全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 1期
2008年 2月
Vol. 20, No. 1
Feb., 2008
文章编号 ：1004-0374(2008)01-0001-02
收稿日期：2007-11-27；修回日期：2007-12-24
基金项目：国家自然科学基金重大项目(30291705); 教
育部长江学者创新团队研究基金(IRT0528)
*通讯作者：E-mail: yzchen0928@yahoo.com
近年细胞单分子研究的重要进展
陈宜张
(第二军医大学神经科学研究所，上海 200433)
1　为什么要做单分子研究
为什么要做单分子研究呢？这是因为，迄今为
止有关细胞内化学变化的研究，绝大多数都是集团
(系综)平均的结果，这就不可避免地要把处于不同
能级状态的分子活动平均起来，因此显示不出个别
分子活动的状态。开展单分子研究的目的就是要研
究和发现个别分子的活动特征，以便更深入地揭示
生命活动中分子活动的过程和本质，而这是以前集
团平均研究所不可能提供的。
2　单分子研究的重要进展
单分子研究，如果从 1999年在法国召开的学
术讨论会[1]和著名的科学杂志 Science发表集中的综
述性文章[2]之后算起，到今已经 8 年了。8 年来，
特别是最近 5年来，单分子研究有了明显的进展。
主要表现在以下几个方面。
2.1　活细胞单分子成像研究方面　由于技术的改
进，如采用全内反射(TIRF)、荧光共振能量转移
(FRET)、原子力显微镜技术(AFM)等方法研究了
活细胞表面的单分子活动，取得了许多新结果。
从最近的细菌研究看到，转录因子 Lac 阻遏蛋白
与 DNA有非特异结合，有沿 DNA分子的一维移
动，它在 Lac 操纵基因上移动时，有 90% 的时
间处于非特异结合状态 [3 ]。
2.2　结合活细胞重要生命活动的离体单分子研究　
该研究已经揭示出单分子活动的独特特点，即显示
了以往用集团平均所不能看到的新现象。如肌球蛋
白的作用是携带一个被运输的“货物”在细胞骨架
上移动，当肌球蛋白两个头中的一个脱离细胞骨架
往前迈进时，它有明显的 Brown运动，这是以前
所没有报道的[4]。
酶学研究的进展非常明显，牵涉到酶分子活动
的基本规律。在集团研究中，酶活动的过程如下：
众所周知，Michaelis-Menten方程表征了酶活
动的速率，它的表述是：
公式(2)中[S]是底物的浓度，Km为Michaelis常数。
在单个酶分子条件下，单分子 M i c h a e l i s -
Menten方程为：
式中<τ>是等待时间(waiting time) τ的平均值,
即 ：
从(2)与(3)的比较可知，单个酶分子条件下的
1/<τ>与酶集团作用中的速度相关，即 1/<τ>=v/[E]T，
这就是两者的相关性。单个 β - 半乳糖苷酶( β -
galactosidase)分子研究的分析表明，单分子 β-半乳
糖苷酶活性符合于Michaelis-Menten方程，即<τ>对
1/[S]的关系与1/V0对1/[S]的的关系完全一致(见文献
5的图 2，b、c)。但是单分子研究还发现了众多构
象异构体(conformer)活动存在的特点，还看到单个
酶分子活性的记忆现象，所谓记忆现象，指的是如
果前一个反应的时间是短的，则相继而来的反应，
其时间也往往是短的，反之亦然。记忆现象被认为
是由于不同构象异构体之间的缓慢相互转换所造成
的，这是以往集团平均研究所未能看到的新发现[5]。
2.3　远场光学显微镜技术有重大进展，其中 STED
荧光显微技术的发明是一个特殊的例子。
早在 1873年，Abbe发现了一个规律，现在几
乎被认是一个定律了。这个规律认为，根据透镜原
· 专题：单分子成像 ·
2 生命科学 第 20卷
理制造的光学显微镜，其分辨能力不可能超过光波波
长的一半，这个限制被称为“衍射屏障 (diffraction
barrier) ”。我们知道，即使有了高分辨的电子显
微镜及其他各种仪器问世，在生命科学研究中，光
学显微镜仍然是最常用的工具，在活细胞单分子研
究方面也不例外。这是由于细胞是光学上透明的，
光学显微镜可以独特地提供细胞内部非侵入性的三
维成像。此外，只要通过荧光标记，用这种方法
还可以检测特定的细胞内含物，如蛋白、核酸等。
所以直到现在，基于透镜的显微镜，对于细胞水平
的研究，仍然是最理想的选择。但是，我们如果
能够把它的分辨能力提高到小于四分之一微米，也
就是小于光波波长的一半，那就会更好。多少年
来，远场光学显微镜技术也有许多改进，共聚焦显
微镜就是最著名的例子，但仍无法超越Abbe定律。
近两年来浮出科学杂志表面的一项荧光显微技
术越过了“衍射屏障”，这个技术就是受激发射损
耗术(stimulated emission depletion, STED)。这种改
进的原理从根本上不同于远场超分辨所采取的策
略，如共聚焦显微镜。在荧光显微术条件下，即
使不用近场而用远场(即传播的光线)，即使是用一
般透镜，只要人们设法改变荧光标记物的分子状
