全 文 ：第23卷 第5期
2011年5月
Vol. 23, No. 5
May, 2011
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2011)05-0497-06
阳离子脂质体运载基因的跨膜机制
丁会芹1,2，崔韶辉2，王　冰2，洪　洋1，张树彪2*
(1 中国医科大学基础医学院，沈阳 110001；2 大连民族学院生命科学学院，国家民委-教育部重点实验室，大连 116600)
摘　要：阳离子脂质体等非病毒载体以其制备简单、低毒性、低免疫原性、可生物降解等优点，成为近年
来基因转运中的常用载体。理解阳离子脂质体运载基因的机制对阳离子脂质体的研究具有重要意义。从跨
膜机制和信号调控的角度，介绍了脂质体 /DNA复合体以特定构象避免细胞外基质中核酸酶的降解，跨越
细胞膜进入细胞的过程；阐明了 DNA在信号调控的作用下，逃离溶酶体并安全释放的机制；讨论了基因
穿过核被膜进入到细胞核的方式，为进一步阐明阳离子脂质体运载基因的分子机制奠定基础。
关键词：基因转染；阳离子脂质体；相结构；内吞作用；信号调控
中图分类号：Q78 文献标志码：A
Transmembrane mechanism of cationic liposome-mediated gene delivery
DING Hui-Qin1,2, CUI Shao-Hui2, WANG Bing2, HONG Yang1, ZHANG Shu-Biao2*
(1 College of Basic Medical Science, China Medical University, Shenyang 110001, China; 2 Key Laboratory of State
Ethnic Affairs Commission - Ministry of Education, College of Life Sciences, Dalian Nationalities University, Dalian
116600, China)
Abstract: Nonviral vectors such as cationic lipids become general vehicles for gene transfer, because of their
favorable properties, including easy preparation, lack of immunogenicity, low toxicity, simple biodegradation, etc. It
is of great significance to understand the mechanism of cationic liposome-mediated gene delivery. This article
introduced the internalization process of the lipid/DNA complex from the aspects of transmembrane mechanism and
signal regulation. The way that DNA avoid being degraded by the nucleases, which present in the extracellular
matrix, and successfully escape from the lysosome in the cytoplasm, and finally, across the nuclear envelope was
also reviewed here. It is conducive to clarify the molecular mechanism of cationic liposome-mediated gene transfer
systematically.
