全 文 ：第24卷 第10期
2012年10月
Vol. 24, No. 10
Oct., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)10-1089-09
抗冻蛋白特征、作用机理与预测新进展
李文轲， 马春森*
(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)
摘　要：抗冻蛋白 (antifreeze proteins，AFPs)可以通过抑制冰晶生长保护生物体免受低温冻害，具有重要
的生物学意义和应用价值。现在在鱼类、节肢动物、植物及微生物中均发现有 AFPs的存在。基于对已有
研究文献和相关网络数据的系统调查统计，详细描述了 AFPs数据的类别特征，并对其作用机理的研究历
史和最新取得的突破性进展作了较为系统的阐述，并对 AFPs预测所取得的成果作了介绍，还对 AFPs研究
的现状和未来研究方向作了讨论和展望。
关键词：抗冻蛋白；抗冻机理；预测
中图分类号： Q51，Q71 文献标识码：A
Present properties, mechanism and prediction of antifreeze proteins
LI Wen-Ke, MA Chun-Sen*
(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection,
Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)
Abstract: Antifreeze proteins (AFPs) protect the organism from freezing injury by preventing the growth of ice
crystals. AFPs have great significance both in biology and application. So far, AFPs have been found in fishes,
terrestrial arthropods, plants and microorganisms. Based on a systemic literature investigation and statistic analysis
of AFPs data from the internet, we reviewed features of different types of AFPs, summarized the history and the
latest remarkable progress about the research of AFPs mechanism. In addition, we presented current progress on the
prediction of AFPs. At last, we prospected the future research direction of AFPs.
Key words: antifreeze proteins; antifreeze mechanism; prediction
收稿日期：2012-04-05； 修回日期：2012-06-04
基金项目：国家自然科学基金项目(31170393)；国家
公益性行业专项(201103024)
*通信作者：E-mail: ma_chunsen@cjac.org.cn, csma@
ippcaas.cn; Tel: 010-82105066
在严寒环境中，生物体通常会遭遇冰冻的威胁，
生物体体内产生的冰晶会损伤细胞，甚至导致细胞
破裂。抗冻蛋白 (antifreeze proteins，AFPs)是生物
体抵御冻害的重要生存策略之一，该蛋白可以通过
吸附至冰晶表面，抑制冰晶生长以及冰晶重结晶，
从而有效地控制冰晶对细胞的损伤。最早鉴定出的
AFPs来自南极硬骨鱼 [1]，发现其血浆中提取的一
种糖蛋白可使溶液冰点比熔点降低大约 1℃，即所
