全 文 ：第25卷 第5期
2013年5月
Vol. 25, No. 5
May., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)05-0443-03
小离子的大功能
施小山
(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海 200031)
收稿日期：2013-05-02
通信作者：E-mail: xsshi@sibcb.ac.cn
人体免疫系统是机体识别并抵抗“非自体物质”
影响的重要屏障，初步分为获得性免疫系统和天然
免疫系统 [1]。获得性免疫系统识别病原体所携带的
“外来抗原”从而引发特异性的免疫反应 [2]；天然
免疫系统识别病原体所携带的“外来模式”，从而
产生非特异性的免疫反应 [3]。T淋巴细胞 (简称 T
细胞 )是获得性免疫系统中重要的功能细胞，它表
达 T细胞抗原受体 (TCR)于细胞表面，从而负责识
别抗原，并指挥其他免疫细胞进行免疫应答 [4]。
TCR是由配体识别亚基 TCRαβ及信号亚基 CD3εγ、
εδ与 ζζ共同组成的一个四亚基复合物 [5]。TCRαβ
通过基因重排的方式形成庞大的 TCR受体库，从
而识别机体和环境中各式各样的抗原 [6]。而另一
方面，保守的信号亚基 (包括一条 CD3γ链、一条
CD3δ链、两条 CD3ε链及两条 ζ链 )则通过多个免
疫受体酪氨酸激活模体 (ITAM)来行使其传递信号
的功能 [5]。
迄今关于 TCR的胞内信号通路已经得到比较
广泛的研究，然而 TCR的跨膜信号转导过程由于
研究难度大，仍旧不甚清楚。经典的基于蛋白质 -
蛋白质相互作用的模型揭示了 TCR活化是被一个
多层面的复杂机制所调控的 [7]，然而却忽略了细胞
质膜环境对于这种跨膜蛋白的直接调控作用。2008
年，本课题组许琛琦研究员等人利用新颖的生物物
理学方法发现，富含碱性残基的信号亚基 CD3ε胞
内段在静息 T淋巴细胞内可以同细胞质膜内层的酸
性磷脂相互作用，进而使得 ITAM中的关键酪氨酸
残基侧链插入并被屏蔽在细胞膜的疏水核心，从而
编者按：脂质同蛋白质及核酸一样，是生命体必需的组
分之一, 由其组成的细胞质膜不仅保证着细胞的完整性,
同时也调控着许多生理过程。伴随着生命科学研究技术
的发展, 关于脂质调控蛋白质功能的工作越来越多地被
报道。作为脂质-蛋白质相互作用的主要体现形式, 二者
的静电相互作用(富含碱性残基的蛋白质与酸性磷脂之间
的静电相互作用)被发现广泛存在于膜蛋白受体、离子
通道、黏附分子及许多其他蛋白质同脂质的相互作用中,
它们控制着受体的活化、离子通道的开关、细胞的黏附
及其他生命过程。然而, 关于这种静电相互作用的解除
机制迄今却仍未被揭示。最近,中国科学院上海生命科学
研究院生物化学与细胞生物学研究所许琛琦课题组同合
肥强磁场中心王俊峰课题组针对T细胞抗原受体(TCR)的
研究发现:钙离子可以同细胞质膜内层的酸性磷脂相互作用，从而调控T细胞抗原受体的活化过程。在TCR
未识别抗原前,其酪氨酸信号模体(ITAM)与酸性磷脂结合从而插入到膜脂双层中, 处于被“屏蔽”的状态。
而在T细胞被抗原活化后, TCR周围的钙离子浓度迅速上升, 并通过静电相互作用与酸性磷脂结合, 从而打破
ITAM与脂质之间的静电相互作用, 帮助ITAM磷酸化, 并最终扩大TCR的激活信号, 提高T细胞对抗原的敏感
性。这一新颖的机制将为蛋白质-脂质相互作用的研究提供新的思路。
∙ 发现的历程 ∙