Key words: gene transfection; cationic liposome; phase structure; endocytosis; signal control
收稿日期：2011-01-03； 修回日期：2011-02-25
基金项目：国家自然科学基金项目 ( 2 0 8 7 6 0 2 ,
21046008)；教育部新世纪优秀人才支持计划项目
(NCET-08-0654)；中央高校基本科研业务费专项资金
项目(DC10020103)
*通信作者：E-mail: zsb@dlnu.edu.cn; Tel/Fax: 86-0411-
87656141
近年来，基因转染技术在临床应用和生物学研
究领域都已经取得了很大的发展，临床应用主要侧
重于向病变的靶细胞中引进目的基因，达到治疗疾
病的目的。而生物学研究则在于检测表达蛋白的生
物学特性。DNA分子本身不能很好地完成内在化
过程。因此，这项技术的关键在于基因如何有效地
进入细胞。目前已经研发出了很多载体系统，包括
病毒载体和非病毒载体。尽管非病毒载体介导的转
染效率与病毒载体系统相比仍然不够理想，但是病
毒载体的安全性问题，如诱导免疫反应和感染等限
制了它的推广应用 [1]。
阳离子脂质体是最主要的非病毒载体之一，它
具有可自然降解、免疫原性低、可重复转染、易于
制备等优点。然而，由于细胞内外所存在的某些独
特的生物学障碍，例如血清中 DNA核酸酶的降解
生命科学 第23卷498
和吞噬细胞对部分 DNA的清除等 [2]，如果不了解
其作用机制，就很难获得思路上的突破，更不能保
证体内试验的成功和临床应用 [3] 。据此，本文阐述
了脂质体与质粒 DNA的结合、脂质体 /DNA复合
体穿越细胞膜的具体机制、信号调控在 DNA释放
过程中的作用以及目的基因最终进入细胞核的方
式，为更好地了解和克服转运过程的生物学障碍提
供参考。
1　复合体的形成及构象变化——跨膜前的准备
阳离子脂质体具有两亲性结构，在水溶液中散
开时，会自发地形成双分子层，也就是膜的核心结
构。根据阳离子脂质体成分以及环境因素，例如含
盐量、温度等影响，它由层状转变成非层状结构。
这种转变有利于脂质体和蛋白质之间动态的相互作
用，能够促进膜融合以及膜稳定性的改变，因此有
利于跨膜过程的发生。阳离子脂质体带正电荷，能
够随时与负电性的大分子核酸成分发生相互作用。
因此，当它们与质粒 DNA混合时，脂质体 /DNA
复合体——lipoplexes就会瞬间形成 [4]。
最初，Felgner和 Ringold 认为阳离子脂质体通
过静电作用与 DNA结合，并且这种作用不会改变
复合体的大小和形状。实际上 lipoplexes的形状和
大小与阳离子脂质体和 DNA的摩尔比有关，且存
在动态变化。当正负电荷比例接近于 1时，结构上
会发生明显变化 [5]。Gershon等在实验的基础上提
出阳离子脂质体可能有效地中和带负电荷的 DNA，
从而导致 DNA结构上的相应“塌陷”，“塌陷”的
DNA由于裸露的表面积变小，所以能被脂质体有
效地包住。Radler 等通过研究阳离子脂质体 DOPE/
DOTAP(1:1)与质粒 DNA的 X-衍射，证实了这种
包裹 DNA的方式 [5]。而 Behr 指出，DNA也可以
吸附在阳离子脂质体的表面，并得到了 Easman 等
的证实。因此，阳离子脂质体与 DNA的相互作用
事实上包括完全包裹以及表面结合两种方式。
lipoplexes的电荷、尺寸和形态结构对转染效
率具有重要影响 [6]。具有稍微过剩正电荷的
lipoplexes具有更高的转染效率 [7-8]。直径尺寸适中
(0.4~1.4 μm)的 lipoplexes比相对较小 (＜ 0.4 μm)
和更大 ( ＞ 1.4 μm) 的转染效率更高 [9-10]。而
lipoplexes的形态是由阳离子脂质体组分的性质决
定的。首先，阳离子脂质单体的结构，如包裹参数
可以影响所形成脂质体的形态。根据包裹参数的不
同，复合体可呈锥形、非反转六角形相位 (H
phase)、反转六角形相位 (HⅡ phase)等不同构型
[9]。