谓的热滞效应。随后的研究表明，热滞效应是由蛋
白质与冰晶的结合而引起的，这种效应有效增强了
生物体的抗冻能力。之后关于 AFPs的研究越来越
多，并在昆虫、植物、微生物等许多物种中也发现
了 AFPs的存在。
尽管各种 AFPs都有相似的功能和作用机理，
但数据统计显示，不同物种间 AFPs的序列和结构
均有较大差异，难以从中挖掘出显著的家族特征和
进行明确的归类。而且近年来 AFPs相关研究越来
越受到关注，其中作用机理、AFPs的鉴定预测作
为 AFPs领域的研究热点，在近期取得了突破性进
展，但目前尚未对这些工作进行系统总结。本文基
于对已有研究文献及相关网络数据的系统调查统
计，归纳了 AFPs家族的不同类型，并对各类 AFPs
的数据分布和代表性数据特征进行了重点描述。此
生命科学 第24卷1090
外，还详细阐述了 AFPs作用机理和鉴定预测在近
期取得的重要成果。最后，我们基于 AFPs的研究
现状和对 AFPs数据的理解， 对该领域已有成果、
可能面临的问题以及未来的研究方向进行较为系统
和深入的讨论与展望。
1　抗冻蛋白的类型及特征
通常所说的 AFPs，又叫热滞蛋白 (thermal hys-
teresis proteins)、冰结合蛋白 (ice binding proteins)
或冰晶组织蛋白 (ice structuring proteins)[2]，从目前
的研究情况来看，AFPs家族成员复杂，整体上类
别不显著，但根据 AFPs的研究习惯和数据特点，
我们仍可以大致按其生物类别分为鱼类 AFPs、节
肢动物 AFPs、植物 AFPs以及微生物 AFPs来进行
分别描述。
1.1　鱼类抗冻蛋白
鱼类 AFPs是研究得最早的一类 AFPs，目前，
已经鉴定和测序的鱼类 AFPs至少有 140多种，平
均热滞温度 0.7~1.5℃。根据序列及结构的特征，通
常可将鱼类 AFPs分为五类： AFP I、AFP II、AFP
III、AFP IV以及抗冻糖蛋白 (antifreeze glycopro-
tein，AFGP)。其中 AFP I又可以根据合成部位的不
同分为肝脏型 AFP和皮肤型 AFP。肝脏型 AFP在
肝脏合成，含有信号肽，合成后被分泌至胞外；而
皮肤型 AFP在表皮合成，不含信号肽，合成后保
留在胞内。通常多数 AFP都属于肝脏型 AFP，但
在冬季，比目鱼含有肝脏型和皮肤型两种 AFP[3]。
AFGP相对于前四种 AFPs来说存在糖基化修饰：
在 Thr的羟基上连接着双糖 β-D-半乳糖基 -(1→3)-
α-N-乙酰 -D-半乳糖胺。有时 AFGP的重复模体会
出现一些变异，但并不会对抗冻活性产生较大影响。
例如，有些鱼类重复模体的第一个 Ala会被 Pro代
替，而在鳕鱼中，重复模体的 Thr偶尔会突变为
Arg，此时该重复单元上的双糖缺失，但总体上不
会有太大影响 [4]。表 1总结了这五种鱼类 AFPs的
典型特征。
1.2　节肢动物抗冻蛋白
已经鉴定含 AFPs的节肢动物包括近 50种昆
虫以及少数其他动物，如蜘蛛、甲螨、蜈蚣等，而
已经提纯测序的节肢动物 AFPs，据笔者统计则涵
盖其中至少 15种昆虫的 113条数据，以及甲壳纲
的 2条数据 [9]。昆虫 AFPs的抗冻活性是目前所有
已知种类 AFPs中最好的，热滞温度可高达 3~9 ℃。
序列上，昆虫 AFPs多数存在重复模体，且一般富
含 Thr或者 Glu；结构上，多数为左手 /右手 β螺旋，
且含有二硫键。尽管如此，昆虫 AFPs仍种类复杂，
难以对其进行明确的分类。
目前研究最多的一类昆虫AFPs来自两种甲虫：
黄粉虫 (Tenebrio molitor)和赤翅甲 (Dendroides cana­
densis)[10-12]。它们具有相似的序列和结构特征，序
列上存在重复模体：- T-C-T-X3-S-X5-X6-C-X8-X9-
A-X11-，一般含七组重复，重复中的 Cys均构成二
硫键，其中第一组和第二组重复的四个 Cys交叉形
成二硫键，其他重复的 Cys均顺次形成二硫键；结