生命科学 第25卷444
防止其被 Lck自动磷酸化 [8]。
那么在 TCR同主要组织相容性抗原复合物
(pMHC)结合之后，是什么导致被细胞质膜内层酸
性磷脂保护的酪氨酸从质膜疏水核心暴露出来呢？
相关研究启动之初，本课题组面临着几种选择。从
CD3ε的角度来说，也许 pMHC的刺激会导致整个
TCR-CD3复合物结构发生改变，从而导致 CD3ε从
质膜内层解离。这一猜想的证实需要极为细致的结
构生物学技术，迄今仍是整个领域无法解决的问题。
从磷脂角度来说，pMHC的刺激可能会影响质膜内
层酸性磷脂环境的变化。由于磷脂的改变将具有广
泛的影响，因此这一猜想引起了本课题组更大的兴
趣。研究表明，T细胞甚至可以被一个 pMHC所激
活，从而促发下游信号并行使杀伤功能 [9-10]。而本
课题组猜想，磷脂水平变化所产生的广泛影响可能
为 T细胞提供一种放大信号的方法，从而帮助 T细
胞获得超高敏感性。由于酸性磷脂是通过静电相互
作用进而保护 CD3中的关键酪氨酸残基的，那么
以静电相互作用的方式来调控这一过程将会是一个
简单而有效的方式。通过分析 T细胞信号转导通路，
发现第二信使钙离子的内流也许可以成为打破这种
蛋白质 -脂质相互作用的关键事件。有趣的是，在
T细胞激活时，钙离子通道 CRAC将会同 T细胞受
体有很好的共定位 [11]。这将大大提高 TCR周围的
钙离子浓度，并使其同CD3竞争酸性磷脂成为可能。
为了验证钙离子同 CD3ε/ζ竞争酸性磷脂的能
力，首先在体外重构了蛋白质 -磷脂 -钙离子反应
体系，并进行了一系列的生物化学及生物物理学实
验，包括微平衡透析、荧光偏振实验、圆二色谱分析、
酪氨酸荧光发射光谱分析以及核磁共振分析。体外
重构系统可以把生物体内复杂的问题简单化，也使
得实验具有更大的可控性，而简单化的设计可以非
常明确地告诉我们猜想是否正确。结果发现，随着
钙离子浓度的提高，CD3ε/ζ胞内段同酸性磷脂的相
互作用将逐渐降低，其中包括微平衡透析实验所体
现的浓度差、荧光偏振差、二级结构中 α螺旋比例、
酪氨酸荧光发射强度的增强，以及核磁共振中体现
出来的化学位移变化及 NOE效应。这些实验共同
验证了本课题组假说的正确性。
下一步，需要把体外重构系统的结果在真实的
T淋巴细胞内进行验证。因此，利用 Ionomycin刺
激以及抗体交联 TCR的方法来诱导活细胞的钙离
子内流，以验证生理状态下钙离子是否依旧可以同
CD3ε竞争酸性磷脂。在活细胞内验证 CD3ε胞内
段同质膜之间的相互作用需要使用荧光共振能量转
移 (FRET)技术，这一技术的分辨率并不高。因此
本课题组使用了较强的刺激条件以引入较强的钙离
子内流。这样可以帮助整个细胞质膜上的 CD3ε胞
内段从质膜内层解离，从而利于观察。结果表明，
两种刺激引起的钙离子的内流均能降低 CD3ε胞内
段同质膜之间的 FRET效率。这暗示着在生理状态
下，钙离子确实可以破坏质膜对 CD3ε胞内段的保
护作用，促使 CD3ε胞内段从质膜上解离。
那么，这种解离是否可以帮助关键信号位点暴
露从而促进 TCR的激活呢？这个问题至关重要，
直接关系着整个课题的意义所在。为了回答这一问
题，首先模拟生理条件在体外重构了受体信号模体
(CD3ε胞内段 )、磷脂双分子层、钙离子及 Lck激
酶这一多元反应体系。结果表明，钙离子确实可以
直接通过结合酸性磷脂而有效地促使 CD3ε胞内段
被 Lck激酶磷酸化。该实验结果有利于让我们坚信，
我们的假说是正确的，至少在特定情况下是可以发
