全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 1期
2008年 2月
Vol. 20, No. 1
Feb., 2008
文章编号 ：1004-0374(2008)01-0053-05
收稿日期：2007-10-29；修回日期：2007-12-19
基金项目：国家自然科学基金(30490172); “973”项
目(2007CB935600)
*通讯作者：E-mail: zhangyy@bjmu.edu.cn
G蛋白偶联受体激活的单分子研究进展
刘　飞，张幼怡*
(北京大学第三医院血管医学研究所 教育部分子心血管学重点实验室，北京 100083)
摘　要：G蛋白偶联受体是体内最大的受体超家族，它们参与调节生物体内多种生理功能与病理过程。
G蛋白偶联受体的分子内构象变化与G蛋白的偶联以及受体的二聚化等是G蛋白偶联受体激活的重要基本
过程。借助于单分子研究手段，在 G 蛋白偶联受体激活方面取得了重要进展。本文将就这些方面进行
简要的综述。
关键词：G 蛋白偶联受体；单分子；G 蛋白；构象；二聚化
中图分类号：Q -3 3；Q 50 3　　文献标识码：A
Progress of single-molecule detection of G protein-coupled
receptor activation
LIU Fei, ZHANG You-yi*
(Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, and Key Laboratory of Molecular Cardiovascular
Science, Ministry of Education, Beijing 100083, China)
Abstract: G protein-coupled receptors (GPCRs) which constitute the largest superfamily of receptors in human
genome, regulate a variety of physiological functions and pathological processes. The changes of intramolecu-
lar conformation of GPCRs, their coupling to G-protein and receptor dimerization represent the basic respects in
GPCRs activation. Benefited from the improvement of single-molecule detection techniques, significant progresses
are achieved in the studies of this field, which will be briefly reviewed here.
Key words: GPCRs; single-molecule; G-protein; conformation; dimerization
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,
GPCRs)是一个受体大类，属于国际药理学联合会
受体命名和分类委员会(NC-IUPHAR)建议的第二类
受体[1]。在各类受体中，G蛋白偶联受体是成员最
多的一类，目前已有 2000多种 G蛋白偶联受体得
到确认，这也构成了人体最大的蛋白质超家族。多
种激素、神经递质、离子、光、药物和其他理化
因素等通过G蛋白偶联受体将刺激通过G蛋白传导
到细胞内，再以 G 蛋白解离亚基作为传导物，活
化相应酶和离子通道，产生重要的一系列信号传