构上它们呈右手 β螺旋，每组重复的 12个氨基酸
构成一个螺旋。此外，重复中的 TCT模体均排列
在螺旋的一侧，构成一个平面，该平面被认为是冰
晶结合区域。在高浓度时，TmAFPs热滞温度可大
于 5.5 ℃。有些 TmAFPs存在 N-糖基化，但糖基化
并非抗冻活性必需。TmAFPs的基因拷贝数为 30~50。
表1　鱼类AFPs的典型特征
类型 AFP I AFP II AFP III AFP IV AFGP
相对分子质量(Mr) 3 300~4 500 11 000~24 000 6 500~14 000 12 300 2 600~33 000
序列特征 富含Ala 富含Ala和Cys 富含Glu 富含Glu 重复模体
(Ala-Ala-Thr)n
结构特征 右手α螺旋 球状2(α+β)，含 球状9β 含四个反平 左手螺旋
5个二硫键 行螺旋束
同源蛋白 - 动物C型凝集素 唾液酸合酶C端 某些膜载脂蛋白 胰蛋白酶原
基因拷贝数 皮肤型30~40 15 30~150 - -
肝脏型80~100
数据量 19 20 45 12 51
代表物种 右眼鲽、杜父鱼 大牛尾魚、胡瓜 江鳕、大洋鳕鱼、 长角杜父鱼 南极Notothenioids、北
鱼、大西洋鲱 狼鱼 极鳕鱼、南极鳕鱼
参考文献 [3, 5] [5, 6] [5, 7] [5, 8] [4, 5]
李文轲，等：抗冻蛋白特征、作用机理与预测新进展第10期 1091
另外，来自新疆沙漠地区两种甲虫：小胸鳖甲 (Mi­
crodera punctipennis dzungarica)[13-14] 和 光 滑 鳖 甲
(Anatolica polita)[15-16]的 AFPs具有与 TmAFPs相似
的特征。另一种研究较多的昆虫 AFPs是云杉食心
虫 (Choristoneura fumiferana)AFPs[17-20]。CfAFPs 也
包含 TXT模体，但没有明显的重复序列，所含 Cys
也构成二硫键，但连接模式为：C1-C2、C3-C4、
C5-C8、C6-C7，不同于 TmAFPs。CfAFPs属于左手
β螺旋，TXT模体也排列在螺旋的一侧构成平面，
并参与冰晶结合。CfAFPs热滞温度大约 5.4 ℃ /0.09
mmol/L，其基因拷贝数大约为 17，其表达存在发
育阶段特异性。此外，还有一些其他昆虫 AFPS，
如尺蠖 (Campaea perlata)、雪蚤 (Hypogastrura har­
veyi)[21]、松皮天牛 (Rhagium inquisitor)[22]等，雪蚤
AFPs富含 Glu，存在 -G-X-X-模体，松皮天牛 AFPs
富含 Thr，存在 -T-X-T-X-T-X-T-模体，对这些 AFPs
的研究还有待深入。
1.3　植物抗冻蛋白
已经鉴定的植物 AFPs涉及硅藻门、绿藻门、
裸子植物门及被子植物门等，已经纯化测序的植物
AFPs至少包含将近 30个物种的 100多条数据，其
中以被子植物门发现和研究的最多。相对来说，植
物 AFPs抑制冰晶生长的能力较低，平均热滞温度
0.1~0.5 ℃，但植物 AFPs通常含有多个亲水性冰晶
结合域，并具有较强的抑制冰晶重结晶活性。此外，
许多植物 AFPs除了抗冻活性之外，还具有参与其
他正常生理反应的双重功能，这些功能一般都与抗
病相关 (pathogenesis-related，PR)，主要类活性蛋
白包括 β1-3-葡聚糖酶、几丁质酶、类甜蛋白以及
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白等四种，这类抗冻蛋白
可以认为是类 PR型 AFPs，或者是具有抗冻活性的
PR蛋白。
目前发现含 PR-AFPs的植物主要包括冬黑麦
(Secale cereale)[23-24]、欧白英 (Solanum dulcamara)[25]
以及胡萝卜 (Daucus carota)[26]等，另外，在南极发
草 (Deschampsia antarctica)[27]和黑麦草 (Lolium pe­