几个关于复合体的结构特性和相应转染效率的研究
显示，使用不同的阳离子脂质体进行试验，最终
HII结构的复合体大大促进了 DNA的释放，并且具
有较高的转染效率 [10-11]。其次，中性脂类 (例如
DOPE)可以作为修饰成分，降低脂质体表面的水合
态，促进复合体由层状结构向非层状结构转变 [9]，
而非层状结构恰好利于转染。另外，聚乙二醇等修
饰成分可屏蔽阳离子脂质体表面多余的正电荷，这
一方面可以抑制 lipoplexes的聚集；另一方面还可
以阻止复合体与带负电的血清蛋白相互作用 [12]，保
护复合体免受巨噬细胞清除。修饰成分影响了
DNA与复合体的结合，但是在相关生理条件下也
可以通过促进 HII相的形成，更改复合体的形态结
构。复合体形成以后，其特定的结构以及表面分子
就会与细胞表面相互作用，为跨膜提供条件，诱发
内在化过程。
2　lipoplexes穿越细胞膜进入细胞
一般来说，lipoplexes通过表面正电荷与细胞
表面带负电荷的蛋白多糖之间的静电作用，非特异
性地吸附于细胞膜表面 [13]，而含有靶向配体的
lipoplexes通过配体—受体相互作用，特异结合于
某类细胞表面 [14]。
通常，微粒体进入细胞的途径主要有两种：内
吞作用和膜融合。Resina等 [4]用具有不同净电荷的
lipoplexes研究了不同摄取路径的作用。内吞作用
是复合体进入细胞的主要方式，主要转运平均直径
小于 500 nm的粒子 [15-16]。温度依赖性 [17](温度低
于 15 ℃时内吞作用能够被有效地抑制 )、内吞抑制
剂的应用 [18-19](尽管其具有一定的毒副作用 )，以及
更可靠的内吞区域特异性标记物的共定位实验 [20]
等也证明了这一点。真核细胞中存在着多种内吞途
径，而在不同细胞的转染中普遍发现了网格蛋白依
赖性以及小窝蛋白介导的内吞途径。
2.1　网格蛋白介导的内吞作用
复合体跨越细胞膜的过程并不像人们通常观察
到的单分子配体的瞬间内吞作用一样，而是还需要
有其他过程的参与 (图 1) ，例如驱动受体在复合体
及其表面聚集体的影响下发生聚集，进入特殊的网
格蛋白区域或者小窝中，继而偶联其他多肽发生质
膜凹陷，形成有被小泡外衣，最终在 G蛋白的作
用下脱离细胞膜，或者在膜褶皱区域直接通过吞噬
颗粒而完成内吞作用 [21]。而相对大尺寸复合体
丁会芹，等：阳离子脂质体运载基因的跨膜机制第5期 499
(700~800 nm)的内在化更需要考虑这些过程，甚至
可能涉及对现有机制的适当调整和扩展，例如几个
微小区域的合并等。Zuhorn等 [22]在对动物细胞的
转染实验中证明了这一点。从这个角度讲，很明显
网格蛋白介导的路径更适合 150~200 nm的复合体
或者小尺寸的聚合物 [23]，考虑到常规的网格蛋白尺
寸 (通常 100 nm)的限制，可能也需要网格蛋白支
架具有更大的刚性。
2.2　小窝蛋白介导的内吞作用
内吞作用的另一种方式是由小窝蛋白介导完成
的，van der Aa等 [24]用抑制剂的方法证明了小窝蛋
白在 lipoplexes运载基因传递中的作用。形态研究
显示，小窝中富含 GPI-锚定蛋白和小窝蛋白，并
且某些与 G蛋白偶联的受体，如M乙酰胆碱受体、
胰岛素受体、IP3受体以及腺苷酸环化酶等都存在
于小窝区域 [25]。经小窝蛋白的跨膜传递是一个触发
过程，在这个过程中，阳离子 lipoplexes能够与脂
筏组件相互作用 [26]，即在脂膜上横向移动，通过膜
上的 GPI-锚定蛋白进入微区，由于 GPI-锚定蛋白
的 2条脂酰链插入到膜脂双层的外层中，小窝蛋白
既能识别相应的 GPI-锚定蛋白并与之相互作用，
同时又能与 G蛋白受体酪氨酸激酶相互作用，最终
诱发内吞作用的顺利进行。尽管小窝蛋白通常在细
胞表面以直径 50~100 nm穴样内陷的形式出现，平
坦的小窝区域仍可优先作为有效区域完成这种内在
化过程 [27]。最近提出的在脂膜侧位上存在的横向扩
散和特异硫酸肝素糖蛋白 (HSPG)的聚集 [28]，即为这
种机制的一种展示。较大的复合体穿越细胞膜的过