递，从而引起胞内相应的生物反应。GPCRs是一
大类具有重要生理功能的受体，它与许多疾病的病
理生理过程有着密切的联系。
受体分子内的构象变化、与G蛋白的偶联以及
受体的二聚化参与了G蛋白偶联受体的活化过程，
这些方面的研究为揭示G蛋白偶联受体的激活机制
提供了依据。传统的药理学及功能研究仅仅是对在
一定时间内众多分子的综合行为和效应的阐释，因
而无法为受体分子激活的具体过程提供直接实验证
据。近年来，由于物理学、化学、生物学、信
息学和工程技术的不断发展以及各个学科之间的相
互交叉合作，对活细胞内单个生物分子动态行为的
研究成为了可能。借助于单分子手段，G蛋白偶联
受体激活的相关过程逐渐得到阐明。当然，在活细
5 4 生命科学 第 20卷
胞内检测单个分子的动态行为具有相当的难度，这
条道路上充满了挑战与希望，本文试图从多个角度
来说明单分子检测在受体激活方面取得的进展，或
许有些内容并不属于严格意义上的单个分子研究，
但多学科、多方法的融合和发展是单分子研究的必
然趋势，我们希望大家从中能得到有益的启示。
1　G蛋白偶联受体激活后自身构象的变化
G蛋白偶联受体是一条单一的多肽链，包含一
段胞外氨基末端(N端)、七个 α螺旋形成的跨膜结
构域和一个胞内的羧基末端(C端)。配基与受体结
合后，将信号传递给与受体偶联的 G 蛋白，导致
下游信号的产生。受体与配基结合后发生的构象变
化决定了下游信号的特异性。药物刺激可以引起受
体的完全激动、部分激动或基础活性的降低。多项
实验证明，受体在激动剂刺激下的激活就是受体构
象改变的过程——由静息状态的构象转变为活化状
态的构象，并导致下游的信号[2-6]。Greasley等[7]通
过基因突变和计算机模型分析 α1b肾上腺素受体，
推测G蛋白偶联受体激活会导致受体的第三个胞内
环和 C末端之间的距离增大。目前利用单分子技术
检测G蛋白偶联受体激活后构象变化主要集中在第
三个胞内环和 C末端之间的空间距离变化上。
Vilardaga等[8]利用FRET(荧光共振能量转移)技
术来观察配基结合后G蛋白偶联受体第三个胞内环
和 C末端之间的距离变化。他们在 α2A肾上腺素受
体(α2AAR)的第三个胞内环上插入一个YFP(黄色荧
光蛋白)，在 C末端连上一个 CFP(青色荧光蛋白)，
将这样的重组受体蛋白转入HEK293细胞后，通过
不同药物刺激下 FRET信号的改变来判断受体与药
物结合后构象所发生的变化。结果显示，肾上腺素
受体激动剂去甲肾上腺素刺激受体后，FRET信号
迅速降低，反向激动剂育亨宾刺激后 FRET信号增
加。在不同的反向激动剂都观察到同样的现象。这
种 FRET信号的差异提示育亨宾等反向激动剂刺激
后受体所发生的构象变化不同于激动剂刺激后的变
化。如果先加入去甲肾上腺素再加入育亨宾，降低
的 FRET信号被逆转，最后的信号与单独育亨宾刺
激时一致。这与拮抗剂酚妥拉明刺激后的情况不
同，先加入去甲肾上腺素再加入酚妥拉明，降低的
FRET信号回复到基础值，但是观察不到信号的增
强。这就证明了反向激动剂和中性拮抗剂作用于受
体的机制不同，中性拮抗剂通过与激动剂竞争结合
位点抑制激动剂的活性，本身并不改变受体的构
象，而反向激动剂除了能竞争性抑制激动剂的活性
外，还能引起受体构象的重排。根据荧光团(CFP
和YFP)的位置和 FRET信号的变化，可以推测出，
激动剂刺激后 FRET信号的降低反映了受体第三个
胞内环和 C末端之间空间距离的增加，而反向激动
剂刺激后FRET信号的增强反映了第三个胞内环和C
末端之间在空间距离上的靠近。
为了避免GFP等大标签荧光蛋白对受体本身构
象的影响，研究者近来发现了一种利用小分子肽段
结合CFP标记受体蛋白的方法进行FRET检测(基于
FlAsh的 FRET)。这种小分子肽段的基础序列为