renne)[28]中发现的 AFPs也具有类似的生化特征。
尽管 PR-AFPs与 PR蛋白存在同源关系，并且都有
抗病活性，但它们的调节和表达却截然不同。例如，
PR-AFPs能被低温诱导，但却不能被病原体诱导，
也就是说，病原体诱导的 PR蛋白是不具有抗冻活
性的，只有低温诱导的 PR蛋白才具有抗病和抗冻
双重功能。除了 PR-AFPs，还有一些其他类型的
AFPs，已经提交的数据涉及物种，如蓖麻 (Ricinus
communis，如 Uniprot：B9RS23)、沙冬青 (Ammopip­
tanthus nanus)[29]、高山离子芥 (Chorispora bungea­
na，如 Uniprot：Q7XBG0)、白松 (Pinus monticola)[30]、
甜杨 (Populus suaveolens，如 Uniprot：Q6UAH5)、雪
莲花 (Saussurea involucrata)，如 Uniprot：A0FH78)等。
另外，在硅藻门和绿藻门也发现了独特的植物
AFPs，如衣藻 (Chlamydomonas)AFPs[31]含有与昆虫
AFPs类似的 TXT模体，其中包括 6个高度保守的
TFT和 1个 TWT，但总体上衣藻 AFPs与昆虫 AFPs
或其他植物 AFPs并不同源，却与一种未知的温带
高盐湖微生物蛋白同源，由于数据较少，目前尚不
能对这些 AFPs做出进一步判断。表 2给出了植物
AFPs数据的部分典型代表及其主要特征。
1.4　微生物抗冻蛋白
微生物 AFPs包括真菌 AFPs和细菌 AFPs。已
提纯出 AFPs的真菌包含子囊菌门和担子菌门的至少
16个物种， 研究得较多的是雪腐病核瑚菌 (Typhula
ishikariensis)AFP[35]，该 AFP富含 Thr，体外重组后
表2　植物AFPs数据的典型代表
物种 相对分子 序列模体 主要结构特征 同源蛋白 冰晶生 参考
质量(Mr) 长方向 文献
胡萝卜(D.carota) 36 800 P*****L**L**L* β-折叠 多聚半乳糖醛酸 沿c轴 [26,
LS*N*L*G*I 酶抑制蛋白 32]
欧白英(S.dulcamara) 64 700 GE/GNKHV*****E* - WRKY蛋白 - [25]
沙冬青(A.nanus) 50 000 - 11%α, 34%β - 沿a轴 [33]
黑麦(S.cereale) 31 700 - - 几丁质酶 沿c轴 [23]
黑麦(S.cereale) 32 000 - - β-l,3-葡聚糖酶 沿c轴 [23]
黑麦(S.cereale) 25 000 - - 类甜蛋白 沿c轴 [23]
黑麦草(L.perenne) 29 500 N*V*G/N*V**G β-环 磺肽素受体激酶 沿c轴 [34]
南极发草(D.Antarctica) 29 200 L*L**N*LTG*IP*-*L β-环 磺肽素受体激酶 沿c轴 [27]
G*L**L**;SNNTVVSG
生命科学 第24卷1092
其热滞温度最高可达 1.9 ℃，而野生型的 Tis-AFP
最高热滞温度为 1.1 ℃。Tis-AFP具有热稳定性，适
宜 pH偏酸，最适 pH为 5.8。此外，Tis-AFP还存
在 N-糖基化和 O-糖基化，但糖基化均不是抗冻活
性必需。另外，还有一种子囊菌门物种 (Antarctomy­
ces psychrotrophicus)的 AFP[35]，富含 Asx和 Thr，最
高热滞活性为 0.42 ℃ /0.48 mmol/L，适宜 pH偏碱，
最适 pH为 9.3。该 AFP不具有热稳定性，30 ℃下
即失去抗冻活性。其结构上呈球状，存在分子内二
硫键。其他真菌 AFPs则研究得较少。
细菌 AFPs研究得也较少，但根据已有发现和
预测，至少可以得到 200多条候选数据。研究得比
较清楚的有来自莫拉氏菌属的一种含脂抗冻蛋白 [36]，
其最适温度和最适 pH分别为 5 ℃和 pH 7.0，在
1 000 μg/mL时热滞温度可达 0.19 ℃，具有热稳定