程可以通过几个这种区域的聚集完成，这同目前细
菌和病毒进入细胞时所显示的路径是不一样的 [29]。
2.3　膜融合作用
膜融合作用是真核细胞跨膜运输过程中的另一
个重要方式 (图 2)。内吞途径是一个能量依赖过程，
需要消耗能量，而 4℃是一个低能量的条件，此时
细胞处于“休眠”状态，因此，通过内吞途径进入
细胞的方式会受到显著抑制，但对融合途径影响甚
微 [30-31]。Resina等 [4]用包含 5-异硫氰酸荧光素标
记 ON705的 lipoplexes处理 Hela pLuc/705细胞，并
培养于 4℃下，3~6 h 后荧光显微镜下仍然能检测到
荧光的存在，证明了膜融合在 lipoplexes内在化过
程中的作用。正常情况下，细胞膜不能自发地融合，
而是受某种因素如 Ca2+、渗透压、聚乙二醇等的控
制，或者有某种膜融合蛋白参与催化。现在已鉴定
出多种膜融合所需要的胞质蛋白，但其作用机制尚
不清晰。Hu等 [32]研究表明，有两种膜融合蛋白参
与介导的融合过程较清楚：一种是 N-乙基顺丁烯
二酰亚胺 -敏感融合蛋白 (NSF)，为一种 ATP酶；
另一种是可溶性 NSF连接蛋白 SNAPs，在囊泡停
泊位点，SNAPs 识别并结合囊泡膜上的受体
v-SNARE和靶膜上的受体 t-SNARE，启动融合复
合物的组装，膜融合复合物催化囊泡与靶膜的融合，
但这是否同样适用于阳离子脂质体介导的基因转运
过程还需要进一步验证。
为了进一步弄清内在化机制，仍需要考虑阳离
子脂质体自身的电荷能够导致内陷的程度，例如，
对脂膜的曲率（一个明显能够促进内在化作用的参
数）以及其中胆固醇含量的调节，使其具有不同的
稳定性 [33]。另外在某种程度上，细胞本身的特异性
也会影响复合体在细胞表面的内在化效率。在内在
化过程的最初阶段，与复合体优化的目标属性和
图1 lipoplexes通过内吞作用进入细胞的过程
图2 膜融合示意图
生命科学 第23卷500
(或 )给定细胞类型的细胞属性具有明显的相关性。
事实上，研究者已经初步确定了基因转染在细胞类
型方面的特异性，这包括细胞周期和细胞分裂次数，
也有人认为还应该包括内吞作用的能力 [34]。然而，
无论通过哪种通道完成内在化过程，复合体进入细
胞后都面临着 DNA释放以及避免被溶酶体降解的
难题，这可能需要某些信号的调节作用。
3　DNA释放过程中的信号调控
外界物质经内吞作用进入细胞后，形成内涵体，
然后与溶酶体融合，经初级溶酶体、次级溶酶体、
残余小体，最终被分解并排出体外 [35]。lipoplexes
进入细胞内后，面临着同样的命运。要使转染顺利
进行，DNA必须在内吞作用发生后的早期被释放，
并逃离溶酶体，否则 DNA将被溶酶体降解。利用
一些辅助成分诸如多聚物、多肽等，通过去垢剂类
似作用机制或渗透作用使溶酶体破裂，可显著提高
脂质体转染效率 [36]。这说明逃离溶酶体是脂质体转
染中的关键步骤。
lipoplexes的结构形式在 DNA逃离溶酶体的过
程中起重要作用。Koltover等 [37]利用聚阴离子囊泡
模拟溶酶体膜系统，在体外与 lipoplexes相互作用。
最终发现层状结构的 lipoplexes与聚阴离子囊泡可
稳定共存；而反六角相结构 (HⅡ )的 lipoplexes与
聚阴离子囊泡接触后立即发生膜融合，并且在聚阴
离子囊泡内部可观察到游离 DNA[36]。由此推断：
反六角相结构是将 DNA从 lipoplexes中释放并逃离
溶酶体的最有效的结构形式。这种结构利于复合体
中脂质成分与溶酶体膜整合，从而使溶酶体膜去稳
定，在溶酶体表面形成临时孔洞，为 DNA逃离溶
酶体创造条件，而且溶酶体膜上的磷脂酰乙醇胺
(PE)、磷脂酰丝氨酸 (PS)等都带有阴性基团，可通
过静电吸附作用与阳离子脂质体相互吸引，这就削
弱了阳离子脂质与 DNA的结合，使 DNA能够从
复合体中释放出来。这在一个更直接的实验中同样
得到证明，当培养于含有 PS的囊泡中时，只有复
合体呈现 HⅡ结构时，质粒 DNA才会从 lipoplexes
中释放，而层状结构明显不利于 DNA的释放 [36]。