“CCPGCC”(可以根据需要进行修饰)，它可以特
异性的结合一种双砷化合物染料(FlAsh或ReAsh)产
生绿色或红色荧光。Hoffmann等[9]利用 FlAsh/CFP
系统和 CFP/YFP系统研究活细胞内 α2A腺苷受体构
象变化时发现，在 α 2A 受体的第三个胞内环插入
YFP虽然不影响FlAsh的检测但是会抑制腺苷酸环化
酶的活性，而这种小标签对蛋白活性影响小，既不
影响 FRET的检测也不影响受体下游信号分子腺苷
酸环化酶的活性，而且 FRET信号强度要强于CFP/
YFP的FRET信号 5倍以上。通过对单细胞内FRET
信号的动力学分析，得到 FRET信号速率常数(kobs)
的最大值为 15－ 20/s，提示激动剂刺激后受体激活
所需要的时间为 50－ 70ms。
Nakanishi等[10]利用这种基于 FlAsh的 FRET技
术研究活细胞内β2肾上腺素受体在激动剂和反向激
动剂作用下的构象变化，得到了和 α2A肾上腺素受
体类似的结果。并且发现，当在 β 2肾上腺素受体
第三细胞内环的不同部位——N段(靠近N端)、中
段、C 段 ( 靠近 C 端 ) 标记小分子肽段序列
“CCPG CC”时，仅在 C 段标记时得到了较高的
FRET效率(＞ 40%)，在其他部分标记时 FRET效率
较低(＜ 30%)，提示在 β2肾上腺素受体，其第三个
胞内环的 C段在空间距离上更靠近受体的 C末端。
此研究也为我们在活细胞内推测受体胞内环的空间
位置提供了依据。
2　G蛋白偶联受体激活时G蛋白的检测
越来越多的研究表明，G蛋白偶联受体可以与
很多蛋白发生直接相互作用，但与G蛋白 αβγ三聚
体的偶联仍然是这个家族成员的共同标志。G蛋白
是最重要也是最早期的胞膜信号传感器，它将胞外
的信号通过活化的受体转移到胞内。对G蛋白活化
的了解有助于我们进一步认识GPCR的激活。目前
5 5第 1期 刘　飞，等：G 蛋白偶联受体激活的单分子研究进展
认为激动剂能使受体转变为或稳定在特殊的构象状
态，以利于 G 蛋白 αβγ三聚体与受体的结合。随
之，G蛋白三聚体的构象发生变化，GTP取代GDP
结合在 α亚单位上，α亚单位和 βγ亚单位与受体解
离，成为活性状态的 α亚单位和游离的 βγ亚单位，
它们均能与下游的效应分子发生相互作用产生效
应。α亚单位催化 GTP水解，之后无活性的 α亚
单位与 βγ亚单位重新形成 G蛋白三聚体。
基于这样的活化 -失活循环模式，Gales等[11]利
用生物荧光共振能量转移(BRET)技术，研究了G蛋
白和受体之间实时动态的相互作用。他们在β2肾上
腺素受体的 C末端连上一个 Rluc(Rennila reniformis
luciferase，海肾荧光素酶)，在 G蛋白 α s、β 1和
γ2亚单位分别接上GFP10(绿色荧光蛋白的一种变异
体)，在HEK293细胞中分别检测激动剂异丙肾上腺
素刺激下的BRET信号，发现共同表达β2AR-Rluc和
GFP10-β1(或GFP10-γ2)时，BRET信号较之基础值
有明显增加(分别增加了 36%和 15%)，但在共表达
β2AR-Rluc和GFP10-αs时未发现这种变化。提示激
活后 β1和 γ2亚单位与受体在空间距离上更为靠近。
如果共表达未标记的Gαs、Gαi2、Gαq和Gα11，仅
有 Gαs和 Gαi2能增加 β 2AR-Rluc和 GFP10-β 1(或
GFP10-γ2)之间的 BRET信号，这也与以前实验报道
的不同Gα亚单位对 β2AR的选择性相吻合：Gαs＞
Gαi2＞＞ Gαq=Gα11[12]。另外，以前研究发现，如
果将 β2AR的 79位Asp突变为Asn(D79N)，会阻断
β2AR介导的腺苷酸环化酶激活，但不影响受体与激
动剂的结合[13]，Gales等[11]将这种突变体加入到他
们的实验中来，发现受体与G蛋白 β1、γ2亚单位之