性，在 100 ℃下仍可保持 80%的抗冻活性，其 N
端序列与一种膜蛋白具有很高的相似性。还有一种
来自 Marinomonas primoryensis的 AFP[37]，其实测
结构为反平行 β螺旋，每个螺旋包含 19个残基：
XGTGNDXuXuGGXuXGXuX，其中 u代表疏水氨
基酸残基，在转角处的 6个残基是钙结合域，且此
处的 Thr-Gly-Asx模体是该 AFP的冰晶结合域。序
列分析发现，该 AFP与 RTX(the repeats-in-toxin)
家族同源。此外，在恶臭假单胞菌 (Pseudomonas
putida)中还发现了一种具有抗冻和冰核双重活性
的蛋白 [38]，其不含信号肽，但却可以通过特有方式
分泌至胞外。该蛋白中的糖组分是冰核活性所必需
的，但不是抗冻活性所必需；序列上，尚未找到明
显的同源蛋白。
以上是基于已有数据对 AFPs类型特征所做的
综述，而实际上自然界存在的 AFPs的种类和数量远
不止这些，如在原生动物和线虫动物中已有部分数
据被预测为 AFPs(如 Uniprot：F2UT92、A8NK60、
A8NZY0、A8P609、E5S108)，还有不少物种已被
证实存在 AFPs，但尚未得到纯化。从已有数据看，
对 AFPs的了解还远远不够，更多的 AFPs有待进
一步研究。
2　抗冻蛋白的作用机理
对 AFPs抗冻机理问题的提出，从最早在极地
鱼类血浆中首次发现 AFGP就已经开始，并且几十
年来一直是生物学中的热点和难点。为什么 AFPs
能降低冰点？ 热滞现象是如何产生的？这是 AFPs
抗冻机理最早需要回答的问题。基于对极地鱼类
AFPs研究而提出的“吸附 -抑制”模型为该问题提
供了重要的参考 [39]。“吸附 -抑制”模型认为 AFPs
会吸附到冰晶表面抑制冰晶的生长。根据开尔文方
程式，出现半径为 ρmin的冰晶导致冰点下降 ∆T为：
其中 Ω为冰晶摩尔体积，γ为各向同性表面能，
T0为纯水的转变温度，ρmin为冰晶半径，∆H0为溶
解潜热。从式中可以看出，∆T与界面能成正比，
与冰晶半径成反比。一旦冰晶形成，ρmin就趋于 ∞，
∆T就变为零。AFPs通过结合至冰晶表面，阻碍冰
晶对应位点的生长，从而导致产生一个小于正常冰
晶半径的曲率半径，因此，在生长面会产生冰点下
降 [39-40]。通过假定AFPs-冰晶结合不可逆，并将蛋白
质作为聚合物处理，该模型得到了进一步改进 [41-43]。
尽管如此，AFPs-冰晶的作用机理仍然不清楚。
我们知道冰晶有多个表面，而 AFPs又种类繁多，
那么不同 AFPs能否都结合到相同的冰晶表面？一
个 AFPs能否结合到多个冰晶表面？ AFPs是如何
吸附到冰晶表面的，它们之间结合的主导作用力是
什么？
Knight等 [44]发现，不同的 AFPs会结合到不
同的冰晶表面，如 AFGP7-8结合到棱柱曲面 {10-
10}，美洲拟鲽 (Pseudopleuronectes americanus)和
阿拉斯加拟鲽 (Pleuronectes quadritaberulatus) 的
AFP I结合到棱锥平面 {20-21}[45]，而短角杜父鱼
(Myoxocephalus scorpius)的 AFP I则结合到棱锥平
面 {2-10}[46]。多数 AFP共有的一个特点是，它们
很少会结合到冰晶的基面，但也有一些 AFPs能特
异性地同时结合到冰晶的棱面和基面。冰晶结合面
的不同会导致冰晶形态的改变，通常只结合冰晶棱
面的 AFPs会使冰晶沿 c轴生长，根据浓度的不同，
冰晶呈双锥型到针状不等；而能同时结合到棱面和
基面的 AFPs则能使冰晶沿 a轴生长，结果使冰晶呈
盘状。一般来说，能同时结合到棱面和基面的 AFPs
活性更高，这类 AFPs也被称为超活性 AFPs[47-48]。
涉及物种，如美洲拟鲽 (P.americanus)[49]、黄粉虫
(T.molitor)[50]、云杉食心虫 (C. fumiferana)[17-20]、衣
藻 (Chlamydomonas)[31]、雪蚤 (H. harveyi)[21, 51]、雪
