全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 3期
2008年 6月
Vol. 20, No. 3
Jun., 2008
单分子层次上相互作用自动检测 *
Daniel MÜLLER1，龚麟宸2 译述
（1Center of Biotechnology, University of Technology Dresden, Germany; 2清华大学高等研究中心，北京 100084）
摘　要：任何生命过程都与分子间相互作用有关。这些相互作用决定了生物分子间的“交流”方式，
组成了生物过程的基本语言。Müller教授研究组发展了一种全自动“机器人”(一种全自动原子力显微
镜)，可以通过检测细胞上的“分子机器”分析分子间相互作用。为了实现这样的目标，该仪器需
要将不同的空间尺度联系起来：宏观尺度的悬臂利用其微观尺度的针尖与纳米尺度的蛋白质相接触，进
而在亚纳米的尺度上定位与检测分子间相互作用。这项技术能够帮助人们以亚纳米尺度的分辨率定位细
胞内分子机器的相互作用位置，并且观察分子间相互作用如何驱动这些分子机器行使功能。在药物筛
选研究领域，该技术可以被用来检测配体以及抑制剂与蛋白质结合的位点和强度，还可以检测受体的
不同功能状态。
关键词：原子力显微镜；纳米技术；分子生物学；膜蛋白结构
中图分类号：Q2-33; Q7; TH742　　文献标识码：A
文章编号 ：1004-0374(2008)03-0342-08
收稿日期：2008-02-25
*原英文报告名：Fully automated screening of interac-
tions at the single molecule level
通讯作者：E-mail: Mueller@biotec.tu-dresden.de
Müller教授报告的主题是观测与控制细胞内的
分子机器，这是因为生物过程本身及许多与其相关
的研究最终都与分子机器紧密联系。细胞是一个非
常复杂的工厂，它由许许多多“机器”组成，比
如离子通道、信号分子受体、分子马达以及 ATP
合成酶等。这些机器就如同宏观世界的管道、引擎
和发电机一样紧密结合，协调工作。细胞内的分子
机器并不是孤立的，它们相互作用，互相调控，甚
至可以依照细胞状态调整自身功能。事实上，分子
机器的相互作用网络远比想象的复杂，人体内大约
有十万种蛋白质，而蛋白质间相互作用的可能组合
则达到惊人的十亿量级。同时，无论是尝试理清细
胞内蛋白质相互作用网络，还是设计、构建复杂的
分子机器，人们都需要深入理解分子间相互作用。
因为分子间相互作用是所有细胞内通迅的基本语
言，它决定了分子机器运动和生物过程的种种特
性。Mueller教授的报告主要介绍了原子力显微镜
(atomic force microscopy, AFM)在测量生物分子间相
互作用方面的应用。
Müller教授的研究主要关注生物膜与膜蛋白。
它们之所以重要是因为所有生物细胞都由细胞膜包
裹，而细胞内 30% 的基因被用来表达膜蛋白；另
外，从实用的角度考虑，50% 的药物靶点是膜蛋
白，因此膜蛋白与药物设计密切关联。
目前，全球药品市场的销售量达到每年五千到
六千亿美元，其中 15% 的收入需要投入药物研发
(IMS health 2006)，而这一费用还在呈指数增长。药
物设计需要深入研究药物与靶点的相互作用，其中
包括：相互作用位点、相互作用对目标蛋白功能的
影响(激活、抑制或调控)、药物与靶点结合强度及
不同药物间的竞争等。研究这些问题需要应用多种
高技术手段。实际上单分子力谱(single-molecule force
spectroscopy)就可以提供所有这些信息。利用单分子
力谱的观测是实时、无需标记，且近似自然环境
的，少量(皮摩尔量级)的样品即可满足检测要求。
1　原子力显微镜介绍
原子力显微镜[1]被称为针尖上的试验室(Lab on