间的 BRET信号完全受到抑制，说明此实验中的
BRET信号真实反映了G蛋白激活时的构象变化。同
时，D79N突变体降低了 BRET信号的基础值，提
示受体与G蛋白之间可能存在“预偶联”状态(pre-
coupled state)。
3　G蛋白偶联受体激活与二聚化
越来越多的实验结果表明，G蛋白偶联受体的
寡聚化，特别是二聚化，在受体的激活过程中可能
起着重要的作用。人们早已认识到，许多细胞膜表
面受体，如 EGF(表皮生长因子)、PDGF(血小板衍
化生长因子)和 IgE(免疫球蛋白E)受体等，或以寡聚
体的形式自然存在，或与配基结合后形成多聚体。
通常认为这些受体的二聚化对于与激动剂高亲和力
结合以及信号转导是非常必需的。人们已通过交联
实验和Western Blot实验等证实受体存在二聚体或多
聚体，但是尚缺乏在这方面的直接实验证据，而单
分子检测技术为这方面的研究提供了有利条件。
Sako等[14]构建了 Cy3和Cy5标记的 EGF分子，
利用单分子FRET技术来检测EGFR二聚体的形成。
首先，用标记了 Cy3的抗 EGFR单克隆抗体(Cy3-
EGFR1，一个 EGFR1可能与多个 Cy3结合)作为对
照，考察了Cy3数目和EGFR1数目的泊松分布，并
对荧光密度进行高斯拟合，发现Cy3-EGF刺激后的
荧光密度频数分布中，第一组分和第二组分的平均
值与Cy3-EGFR1组第一组分和第二组分的平均值一
致，从而说明这两个组分分别包含的是一个和两个
Cy3-EGFR分子，达到了进行单分子实时检测的目
的。其次，对 EGFR的二聚化进行了单分子检测，
加入 Cy3-EGF 40－ 60s后，包含两个 Cy3-EGF分
子的组分频数增加，而包含一个Cy3-EGF分子的组
分频数减少，提示 EGFR二聚化的形成并且其发生
在加入 Cy3-EGF 1min后 Ca2+信号增加之前，这与
EGFR信号转导发生在二聚化之后的理论相符。本
实验也提示在EGF刺激之前已经有EGFR二聚体的形
成，同时研究者认为 FRET效率的波动在一定程度
上反映出EGFR二聚体构象的多样性。Blakely等[15]
构建了EGFR-β-gal chimeric proteins(表皮生长因子 -
β半乳糖苷酶奇构蛋白)，利用 β半乳糖苷酶的活性
来反映EGF刺激后EGFR的二聚化，结合流式细胞
技术(FACS)发现 EGF刺激 15s后即可检测到 EGFR
的二聚化。Angers等[16]利用BRET技术观察 β2肾上
腺素受体的二聚化，发现激动剂异丙肾上腺素刺激
20s后可以看到BRET信号的增加。这些实验都为研
究GPCR激活和二聚化的关系提供了依据。
4　G蛋白偶联受体激活后受体运动的轨迹分析
G蛋白偶联受体的转运近年来在受体研究中是
一个热门话题，尤其是受体的内化、胞内运输、降
解和再循环的过程在受体的活性调节中发挥重要意
义。传统的药理学及功能研究对受体在细胞内的定
位进行过探讨，但未能揭示活细胞内的G蛋白偶联
受体在分子水平的实时动态行为，无法在原位和活
体上观测生物分子的行为，而单分子研究具有时间
分辨、空间分辨和高灵敏的特点，为研究 G 蛋白
偶联受体的转运提供了有利条件。
Liang等[17]在活细胞(稳定表达α1A肾上腺素受体
的HEK293细胞株)内实时直观检测了在激动剂苯肾
上腺素(PE)作用下 α1A肾上腺素受体(α1A-AR)的运
5 6 生命科学 第 20卷
动。利用宽场落射荧光显微镜将 Cy3-IgG 标记的
α1A-AR的运动实时记录下来，荧光亮点经Gaussian
定位后重建轨迹，结果显示随 PE作用时间延长(10
min为时间段持续观察60 min) α1A-AR运动速率分布
出现变化。在 20 min时间点以内，所有观测到的
α1A-AR的运动速率分布成单峰，峰值在 0.3 µm/s左