腐病核瑚菌 (T. ishikariensis)[35]以及一种革兰氏阴性
菌 M. primoryensis[37]等。
AFPs-冰晶结合力的调节是弄清 AFPs抗冻机
制的关键，也是理解 AFPs结构与功能关系的重点。
李文轲，等：抗冻蛋白特征、作用机理与预测新进展第10期 1093
人们可以通过冰晶蚀刻等实验手段研究在 AFPs作
用下冰晶形态的改变，但却难以在实验水平上观测
AFPs结合冰晶表面的细节。例如，通常研究大分
子间相互作用的方法，如酶 -底物和蛋白质 -配体
分析等在这里都行不通，因为没有对应的抑制物、
竞争物等，也没有底物类似物；而用于 X-射线研
究的 AFPs活性复合物结晶，需要在水处于持续非
平衡的条件下（如过冷却状态）取得，这也是非常
困难的 [52]。因此，已有研究大都属于理论意义上的
探索。
早期研究认为氢键是 AFPs-冰晶结合的作用
力。Devries和 Lin[53]研究了 flounder的 AFP I，在
其提出的模型中，亲水性残基 Thr和 Asp在螺旋上
呈规律性间隔，其中 Thr羟基和 Asp羧基之间的距
离为 4.5 Å，这个距离与冰晶平面上氧原子的间距
正好匹配，两者之间会形成氢键，从而使 AFPs能
够结合到冰晶表面。氢键结合假说很容易被人们接
受，但同时也存在一些问题：氢键的数量和作用强
度似乎还不足以保证 AFPs-冰晶结合的可靠性，尤
其当人们认为 AFPs-冰晶的结合可能是一个不可逆
的过程时 [40]。Knight等 44]认为，Thr的羟基等产生
的氢键结合可能会占据冰晶晶格中的氧原子，这样
的话会生成额外的多重氢键结合，并有效地将 AFP
固定在晶格的顶层。这个模型在后来还得到了一系
列改进，以解释 AFP-冰晶的氢键结合 [54]。
尽管氢键结合假说很受欢迎，但研究发现，
AFP III并没有这样的氢键基团，相反，AFP III的
冰晶结合面含有疏水性残基 Ala[55]。这对氢键结合
假说提出了质疑，也提示疏水基团可能具有关键作
用。后来的突变研究发现，Thr→ Ala的突变降低
了 AFP I的热滞活性 [56]，而 Ala→ Thr的突变则降
低了 AFP III的热滞活性 [57]。这样的结果似乎难以
理解：不同的 AFP使用不同类型的残基，还是识
别过程很复杂，涉及到多种作用呢？可能的一个推
测是，单独用氢键基团或者非极性基团来驱动结合
会引发一个亲和性 -特异性问题 (affinity specificity
paradox)[52]。只用氢键基团，则能通过与水生成较
强的氢键结合，得到很好的亲和性，但是，相对来说，
这些基团不倾向与类冰晶的水结构结合，才导致与
冰晶之间的特异性低。相反，由于非极性基团倾向
于与类冰晶溶液结构结合，所以，只用非极性基团
能提供好的特异性，但是，疏水作用不能提供很好
的亲和性，所以这两种作用力有可能都参与了 AFPs-
冰晶结合。后来的分子动力学模拟研究发现 [58]，
AFPs上所谓的疏水性冰晶结合域可以将水分子按
照晶格的方式排列，排列后的水晶格会通过匹配特
定的冰晶表面促进 AFPs与冰晶的结合。尽管如此，
这些观点和发现仍属于理论范畴，更详细和可靠的
结论有待于在实验水平上对 AFPs-冰晶结合的特征
进行验证。幸运的是，虽然 AFPs活性复合物实验
研究困难重重，但 Garnham等 [37]在近期通过对南
极细菌 M. primoryensis的 AFP结构的测定和分析，
得到了 AFPs与冰晶相互作用的清晰的三维结晶图
片，从实验和分子水平上揭示了疏水作用和氢键在
AFPs结合冰晶过程中共同的重要作用，该模型被
称之为“包合物锚定”(anchored clathrate)模型。
包合物锚定模型认为，AFPs通过疏水作用使
水分子按晶格方式排列，并通过氢键锚定水分子晶
格。锚定的水分子晶格又通过匹配特定的冰晶表面
使 AFPs与冰晶结合。对鱼类 AFP III的磁共振研究
表明，AFPs只有在其冰晶结合域的外层有水分子
层包围的情况下才能与冰结合，这也进一步证实了
包合物锚定模型的正确性。更多的研究发现，水分