a Tip)(图 1)。它的主要组成部分是一个几十微米长
的悬臂，悬臂的一端有一个探针，悬臂上探针的背
面是一个光反射面。入射的激光被反射面反射，出
射光被光电系统接收。在成像模式下，悬臂带动探
针逐行扫描生物膜表面；膜表面高度的变化通过探
针影响悬臂，使悬臂弯曲，从而导致反射面上的出
射光改变方向，方向的改变被精密调节的光电系统
343第3期 Daniel MÜLLER：单分子层次上相互作用自动检测
探测即可还原膜表面的高度变化，进而绘出膜表面
形貌图。原子力显微镜的最高分辨率在垂直于膜表
面方向可达到 0.1nm，在水平方向可达到 0.5nm，
适合用来观测膜蛋白的结构细节。将原子力显微镜
的成像图与相应蛋白质X光晶体衍射结构、电子晶
体学结构比较，可以发现原子力显微镜的接触式成
像过程基本不影响膜蛋白结构，且原子力显微镜的
成像在一定程度上比上述两种方法更灵活与迅速。
2　应用原子力显微镜观察膜蛋白形貌
如前所述，原子力显微镜最主要的功能之一是
以亚纳米尺度的分辨率刻画膜蛋白表面形貌，以提
供结构方面的细节信息。Müller教授在这部分报告
中主要介绍了他们对大肠杆菌(E. coli)细胞膜表面孔
蛋白(Porin)的研究。大肠杆菌外膜包含大约 105个
孔蛋白，其中最主要的是OmpF蛋白。这些孔蛋白
允许相对分子质量小于 600的小分子通过，其中包
括细胞所需的一些营养物质以及抗生素。用电子显
微镜观察负染色的重组双层孔蛋白晶体可以得到
20Å分辨率的晶体结构。而利用原子力显微镜，可
以将观测分辨率提高到竖直方向 1Å，水平方向10Å
的水平，所得孔蛋白结构与X射线晶体衍射结构完
全相符[2]。OmpF孔蛋白由三个穿膜亚基组成，三
个亚基包围着膜孔，穿膜区为 β折叠桶结构[3]。实
验表明孔蛋白膜孔在膜电势大于一定临界值或者细
胞外pH值低于一定程度时会由开启状态转变为关闭
状态。原子力显微镜可以观察到该过程中膜蛋白结
构的变化[4]，并利用其高分辨率帮助研究人员了解
结构细节方面的信息。
Müller教授研究组与该领域其他研究组一起，
在应用原子力显微镜研究膜表面复杂蛋白复合体结
构方面，取得了许多重要成果。其中包括对膜孔蛋
白[2,4]、光反应系统[5]以及ATP合成酶 F0部分[6]等一
系列重要膜表面分子机器的研究，相关信息可见图
2 。
3　应用原子力显微镜观察膜蛋白工作过程
尽管仍然有大量的研究关注于如何分离与重组
各种膜蛋白，进而取得高分辨率的原子力显微图
像，但同时已经有越来越多的研究组开始考虑怎样
直接观察天然生物膜及其上膜蛋白的问题。在此基
础上，人们就可以利用原子力显微镜观察膜表面分
子机器行使自身功能的过程。
Müller 教授介绍了他们对细胞间隙连接(gap
junction)的研究。细胞间隙是脊椎动物细胞间的直
接通讯方式，可以协助相邻细胞交换小分子与信
号。每个细胞间隙通道由一对六聚体半通道组成。
六聚体半通道称为连接子(connexon)，其穿膜区为
α- 螺旋结构。早期的实验发现：钙离子浓度可以
调控细胞间隙连接的开闭。Müller教授研究组应用
原子力显微镜对连接子的细胞膜外表面形貌进行了
研究，研究对象是含有过表达连接子26(connexon26)
的HeLa细胞的部分细胞膜。它们的成像分辨率在水
平方向达到 1 .2 nm。原子力显微镜图片清楚地显
示：缓冲液中，钙离子存在与否对连接子在细胞膜
外表面的形貌有较明显的影响，细胞间隙通道内直
径由没有钙离子时的 1.5nm减少为有钙离子时的
0.6nm，而外直径几乎未变，伸出细胞膜表面部分
的高度也没有明显变化(图 3，其中左侧为缓冲液中
未加钙离子情况，右侧为加入 0.5mmol/L的钙离子
情况) [ 7]。
另一方面，生化实验表明缓冲液 pH值降低也
可以导致连接子的关闭[8]。Müller教授研究组应用
原子力显微镜成像发现，只有当溶液中存在氨基磺