右；从 30min开始，α1A-AR的运动速率分布出现
了变化，快速率运动事件逐渐增多，峰值在 1µm/s
左右，运动速率分布曲线由单峰向双峰变化。同时
药物干预实验证明慢速运动主要依赖微丝蛋白进
行，快速运动主要依赖微管蛋白进行。利用短曝光
时间(25ms)对亮点的实时运动进行了追踪，首次发
现 PE刺激 20 min，活细胞内 α1A-AR的定向运动具
有步进式运动特点，步长平均值为 33 nm，与myo-
sin V和VI在细胞外试验的数据一致[18,19]，推测α1A-
AR由单个myosin运输或多个完全同步化的myosin
运输。同时，该研究以直观影像学证据证明在激动
剂 PE作用下，α1A-肾上腺素受体朝向细胞内与朝
向细胞膜的定向运动同时存在。随着 PE刺激时间
延长，双向运动事件趋于平衡，揭示了受体激动后
在细胞内的循环行为。
5　非配基依赖性G蛋白偶联受体激活的检测
与传统的配体、受体结合相比，对 G 蛋白偶
联受体是否可以在没有特异性配体存在和结合的情
况下被特异性激活研究较少。近年来大量实验证
明，受体在没有特异性配体存在的情况下，可以通
过其他方式被特异性激活。这种激活方式是否依赖
于受体的配体结合域尚不清楚。这类非配体依赖性
受体激活与传统的配体、受体相互作用相比，不能
用传统的方法如配体结合实验来研究。而近年来发
展起来的单分子研究方法，尤其适宜于对这种重要
的受体激活方式进行深入研究。
单线态氧分子是一种具有高化学反应势的氧分
子，可以通过多种方式产生：化学反应、酶促反
应和光动力学作用。它们主要与蛋白质中的 Trp、
His、Tyr、Cys、Met 等氨基酸发生反应，形成
过氧化物并改变其结构，也可以形成氨基酸残基交
联，如His-His和His-Lys[20]。An等[21]证明，光动
力作用所产生的单线态氧分子，通过特异性的直接
激活细胞表面的胆囊收缩素受体 1(CCK1)，引发持
续性的胰腺腺泡细胞胞浆钙振荡，并导致之后的淀
粉酶的分泌。研究发现，CCK1受体在不受刺激的
情况下，处于寡聚化状态，当细胞受到刺激后，寡
聚体解聚，成为单体[22]。实验中分别标记 Rluc和
GFP的CCK1受体，利用BRET技术来监测不同条件
刺激下CCK1受体的二聚化和解聚。同时An等[21]发
现，单线态氧分子不能激活 β2肾上腺素受体。单线
态氧分子对受体结构的修饰，在一定程度上可能抑
制了受体的寡聚化作用，从而引起了受体的活化。
利用时间分辨荧光显微镜和基于FRET的GPCR
构象变化检测技术，Chachisvilis等[23]研究了内皮细
胞缓激肽 B2受体在细胞外环境变化下的活性变化，
发现在剪切力、低渗透压和膜液化剂的作用下，B2
受体的构象会发生变化。研究者还在活细胞中实时
监测了剪切力影响下B2受体构象在活化和非活化状
态之间的转变，并且发现B2受体选择性拮抗剂可以
阻断剪切力引起的受体构象变化。这项实验是第一
次发现GPCR能介导由机械化学因素引起的信号转
导。
6　结语
单分子研究的优势在于单个活细胞中实时追踪
单分子的动态行为特征，虽然就G蛋白偶联受体激
活而言，对分子间的结合与解离，分子内和分子间
的构象变化以及分子的运动轨迹分析都已运用这方
面技术进行了研究，并得到了一些信息，取得了长
足的进步，但是，在时间分辨方面仍需要向微秒以
至纳秒或皮秒延伸，以便了解生物分子更加快速的
生物过程；在空间分辨方面除了向高灵敏和高分辨
的方向努力，还应该发展能在活细胞中进行定位检
测的手段。相信在不同学科的渗透合作下，这些问
题能逐步得到解决，G蛋白偶联受体激活的机制能
更为清晰的揭示出来，单分子技术也必将在生物医
学领域中得到更为广泛的应用。
[参　考　文　献]
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