子晶格的生命周期很短，会在亚毫微秒的时间数量
级上与周围水分子进行流动性互换，这与抗冻活性
对浓度和退火时间的依赖性相吻合。通常只有部分
AFPs可以形成足够的正确的水分子晶格，当 AFPs
浓度或退火温度升高时，能与冰晶结合的 AFPs会
增多，所以热滞温度也会升高。
包合物锚定模型很好地总结了冰晶结合域水合
作用的主要特征。该结构通过附近极性基团的氢键
锚定在边缘。得到的水合结构的间隔能很好地结合
于棱面和基面。通过诱导生成比周围水分子更类似
冰晶的结构，AFP可能预先构成了结合位点。这也
揭示了另一个可能的结合机制：AFP结合到了其自
己的“冰晶”，这与结合到冰核十分相似，但非常
不同于之前所认为的减缓冰晶生长速度的观点 [52]。
3　抗冻蛋白的预测
鉴定新的 AFPs对更好地理解生物抗冻机理和
更加灵活地开展实际应用有着重大意义。然而，目
前已经发现的 AFPs种类繁多，序列和结构等在不
同的物种间有着巨大差异，很难从某一类或整体上
获得足够可靠的规律性特征。尽管如此，AFPs的
鉴定预测仍然非常引人注目，并且已经有了初步进
展。
Doxey等 [59]主要考虑了 AFPs上冰晶结合域的
物理化学特征，并通过确定极性和非极性原子的分
生命科学 第24卷1094
布以达到合理的疏水性，进而判断是否存在可能的
冰晶结合域。通过这种办法，他们鉴定了之前实验
得到的两个待测蛋白——LTP1和 LTP2，并发现，
LTP1含有冰晶结合域；而 LTP2则不含。后来通过
实验测定两者的抗冻活性，结果与预测完全吻合。
AFP-Pred[60]是另一种预测 AFPs的方法，其核
心是统计序列特征。AFP-Pred以 300条 AFPs数据
和 300条非 AFPs数据为训练集合，集合中的所有
序列彼此间相似度均小于 40%，然后统计所有序列
的 119个特征，如极性氨基酸残基出现频率、等电点、
热容量、侧链疏水性等等。以统计信息为参照，鉴
定训练集合中 AFPs的准确度高达 81.33%，而对训
练集合之外非同源（相似度小于 40%）的 181条
AFPs和 9 193条非 AFPs进行鉴定，准确率也高达
83.38%。
Yu 和 Lu[61]提出的 AFPs 预测算法主要基于
n- 肽组成 (n-peptide composition)和编码方案特征
(feature-based coding schemes)思想，并综合采用了
支持向量模型和遗传算法。其训练集合为 44条已
知三维结构的 AFPs数据和 3 762条非冗余（彼此
相似度小于 25%）的非 AFPs数据，之后，通过算
法鉴定出了全部的 44条 AFPs，虽然多引入了 26
条假阳性数据，但总体表现优于 Andrew的算法。
另外，用其他数据进行测试，该算法正确鉴定了
Andrew中采用的两条数据，以及两条类 AFP的假
阳性数据，从 UniprotKB数据库中得到的一批
AFPs数据有 57%被鉴定为 AFP，其中鱼类 AFPs
的鉴定准确率大约为 70%。
AFP_PSSM[62]也采用了支持向量模型来预测
AFPs，但不同的是，AFP_PSSM首次将进化信息
作为表征抗冻蛋白序列的重要特征引入位置特异性
打分矩阵，从而进一步改善了信息丰度。AFP_
PSSM采用了与 AFP-Pred相同的训练数据集和测试
数据集，结果显示，AFP_PSSM对训练数据集和测
试数据集的预测准确度分别为 82.67%和 93.01%，
预测效果要好于 AFP-Pred。
4　讨论与展望
AFPs是生物学中比较典型的功能性蛋白，其
复杂的家族特征以及作用机理给生物学提出了一系
列非常引人注目又具有挑战性的问题。AFPs虽然
种类繁多，从单一 α螺旋到 β折叠，以及混合了无
规则卷曲的球状结构，结构差异明显，但它们在不
同生物体的生命活动中扮演着惊人相似的角色，这
在生物学中是一个有趣的现象。从进化的角度看，
它们有多种不同的起源，从不同功能的祖先基因最
终演化得到能编码同一功能、不同结构蛋白的新基
因，这为系统发育学的一些研究提供了极好的案例。