生的。它让我们不再徘徊于自我怀疑阶段，而是满
怀希望与信心地去进行更复杂的活细胞磷酸化实验。
在开始活细胞磷酸化实验之后，本课题组尝试
了各种普通的 T细胞刺激条件，然而结果却总是反
复多变。好在有前面的体外重构实验，使得我们不
至于失去信心。但是，为什么常用的 T细胞刺激条
件下，钙离子却不能促进 TCR磷酸化了，这个大
问题一直盘旋在我们的脑中。我们开始重新思考我
们的假说，突然意识到要扩大 TCR的磷酸化就必
须要让其有扩大的空间。于是接下来，利用低浓度
CD3抗体交联刺激来模拟 T细胞在生理上被微量抗
原活化的过程。终于惊喜地发现，在刺激体系中加
入钙离子能大大提高 CD3ε与 ζ被抗体刺激后的磷
酸化程度，并且该现象是十分稳定的。在这之后，
迅速进行了对照试验。首先，证明了钙离子对 TCR
活化的促进作用是由活化的 T细胞中胞内钙离子浓
度上升所介导的，因为钙离子螯合剂预处理或 T细
胞上钙离子通道缺失均会减弱钙离子的作用。其次，
利用过表达活化型激酶以及磷酸酶的药物抑制试验
证明，钙离子对 CD3的帮助作用与 Lck和 CD45
等磷酸酶的活性改变无关。最后，为了彻底排除钙
离子信号通路在钙离子对 CD3帮助作用中的贡献，
本课题组使用非生理的碱土金属锶离子代替钙离子
重复了 T细胞活化实验。锶离子能够像钙离子一样
通过钙离子通道 CRAC流入 T细胞 (尽管它流入的
速率会远弱于钙离子 )，但是它却不能激活钙离子
施小山：小离子的大功能第5期 445
介导的信号通路，例如 NFAT入核以及 IL-2的分泌
表达。 因此，锶离子是一个理想的对照物。令我们
欣喜的是，锶离子与钙离子一样能够引起 CD3胞
内段从膜上解离，并同时促进 CD3磷酸化。通过
上述实验，我们很好地证明了钙离子可以直接同细
胞质膜内侧的酸性磷脂相互作用，从而促进 CD3ε/ζ
胞内段从质膜内层解离，并最终扩大 TCR的活化
信号，而无需激活钙离子信号通路。
在这个工作中，本课题组发现了一种新颖的钙
离子对蛋白质 -磷脂静电相互作用的调控机制。这
一新机制揭示了 TCR活化过程中存在着一个正反
馈的过程：在静息状态下，TCR的活化位点通过
CD3-酸性磷脂静电作用被屏蔽在细胞膜中；微量
pMHC可以激活几个 TCR引起初始活化信号，导
致钙离子从胞外流入 T细胞内；TCR周围局部钙离
子浓度的提高可以打破 CD3与酸性磷脂的静电作
用，帮助未接触抗原刺激的 TCR分子的磷酸化，
从而将初始的 TCR活化信号放大 (图 1)。这种钙离
子介导的 TCR信号放大机制有助于解释 T淋巴细胞
对外来抗原的超高敏感性。当然，TCR的活化过程
仍旧还有许多谜团需要解决。除了科研上的收获，
我个人觉得从中得到的锻炼更为重要。它让我学会
如何设定目标，如何去制作计划，如何去思考并解
决问题，以及如何去坚持。这些锻炼不仅仅适用于
做科研，更加适用于应对人生中的各种问题，这也
是我觉得每个人都应该在读取学位时学会的东西。
致 谢：特别感谢许琛琦老师和王俊峰老师对本人的
悉心指导，以及共同作者毕允晨及杨魏的共同努力；
感谢实验室成员对本工作的默默奉献；感谢林安宁
老师、孙少聪老师、顾华老师、雷鸣老师、刘万里
老师和李党生老师的热烈讨论。
[参 考 文 献]
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图1　T细胞抗原受体活化机制模型
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