酸(aminosulfonate)时，细胞间隙通道结构才有酸碱
度依赖性[9]。在 pH<6.5时通道关闭，而在 pH>7.6
图1　原子粒显微镜结构
344 生命科学 第20卷
时完全打开。细胞膜外表面的连接子通道的内直径
随 pH值升高逐渐增大，而外直径不变；另外整个
连接子有 6.5°的旋转。
因此，原子力显微镜的研究结果表明：细胞
间隙通道(连接子半通道)对于不同的配体结合或环境
变化(钙离子或低 pH值)有各自特异的响应机制，而
不同的响应机制对应着连接子细胞膜外部分不同的
结构变化。
4　应用原子力显微镜和单分子力谱深入理解膜蛋
白分子间相互作用
除了用原子力显微镜成像来描述膜蛋白形态与
工作过程外，Müller教授研究组还尝试应用单分子
力谱方法主动对膜蛋白施加力，从而了解其分子间
相互作用的细节，为诸如配体结合于膜蛋白的位
置，它们的相互作用强度等一系列分子生物学家关
心的问题提供答案。
Müller教授研究组采用将原子力显微镜成像功
能与单分子力谱功能相结合的方案来研究单个膜蛋
白内部或与其他分子的相互作用，具体步骤为：首
先用原子力显微镜为膜表面成像，并选定将要操作
的膜蛋白；以一定的力将原子力显微镜探针压向选
定蛋白，并持续一段时间，此时膜蛋白与探针之间
有一定概率紧密结合；抬起探针，以一定速度拉伸
膜蛋白，测得其力 -拉伸曲线；拉伸结束后再次成
像，以确定被拉伸蛋白的位置[10,11]。
Müller 教授以 Na +/H+逆向转运蛋白(Na +/H+
antiporter)的研究为例介绍这种技术。Na+/H+逆向转
运蛋白广泛存在于细菌、植物和哺乳动物等各种生
物体细胞中。它们主要负责调控细胞内部钠离子与
氢离子浓度(将钠离子运出细胞，换回氢离子)，从而
图2　Müller教授等应用原子力显微镜获得的主要成果
图3　钙离子对细胞间隙通道的影响
345第3期 Daniel MÜLLER：单分子层次上相互作用自动检测
调节细胞内的酸碱度与盐度，保护处于非正常环境
下的细胞；另外，它们还有调节细胞体积的功能。
在大肠杆菌中，Na+/H+逆向转运蛋白NhaA的
活性受到环境酸碱度的调控，当 pH值由 7.0升到
8.0时，NhaA的活性提高了 2 000倍。Müller教授
研究组应用单分子力谱技术仔细研究了NhaA膜蛋白
的力 - 拉伸曲线[12]。
在拉伸NhaA过程中，力 -拉伸曲线明显呈现
出多峰形态(图 4上，这里与图 5中的拉伸曲线都是
多次拉伸的平均结果)，每个峰代表着膜蛋白某个
稳定的膜内结构单元被外力拉开的过程。结构单元
被拉开前，力随拉伸距离逐渐上升代表着已被拉开
肽链的力 -拉伸曲线，可以用虫链模型拟合(worm-
like chain，见图 4上中红色实线，红线上的数字是
该拉伸曲线对应的肽链长度)，而结构单元被拉开
后，力突然减小，呈现出陡峭下降的形状(图 4中
被拟合峰的右边界)。因此，利用这些力 - 拉伸曲
线，再辅以其他试验信息，就可以分辨出NhaA穿
膜区的结构单元，还可以知道结构单元由哪些相互
作用较强的穿膜 α-螺旋组成(图 4下) ；另外，力 -
拉伸曲线的峰值力代表了该峰所对应的结构单元被
拉开时的去折叠力，去折叠力的大小暗示着结构单
元内部相互作用的强度。
Müller教授研究组在不同pH值条件及钠离子浓
度下研究了NhaA的力 -拉伸曲线[13](图 5)。他们发
现，50mmol/L钠离子浓度下，当 pH值由 3.8、5.5
(NhaA完全未激活)提高到 7.7(NhaA完全激活)的过
程中，力 -拉伸曲线基本未变，只是长度为 225个
氨基酸(225aa)的拉伸峰明显加强了(图 5A、B、C中
圆圈内部分)。这种增强是可逆的(图 5D)，即在 pH
再次降低时，峰的强度又下降。另外，当溶液中
没有钠离子，而 pH升高时，225aa峰的强度只是
略微增加。考虑到225aa峰的位置正对应着与NhaA