AFPs通常被定义为能够抑制冰晶生长，从而
产生热滞效应的抗冻蛋白，但同时 AFPs也具有抑
制冰晶重结晶的效果 [63]，而且 AFPs所表现出的抑
制冰晶生长和重结晶效应之间并不成正比关系。平
均来说，昆虫类 AFPs热滞活性最高 (3~10 ℃ )，其
次是鱼类 AFPs(0.7~1.5 ℃ )，而植物类 AFPs最低
(0.2~0.5 ℃ )。热滞活性的不同可能与生物体演化过
程中长期所处的生存环境有关，鱼类所处的水环境
温度变化较小，所以，微小的热滞就能满足生命活
动需要；昆虫和植物则直接与空气接触，不仅温差
大，而且低温更低，需要更强的抗冻能力；昆虫
AFPs具有较高的热滞活性，而植物 AFPs虽然热滞
活性不高，但具有很强的抑制冰晶重结晶能力，所
以，也能保证存活。昆虫与植物 AFPs抗冻方式不
同可能的原因，是由于昆虫属于动物，活动较植物
更频繁，所以，需要严格控制冰晶的产生才能满足
所需的生命活动；而植物处于相对静态，活动能力
较低，允许产生一定量的冰晶（即对热滞活性要求
不是太高），但也必须保证冰晶控制在一定范围内
（即要求较强的抑制重结晶能力）。可以说，植物
AFPs抗冻的主要方式，甚至更倾向于抑制冰晶重
结晶，而不是抑制单个冰晶生长 [64]。
对抗冻机理的研究目前已经取得了令人振奋的
成果，但仍有许多问题有待解决。例如，Garnham
等 [37]对 M. primoryensis AFP的研究表明，其能同
时结合到冰晶的棱面和基面，导致冰晶主要沿 a轴
生长，对该 AFP作用机理的研究是否适用其他类
型？ AFPs分子间相互作用以及其他小分子，如柠
檬酸、琥珀酸、甘油、山梨醇等对 AFPs抗冻活性
有显著的增强效应 [65]，但其作用机制如何？分子动
力学模拟为 AFPs抗冻机理的研究提供了很大的方
便，但对超活性 AFP的模拟研究还比较欠缺 [58]。
另外，对 AFPs，特别是植物类 AFPs抑制重结晶的
作用机制也有待进一步探索。
AFPs的预测是目前研究的另一个难点，其意
义与 AFPs鉴定及抗冻机理研究是统一的。传统鉴
定 AFPs的手段是通过实验测定其热滞效应，但目
前已经鉴定出的 AFPs数量相对有限，用计算机预
测为更多的 AFPs研究提供了便利。不仅如此，对
AFPs预测算法和结果的改进和应用也反应了对
李文轲，等：抗冻蛋白特征、作用机理与预测新进展第10期 1095
AFPs特征及抗冻机理研究的深入程度。因为 AFPs
家族非常复杂，即使同一物种所含 AFPs也可能不
止一种，而且不同类型 AFPs间序列和结构差异显
著，用传统序列比对方法预测 AFPs的可靠性很低，
即便是同类 AFPs，具有高相似度也并不意味着具
有抗冻活性，最极端的情况之一来自对冬黑麦中具
有几丁质酶活性的 AFP的研究 [66]，该研究发现正
常的几丁质酶与冷诱导的几丁质酶氨基酸序列完全
一致，但只有冷诱导的几丁质酶具有抗冻活性。后
续研究发现这是由于两者形成了不同的寡聚物，不
具有抗冻活性的几丁质酶所形成的寡聚物不能结合
Ca2+，而该类 AFP在缺失 Ca2+时，会因错误折叠或
寡聚物部分解体而失去活性。这也从侧面反映了
AFPs家族结构与功能的复杂性。所以，通过对
AFPs家族不同类别 AFPs的序列及结构等特征的挖
掘和分析，对我们深入理解 AFPs结构与功能的关
系以及行为机制都十分有益。目前 AFPs预测的研
究工作还比较少，而且已有的算法大都是基于一些
经验和偏表象的统计特征开发的，尽管也取得了不
错的效果，但原则上尚未达到预测期望的效果，这
有待于对数据进行更加广泛和深入的结构与功能分
析以及对 AFPs抗冻本质的规律性挖掘。
AFPs不仅对生物体有着至关重要的生理作用，
而且在食品工业、生物材料的保存、医药领域、抗
寒性相关转基因工程等方面有着巨大的应用价值。
相信，随着更多 AFPs的鉴定分析以及相关研究的
不断深入，AFPs会越来越被人们所理解，并会为
人类带来更多的福利。
[参　考　文　献]
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