态，所谓的“衍射屏障”可以被逾越。应用这个
新方法可以得到一个低于“衍射屏障”的分辨，理
论上它是一个无衍射限制的分辨。STED 的理论
1994年就提出来了，经过十多年的改进与进步，现
在己逐步成熟了[6,7]。STED技术可能也有缺点，如
高强度激光可能对组织有损伤[8]。
除了 STED方法，也还有一些其他技术正在发
展，如 基于随机光学重建显微术(stochastic optical
reconstruction microscopy ，STORM)的亚衍射极限
成像就是其中之一[6,8]。
3　我国的单分子研究
最近四五年来，我国在国家科技部和国家自然
科学基金委员会的资助下有几个实验室开展了以单
分子为目标的实验研究，也取得了一点进展，例如
黏附分子Mac1 的研究[9]等。然而，与国际上这几
年的进展相比，我国的研究还不是很理想，原因可
能很多，但是我个人认为，发现、募集和支持真
正对单分子研究，不论是离体或活细胞的单分子研
究有兴趣的科学家，是一个最关键的问题——因为
单分子研究有困难，因此有许多技术的问题有待克
服与创造，这就更需要艰苦的工作。
2002年当单分子研究作为一个“973”前沿研
究项目立项，在答辩时我曾经提出，有两件事需要
特别加以重视：第一是技术方法要有改进、提高与
创新；第二是力图在细胞生物学的基本问题上有新
的看法与发现。
单分子研究是一个新生的科学研究领域，很多
方法还不够完善。例如，在研究细胞表面的单分子
时，我们虽已有一些可供使用的研究手段，如全内
反射，但是在研究细胞深部时则缺少办法；又如人
们往往用荧光标记物来标记蛋白或核酸，但现在所
用的标记物，如荧光蛋白(FP)，其本身的分子量就
很大，有其固有弱点，所以，发展特异性的小分
子标记物非常重要。今天看来，虽然在荧光显微术
方面有了长足的进展，我们可以在新的技术水平上
向前迈进，但上述两个问题依然存在，有待解决。
至于细胞生物学的基本问题，今天我们欣喜地
看到，在酶学研究方面已有很好的开始。但细胞生
物学的基本问题很多，例如受体与配基相互作用，
就是一个很重要的方面，我们已有好的开始，应该
奋起直追。
写到这里，除了重申这两个想法之外，还感
觉到今后的单分子研究可能会更多地涉及到大分子
的化学、物理学的理论基础。设想一下，如果一
个蛋白分子的直径是 0.1－ 1纳米量级的，它本身
又有一定的位移运动，当你测定两个分子的相互作
用时，要不要考虑大分子的尺度呢？作用是发生在
分子的一侧，还是在它的中心呢？
[参 考 文 献]
[1] Single molecule biophysics [EB/OL]. ( An EMBO workshop)
tours, France, 1999, July 8-15. (WWW. lps.fr/Vincent/smb)
[2] Uppenbrink J, Clery D. Single molecules. Science, 1999,
283: 1667
[3] Elf J, Li GW, Xie S. Probing transcription factor dynamics
at the single-molecule level in a living cell. Science, 2007,
316: 1191-4
[4] Shiroguchi K, Kinosita Jr. K. Myosin V walks by lever
action and Brownian motion. Science, 2007,316: 1208-12
[5] English BP, Min W, van Oijen AM, et al. Ever-fluctuating
single enzyme molecules: Michaelis-Menten equation
revisited. Nat Chem Biol, 2006, 2: 87-94
[6] Hell SW. Far-field optical nanoscopy. Science, 2007,316:
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[7] Hell SW. Toward fluorescence nanoscopy. Nat Biotechnol,
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[8] Rust MJ, Bates M, Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging
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Methods, 2006, 3: 793-5
[9] Yang YH, Yu J, Fu PG, et al. Interaction between single
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