复合体的组分以及细胞内的某些蛋白酶能够
作为信号分子调节 DNA的释放过程。Oishi等 [38]
设计了一个共轭肽聚合物 (CPCCtat)，作为一种新
的基因载体，它能够通过影响细胞内凋亡蛋白
酶 -3(caspase-3)信号而控制基因表达。这种载体由
一个不带电的聚合物主链和一个阳离子肽侧链构
成，其中包括 caspase-3的板基序列和 HIV-1 Tat的
蛋白转导域序列。CPCCtat与 DNA通过静电作用
形成了一个紧密的复杂结构，并且在这种状态下，
基因表达被完全抑制。相反，当有 caspase-3存在
的时候，复合物由于阳离子部分的分解而从
CPCCtat中降解，这导致了基因表达的激活。然而，
在脂质体介导的转运过程中，相应蛋白酶是否也具
有同样调节机制还有待进一步证明。
两种新型信号调控系统，即环磷酸腺苷 (cAMP)
依赖蛋白激酶 (PKA)[39]和 caspase-3[40]信号反应系
统。这些系统使用新合成的阳离子聚合物 PAK和
PAC。PAK包含 PKA中所含的肽基 ARRASLG作
为 PKA信号的受体，而 PAC中包含 caspase-3的基
板序列 DEVD。PAK或者 PAC与 DNA形成稳定的
聚合体，从而完全抑制该基因的表达。然而，当把
活性 PKA加入到混合物中时，原始 DNA条带就会
完全恢复。在 PAC-DNA混合物中，活性 caspase-3
的增加也表现出恢复原始 DNA条带的性质。这些
结果清楚地表明，PKA信号和 caspase-3信号可以
逐个调节脂质体 /DNA复合体以释放 DNA。
DNA从 lipoplexes中释放并逃离溶酶体宣告了
脂质体转染过程的结束。此后，DNA必须依靠自
身的力量进入细胞核并表达。
4　DNA穿越核膜进入细胞核
核膜是有效转染的至关重要的障碍，它含有受
高度控制的运输结构——核孔复合体。因为核孔的
有效直径比较狭窄，只有 80~120 nm。因此，质粒
DNA向细胞核中的移动受到很大限制 [41]。对于阳离
子脂质体结构的研究证明，DNA移动到细胞核的效
率可以通过阳离子脂质体结合核蛋白来增强 [41]。核
蛋白具有独特的性质，它们具有细胞核定位信号，
研究证明附着在核酸上的核定位信号能够提高转
染效率 [17,20]。
DNA进入细胞核的一个主要机制是依赖于有
丝分裂被动入核，在细胞分裂过程中，当核膜消失
时，DNA借机被动进入细胞核。这种机制依赖于
DNA本身的序列，可以由有丝分裂时细胞核更容
易摄取外源 DNA而证明 [42]。另一种机制是主动运
输 DNA穿过核孔，这需要加入携带有核定位信号
的修饰成分协助完成。在非有丝分裂的细胞中，
DNA主要通过第二种途径进入细胞核。对神经元
细胞的有效转染证明了这种途径的可行性。然而，
尺寸比核孔大的质粒 DNA是如何穿过核孔的还不
丁会芹，等：阳离子脂质体运载基因的跨膜机制第5期 501
清楚 [42]。进入细胞核的 DNA随着细胞自身染色体
的复制而复制，最终完成转录翻译过程，调控目的
蛋白的表达。
5　展望
过去的 10年中，在阐述脂质体介导基因转染
的细胞路径和机制方面取得了重大进展，但是涉及
整体转染过程的详细机制迄今还没有系统报道，其
中一些步骤的分子机制仍需要进一步阐明。例如，
仍然不清楚复合体与质膜结合的启动因子是什么，
复合体中存在的导致包被小窝内陷的信号分子是什
么，以及在内涵体逃逸这一步中，信号调控 DNA
释放的具体机制和之后内涵体的去向等。尽管有人
提出最终脂质体会被分解，但是能够支持这种假设
的证据非常有限。复合体跨越细胞膜的调节机制是
一个重要的限速步骤，如果能从信号调控的角度，
详细阐明其中涉及的信号分子以及具体作用机制，
将有利于更深入地了解基因转染。由此很可能会发
现新的内吞机制。另外，核传递作为基因转染的重
要阶段，其中涉及的核定位信号尚不明确，这些都
将是以后的研究重点。
[参　考　文　献]
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