钠离子结合相关的螺旋V，该螺旋上的残基D163与
D164是NhaA钠离子结合的重要残基，可以推断：
螺旋V的局部相互作用受到pH值和钠离子结合的调
控。pH增加，螺旋 V的局部作用有所增强，并激
活NhaA的钠离子结合活性；而钠离子结合则显著
增强了该局部相互作用，稳定了局部结构。
值得注意的是：并不是每次拉伸都得到相同的
图4　NhaA膜蛋白的力 -拉伸曲线
346 生命科学 第20卷
力 -拉伸曲线，各个拉伸峰只以一定概率出现。经
过统计，Müller教授研究组发现，钠离子存在下，
225aa峰的强度(峰值力，代表结构单元内部相互作
用强度，图6左)和出现概率都随pH值提高(图6右)，
其中pH等于6时结构单元内部相互作用强度已经达
到最大，此时 NhaA活性尚未完全激活；而 pH等
图5　不同pH值条件及钠离子浓度下NhaA的力 -拉伸曲线
于 8时，225aa峰的出现概率达到最大，表明此时
钠离子才较稳定地与NhaA结合。这些结果也支持
了前边的推断。
有趣的是，NhaA的激活与否，仅靠力 -拉伸
曲线就可判别(比较图 5A、C)，因此力 -拉伸曲线
可以看作是膜蛋白状态的“指纹”。
图 6　纳离子存在下，225aa峰的强度和出现概率与pH值关系
347第3期 Daniel MÜLLER：单分子层次上相互作用自动检测
Müller教授研究组研究抑制剂2-氨基萘嵌间二
氮杂苯(2-aminoperimidine，AP)与NhaA的作用[14]。
应用类似的方法，他们发现AP主要稳定NhaA螺旋
IX的局部相互作用；验证了AP是NhaA的竞争性
抑制剂，其结合方式与钠离子结合方式类似的结
果。同时，AP抑制状态的 NhaA力谱“指纹”可
以与NhaA激活或未激活状态很好地区分，验证了
这一技术的灵敏性。
膜蛋白与组成膜的磷脂分子及其他蛋白质相互
作用，从而稳定其在膜内特异的折叠结构，并实现
生物功能。由以上一系列试验可以看到，单分子力
谱实验所得到的力 -拉伸曲线能够完整、准确地反
映出膜蛋白内部的相互作用位置分布与强度，这些
信息用其他实验方法是难以得到的。
5　应用动态力谱研究膜蛋白结构单元的能量曲面
Müller教授研究组应用原子力显微镜进一步研究
了膜蛋白结构单元的折叠 /去折叠自由能曲面(free
energy landscape)，从中可以得到更基本的、相互
作用机制方面的信息。他们使用了动态力谱方法
(dynamic force spectroscopy)，即用不同的速率拉伸
膜蛋白结构单元，将不同速率下拉开结构单元所需
要的力(前述去折叠力)对拉伸速率的对数作图[14,15]。
如图 7 左侧所示，在最简单的两态模型假设
下，自由能曲面沿反应坐标方向的投影有两个极小
值区域，分别对应膜蛋白结构单元的折叠态(F)与去
折叠态(U)。图中的 xu是折叠态到中间态(两个极小
值区域间的极大值区域)的距离，ku0是未施加外力
时，结构单元自发去折叠的速率。根据Bell理论[17]，
施加外力时，如果取反应坐标平行于外力方向，则
外力能够使自由能曲面发生倾斜，从而降低反应能
垒，提高去折叠速率 ku0这时去折叠速率为外力的函
数，记为 ku(F)(如图 7右)。
对于单分子力谱所考虑的情况，Eva ns [18]指
出，拉开结构单元所需的力(去折叠力)与拉伸的速
率有关，拉伸速率越大，所需力越大，两者近似
满足如下关系：
0ln
uB
u B u
vxk Tf
x k Tk
⎛ ⎞= ⎜ ⎟⎝ ⎠
其中 f是去折叠力，v是拉伸速率，kB是波尔
兹曼常数，T 为绝对温度，其他符号如前。显而
易见，去折叠力与拉伸速率的对数成正比，反应到
动态力谱上为一条直线。对于更加复杂的能量曲
面，动态力谱将不再是一条直线。对于从折叠到去
折叠经过两个能垒的情况，动态力谱可能由两段不
同斜率的线段组成。
最近，Müller教授研究组利用动态力谱研究了
NhaA结合AP前后各结构单元自由能曲面的变化情
