. genitalium JCVI-1.1全基因也充分证明了
这一结论。2010年，Venter等又通过此法成功构建
了长达 1.1 Mb的丝状支原体 (Mycoplasma mycoides)
基因组，这个基因组从 1 078个 1 kb DNA重叠片
段通过 3个阶段构建完成。拼接时，10个有着 80 bp
重叠区域的 DNA片段利用一个可以在酵母和大肠
杆菌中穿梭的梭型载体共转化进入 YAC载体中；
然后挑取酵母克隆，经电转化后导入大肠杆菌中纯
图6　Gibson等温一步拼接法原理图
化装配产物；最后筛选含有目的片段的克隆 [5]。
酵母体内同源重组拼接法在合成超长的 DNA
如细菌基因组时有很大的优势，但目前酿酒酵母同
源重组装配的上限还不清楚。
3　结语与展望
作为基因合成的关键技术——DNA拼接技术
也顺应了时代的潮流，正越来越趋于高效化、多样
化，合成的 DNA片段长度也由原来的几十、几百
bp发展到了目前的几十万 bp。同时我们看到每一
种 DNA拼接方法在发挥其自身优势的同时，也都
存在着或多或少的不足 ( 表 1) 。
目前，DNA拼接技术仍处于起步阶段，合成
成本昂贵、合成片段长度有限等缺点还没有得到很
好地解决。但我们坚信，随着科技水平的进步和人
们越来越多的关注，DNA拼接技术及基因合成技
术必将取得更大的发展，为科技的进步、人类的健
康做出更大贡献。
生命科学 第25卷1142
[参　考　文　献]
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拼接方法
PCA
LCR
Biobrick连接法
In-Fusion BioBrick
连接法
LBS
MASTER连接法
OE-PCR
CPEC
Gibson变温拼接法
Gibson等温一步拼
接法
枯草芽孢杆菌体内
同源重组拼接法
酵母体内同源重组
拼接法
表1　不同DNA拼接技术的比较
优势
合成费用相对较低；拼接产物为无
“疤痕”产物
突变率低；排除DNA二级结构的干
扰；拼接产物为无“疤痕”产物
将拼接片段标准化、模式化
对Biobrick连接法的改进，可以同时完
成多个DNA片段的组装
巧妙地运用了抗生素抗性基因的重
组，结果显而易见
不仅适用于PCR扩增产物之间的组
装，也适用于限制性内切酶酶切片
段之间的拼接；拼接产物为无“疤
痕”产物
原理简单；合成成本较低；拼接产物
为无“疤痕”产物
不需要扩增引物；拼接产物为无“疤
痕”产物
可以同时实现多个片段的拼接；拼接
产物为无“疤痕”产物
反应在50℃恒温条件下进行，操作简
便；拼接产物为无“疤痕”产物
不仅适用于PCR扩增产物之间的组
装，也适用于限制性内切酶酶切片
段之间的拼接，应用范围较广；拼
接产物为无“疤痕”产物
目前报道的最高效的组装DNA大片段
的方法；拼接产物为无“疤痕”产物
不足
合成片段短
合成费用较PCA法高
用于拼接的基因片段不能含有相应的
限制性内切酶位点，应用受限；拼
接产物含有8~13 bp的“疤痕”
接头引物的设计成本高；拼接产物含
有8~13 bp的“疤痕”
操作复杂；用于拼接的基因片段不能
含有相应的限制性内切酶位点；拼
接产物含有8~13 bp的“疤痕”
待拼接的DNA片段必须经过甲基化或
者羟甲基化，提高了合成的成本
引物的设计和合成较为复杂
需要进行克隆载体的构建
反应需要在温度循环反应器中进行，
操作较繁复
合成费用高，拼接效率低
反应逐步完成，不能同时实现多个
DNA片段的组装
研究尚不充分
合成片段长度
几百~几千bp
几百~几千bp
几十kb
几kb~几十kb
几十kb
几十kb
在20 kb以下
在20 kb以下
几十~几百kp
超过500 kb
几十~几百kb
超过Mb
张双华，等：DNA拼接技术研究进展第11期 1143
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