况[19]。他们发现：NhaA结合 AP前，所有的结构
单元去折叠都符合简单的两态模型；而NhaA结合
AP 后，大部分结构单元的自由能曲面未受影响，
只有螺旋 IX的自由能曲面由两态变为三态(如图 8
左)。结合 AP前，螺旋 IX的 xu和 ku0分别为 3.1±
0.3Å和1.1s-1。结合AP后，当拉伸速率小于1 000µm/s
时，xu和 ku0分别为 4.8±1.2Å和 8.9×10-5 s-1，即 IX
结构稳定性显著提高；而拉伸速率大于 1000µm/s
时，xu和 ku0分别为 1.2±0.2Å和 19s-1。螺旋 IX自由
能曲面的示意图如图 8右侧所示。Müller教授研究
组推断，配体AP的结合改变了螺旋 IX的自由能曲
面，使得该结构单元在自由能曲面上处于一个新
的、更深更窄的自由能谷内，从而需要更大的力才
图 7　反应坐标、自由能曲面与Bell速率理论示意
348 生命科学 第20卷
图8　NhaA结合AP前后各结构单元自由能曲面的变化
图 9　ForceRobot和CellHesion
能将螺旋 IX所处的结构单元拉开[19]。他们认为AP
的结合在动力学与热力学上都起到了稳定IX结构的
作用，这些细节有助于理解AP对NhaA的抑制机制。
6　新技术与展望
Müller教授进一步介绍了最新的力谱实验仪器。
他首先介绍了ForceRobot(图9左)——世界上第一台
全自动商业力谱仪。这种力谱仪整合了原子力显微
镜的各个部分，能够进行高精确度与灵敏度的测
量，在更换实验样品与悬臂方面做到了方便与无污
染。ForceRobot有一整套软件，可以自动记录、处
理数据，自动标定系统的各种参数。总之，它可
以减轻实验者的负担，使他们专著于研究本身。
Müller教授介绍的另一种仪器是CellHesion(图9
右)，该套系统可以用来测量细胞间以及细胞与其
底间的相互作用，即单细胞力谱(single-cell force
spectroscopy)。CellHesion整合了光显微镜与原子力
显微镜，可以选择单个细胞，并将其连接在悬臂
上，接着再与另一个细胞或者基底相接触以测量
力 -拉伸曲线[20,21]。测量可以在细胞能够生长的环境
下进行，测量结果可以反应单个分子对细胞间以及
细胞与基底间的相互作用的影响。这项技术区别于
系综实验，能够特异地研究细胞间相互作用，其用
途非常广泛。
349第3期 Daniel MÜLLER：单分子层次上相互作用自动检测
[参　考　文　献]
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“一类茚并吲哚酮类化合物、其制备方法和用途”获国家发明专利
由上海药物研究所完成的发明“一类茚并吲哚酮类化合物、其制备方法和用途”目前获得国家发明
专利授权(专利号 ZL200410053101.1)。
本发明涉及一类全新结构的茚并吲哚酮类化合物、该化合物的制备方法，以及该化合物作为一种新型
选择性雌激素受体调节剂在预防和治疗骨质疏松、乳腺癌等疾病药物中的应用。
内源性雌激素不但对女性性器官、乳腺及其其他性征的发育和保持有重要的作用，而且对人体其他组
织如骨骼、心血管系统、神经系统的生长发育和保持也十分重要。当女性绝经后，卵巢功能退化，卵
巢合成雌激素的能力下降或丧失会对女性生理产生一系列重要影响，因此雌激素水平的下降与骨质疏松、
心血管疾病、抑郁、乳腺癌、老年痴呆等绝经后综合征密切相关。临床上一般采用雌激素替代疗法(ERT)
或荷尔蒙替代疗法(HRT)来治疗绝经后综合征，但该方法在缓解这些症状的同时，增加了患子宫内膜癌和
乳腺癌的几率。本发明的目的就是寻找一种安全有效的具有选择性的雌激素受体调节剂。
摘自 http://www.sibs.ac.cn
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